میکرواری

کاربردهای میکرواری (قسمت دوم)

کاربردهای میکرواری (قسمت دوم)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

دکتر مهدی فصیحی رامندی (استادیار دانشگاه)

زهرا کریمی (مرکز تحقیقات زیست سلول پژوهان گستر)

 

از مهم‌ترین کاربردهای این فناوری، تجزیه بیان هزاