تفسير دامنه‌های مرجع در خون‌شناسی (3)
دكتر حبیب‌الله گل‌افشان عضو هيئت علمي دانشگاه علوم پزشكي شيراز
نگين شكرگزار كارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون دانشگاه علوم پزشكي شيراز
آزمایش شکنندگی اسمزی (OFT)
آزمایش شکنندگی اسمزی، لیز شدن گلبول‌های قرمز در محلول‌های هایپوتونیک سرم فیزیولوژی را ارزیابی می‌کند. گلبول‌های اسفروسیت در محلول‌های هایپوتونیک نزدیک به ایزوتونیک مانند نمک 8 گرم در هزار یا 7 گرم در هزار لیز می‌شوند، درحالی‌که گلبول‌های طبیعی در محلول نمک‌های هایپوتونیک نزدیک 5 گرم در هزار تا 0/45گرم در هزار شروع به لیز شدن می‌کنند. شکنندگی زیاد گلبول‌های قرمز در اسفروسیتوز ارثی، کم‌خونی اتوایمیون همولیتیک، پیروپویکیلوسیتوز، استوماتوسیتوز و الیپتوسیتوز همولیتیک مشاهده می‌شود و با آزمایش کومبز مستقیم می‌توان کم‌خونی اتوایمیون را از اسفروسیتوز ارثی جدا کرد. گاهی در اسفروسیتوز ارثی آزمایش OFT ممکن است نرمال شود و این به دلیل لیز شدن گلبول‌های فوق‌العاده فشرده در طحال است. در این موارد می‌توان آزمایش شکنندگی را با انکوباسیون انجام داد که در این حالت خون بیمار در شرایط استریل به مدت 24 ساعت در 37 درجه انکوبه شده و سپس آزمایش OFT انجام می‌شود. لوله کنترل به‌موازات لوله تست مورد آزمایش قرار می‌گیرد.
گراف نارنجی مربوط به بیمار مبتلا به اسفروسیتوز ارثی است. توجه داشته باشید با وجودی که خون تازه بیمار افزایش شکنندگی را نشان نداده است ولی بعد از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه افزایش شکنندگی اسمزی کاملاً مشهود است (2A) گراف آبی رنگ شکنندگی اسمزی خون تازه و انکوبه شده را نشان می‌دهد.
برای انجام تست OFT یک سری لوله (حدود 10 تا 12) که هرکدام حاوی 5 سی‌سی محلول سریال هایپوتونیک سرم فیزیولوژی از 9 در هزار، 8 در هزار، 7 در هزار، 6 در هزار و… و آب مقطر است تهیه کرده و به هر لوله یک قطره از خون هپارینه بیمار اضافه شده و پس از 30 دقیقه انکوباسیون در حرارت اتاق سانترفیوژ شده و می‌توان با استفاده از لوله آب مقطر به‌عنوان شاهد و لوله‌ای که 100% همولیز دارد (گلبول قرمز در آب مقطر) گراف شکنندگی را رسم کرد که محور x غلظت‌های محلول هایپوتونیک و محور y درصد همولیز را نــــــــــشان می‌دهد. با رسم گراف می‌توان پارامتـــــر MCF (mean corpuscular fragility) را حساب کرد. این پارامتر غلظت نمکی که در آن 50% گلبول‌ها لیز شده‌اند را نشان می‌دهد.
در شکل فوق گراف C مربوط به اسفروسیتوز، گراف B مربوط به فرد نرمال و گراف A مربوط به فردی با هتروزیگوت تالاسمی می‌باشد. در پایین گراف مقادیر میانگین شکنندگی (MCF) خون تازه و خون انکوبه شده نشان داده شده است.
توجه داشته باشید که مرفولوژی‌های اسفروسیت با توجه به جهش‌های اسپکترین متفاوت است؛ برای مثال جهش‌های باند 3، گلبول‌های قرمز را به‌صورت قارچی شکل (pincered cell) درمی‌آورد که یک واریانت از اسفروسیت است یا جهش‌های آنکرین که به گلبول قیافه اسفرواکینوسیت می‌دهند. توجه داشته باشید که بعد از برداشتن طحال، گلبول‌های اسفروسیت به‌صورت اسفیرواکانتوسیت یا اسفیرواکینوسیت درمی‌آیند. چنانچه بیمار مبتلا به اسفروسیتوز، مبتلا به سنگ کیسه صفرا و یرقان انسدادی گردد، به علت انباشت چربی روی غشای گلبول ممکن است گلبول اسفروسیت به مرفولوژی طبیعی برگردد و آزمایش OFT نرمال گردد. شایان توجه است که انباشت لیپید روی سطح گلبول‌های قرمز نرمال آن‌ها را به‌صورت تارگت سل درمی‌آورد. آزمایش فلوسیتومتری برای باند 3 با استفاده از رنگ EMA نیز می‌تواند گونه‌هایی از اسفروسیتوز ارثی را تشخیص دهد. آزمایش الکتروفورز غشا برای ارزیابی پروتئین‌های غشا نیز در تشخیص اسفروسیتوز ارثی فوق‌العاده کمک‌کننده است.
در تهیه محلول‌های هایپوتونیک بایستی دقت کرد زیرا محلول‌های اسیدی موجب افزایش شکنندگی گردیده و افزایش حرارت محیط، همولیز نمونه و یا تغییر غلظت نمکی با ضدانعقادها در آزمایش دخالت دارند.
الکتروفورز غشای گلبول قرمز برای تشخیص انواع کم‌خونی‌های همولیتیک در رابطه با غشا
شمارش توتال گلبول‌های سفید و شمارش افتراقی
شمارش گلبول‌های سفید و طبقه‌بندی افتراقی آن‌ها با روش‌های متفاوتی از قبیل ایمپدانس روزنه‌ای، فلوسیتومتری و بکارگیری سیتوشیمی از قبیل آنزیم پراکسیداز انجام می‌گیرد. این آنالیزورها با توجه به روش مورد استفاده، پارامترهای مختلفی نیز برای بیمار گزارش می‌کنند مانند پارامتر MPXI (میانگین خاصیت پراکسیداز)، LI (اندکس لوبولاریتی)، LUC (سلول‌های بزرگ رنگ نگرفته) و …
میانگین خاصیت پراکسیداز در ائوزینوفیلی، لوسمی M3 و میل به چپ با گرانولاسیون توکسیک افزایش می‌یابد و سلول‌های بلاست و لنفوسیت‌های اتیپیک در گروه LUC قرار می‌گیرند. جدول زیر محدوده 95 درصد طبیعی شمارش گلبول‌های سفید و درصد آن‌ها و شمارش مطلق را از بدو تولد تا بزرگسالی نشان می‌دهد.
محدوده 95 درصد طبیعی شمارش گلبول‌های سفید و شمارش افتراقی از بدو تولد تا دوران جوانی
شمارش گلبول‌های سفید تحت تأثیر پارامترهای مختلفی از قبیل ورزش، تپش قلب، هیجان، ترس و گریه کردن با صدای بلند قرار می‌گیرد. در موارد فوق افزایش گلبول‌های سفید و نوتروفیل رخ داده که پس از نیم تا یک ساعت استراحت به مقدار پایه برمی‌گردد. شمارش گلبول‌های سفید در عصر بیشتر از صبح و شمارش ائوزینوفیل دارای تغییرات روزانه است که با شمارش پایین در صبح و شمارش حتی 2 برابری در غروب با توجه به سطح کورتیزول بدن همراه است. گاهی نوزادان نارس دارای ائوزینوفیلی هستند که با رشد و افزایش وزن نوزاد به مقدار طبیعی برمی‌گردد.
شمارش گلبول‌های سفید همراه با میل به چپ (مشاهده سری نارس گرانولوسیتی) همیشه به مفهوم عفونت نیست بلکه می‌تواند ناشی از استرس، ورزش شدید، حاملگی و تزریق G-CSF باشد. شایان توجه است که تزریق G-CSF می‌تواند نمای خون محیطی را به‌صورت لوسمی، سندرم مایلوپرولیفراتیو، سندرم مایلودیس‌پلاستیک و عفونت با گرانولاسیون توکسیک تقلید کند. افزایش لنفوسیت‌ها ممکن است گویای عفونت ویروسی باشد و لنفوسیتوز همراه با اسماج سل فراوان در افراد بزرگسال نشانه‌ای از لوسمی مزمن لنفوسیتیک است که با مارکر CD5 و CD23 تأیید می‌گردد، درحالی‌که نمای شبیه CLL در بچه‌ها به علت لنفوسیتوز عفونی و سیاه‌سرفه است.
افزایش مونوسیت‌ها در عفونت‌هایی از قبیل سل و عفونت دریچه قلب مشاهده می‌گردد و چنانچه برای تداوم مونوسیتوز (بیشتر از 800 در میلیمتر مکعب) علت واضحی یافت نشود، بایستی بیمار را از نظر سندرم‌های مایلودیس‌پلاستیک یا تومورهای بافت توپر (solid) مورد ارزیابی قرار داد.
محدوده 95% طبیعی شمارش گلبول‌های سفید در طیف 10800- 4400 در میلیمتر مکعب و شمارش مطلق نوتروفیلی >1500 در میلیمتر مکعب است. چنانچه شخصی به‌صورت تکرارپذیر دارای شمارش گلبول سفید 4000- 3000 باشد ممکن است جزء 5% افراد نرمالی باشد که خارج از طیف هستند.
پلاکت‌های ژیانت، هایپرلیپیدمی نمونه خون، گلبول‌های قرمز هسته‌دار، گلبول‌های قرمز لیز نشده به‌ویژه در نوزادان، کرایوگلوبولین، پاراپروتئین‌ها، تجمع پلاکتی، تارگت سل در بیماری کبد به علت انباشت غشا از چربی، آلودگی گلبول‌های قرمز به انگل مالاریا، همگی با افزایش کاذب شمارش گلبول‌های سفید همراهند. پلاکت‌های ژیانت و گلبول‌های قرمز لیز نشده در آنالیزورها به‌صورت لنفوسیت شمرده می‌گردند. با شمارش لنفوسیت‌های B، T و NK می‌توان بیماری‌های کمبود ایمنی، بیماران مبتلا به HIV و یا درمان با سرکوبگرهای ایمنی را تشخیص داده و پیگیری کرد. جدول زیر، محدوده 95% طبیعی انواع لنفوسیت‌های خون را از بدو تولد تا بزرگسالی نشان می‌دهد.
شمارش لنفوسیت و زیرگروه‌های لنفوسیتی به‌صورت مطلق(A) و درصد آن‌ها در محدوده‌ی
95 درصد طبیعی تا سه سالگی
شمارش لنفوسیت و زیرگروه‌های لنفوسیتی به‌صورت مطلق (A) و درصد آن‌ها در محدوده‌ی
95 درصد طبیعی تا 18 سالگی
پارامترهای رتیکولوسیت، شمارش رتیکولوسیت، فراکسیون رتیکولوسیت نارس و معادل محتوای هموگلوبین رتیکولوسیت (CHR)
شمارش رتیکولوسیت به‌ویژه محاسبه RPI (اندکس تولید رتیکولوسیت) که بیانگر فعالیت مغز استخوان نسبت به شرایط نرمال است، در تشخیص نوع کم‌خونی بسیار سودمند است. چنانچه در بیمار کم‌خون میزان RPI کمتر از 2 باشد بیانگر عدم پاسخ مناسب مغز استخوان نسبت به کم‌خونی است که در این حالت کم‌خونی در گروه هایپوپرولیفراتیو قرار می‌گیرد مانند آنمی فقر آهن، مگالوبلاستیک و اپلاستیک؛ درحالی‌که افزایش RPI بیشتر از 2 بیانگر پاسخ کافی است و احتمال همولیز را مطرح می‌کند.
در بیمار مبتلا به آنمی چنانچه مقدار RPI کمتر از 2 باشد بیانگر پاسخ ناکافی مغز استخوان به کم‌خونی است و بیشتر از 2 احتمال کم‌خونی همولیتیک را مطرح می‌سازد.
شمارش رتیکولوسیت با روش‌های دستی و فلوسیتومتری با رنگ‌های فلورسانس انجام می‌گیرد. در بیمار مبتلا به فقر آهن، با آهن درمانی شمارش رتیکولوسیت در 5 تا 10 روز از درمان به اوج می‌رسد. شمارش رتیکولوسیت برای بازیافت فعالیت مغز استخوان متعاقب شیمی‌درمانی بکار می‌رود. فراکسیون رتیکولوسیت نارس به درصد رتیکولوسیت‌هایی اشاره می‌کند که حاوی RNA به‌صورت متراکم بوده و در پاسخ به کم‌خونی‌های شدید و بازیافت فعالیت مغزاستخوان بعد از پیوند در خون محیطی افزایش می‌یابد و نشانه‌ای بر موفقیت پیوند است.
پارامتر CHR برای تشخیص اولیه کم‌خونی فقر آهن به کار می‌رود و اندازه‌گیری Ret-He یا CHR با روش‌های فلوسیتومتری قابل انجام است. کاهش CHR در نارسایی کلیه بیانگر همراهی با فقر آهن است. جدول زیر، محدوده 95% طبیعی شمارش رتیکولوسیت، CHR و درصد رتیکولوسیت‌های نارس را نشان می‌دهد.
شمارش مطلق و درصد رتیکولوسیت‌ها از بدو تولد تا بزرگسالی
گفتنی است که برای محاسبه RPI از فرمول زیر استفاده می‌شود:
هماتوکریت طبیعی × زمان بلوغ /شمارش رتیکولوسیت بیمار × هماتوکریت بیمار=RPI
زمان بلوغ برای رتیکولوسیت‌ها با هماتوکریت 45% برابر یک روز است و به ازای هر 10% کاهش هماتوکریت، نیم روز به زمان بلوغ اضافه می‌شود. برای هماتوکریت بالای 45% زمان بلوغ همان یک روز به کار می‌رود و نیازی به محاسبه RPI نمی‌باشد و همان شمارش رتیکولوسیت کفایت می‌کند؛ برای مثال میزان RPI برای بیماری با Hct=25% و رتیکولوسیت 10% برابر است با:
RPI = 10 × 25 / 45 × 2 = 2.8
بدین مفهوم که مغز استخوان 8/2 برابر بیشتر از حالت طبیعی فعالیت دارد. شایان توجه است که به شرط کافی بودن منابع آهن و ویتامین، میزان RPI می‌تواند 6 تا 8 برابر حالت عادی افزایش یابد.
رتیکولوسیت‌ها با رنگ‌های حیاتی رنگ‌آمیزی می‌شوند. این رنگ‌آمیزی علاوه بر رتیکولوسیت، سایر انکلوزیون‌ها مانند هاینزبادی، هاول‌ژولی بادی، هموگلوبین اچ، بازوفیلیک استیپلینگ و اجسام پاپن‌هایمر را نیز رنگ‌آمیزی می‌کند.
رتیکولوسیت‌ها با توده‌های زیاد RNA بیانگر رتیکولوسیت های تحت استرس بوده و محاسبه RPI با مشاهده‌ی این‌گونه رتیکولوسیت‌ها سفارش مؤکد می‌گردد زیرا بیشتر از یک روز جهت بلوغ آن‌ها در خون محیطی لازم است
محدوده‌ی طبیعی پارامترهای Ret-He و CHr و فراکسیون رتیکولوسیت‌های نارس در جداول فوق مشاهده می‌گردد. پارامترهای Ret-He و CHr محتوای هموگلوبین رتیکولوسیت‌هاست که کاهش آن‌ها بیانگر اولین علامت کم‌خونی فقر آهن می‌باشد
تشخیص آزمایشگاهی کم‌خونی‌ها بر اساس MCV و RPI
مدیریت مقادیر بحرانی و اهمیت تهیه گستره محیطی در آزمایشگاه خون‌شناسی (2)
کنترل کیفی در آزمایشگاه خون‌شناسی
مدیریت مقادیر بحرانی و اهمیت تهیه گستره محیطی در آزمایشگاه خون‌شناسی (1)
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام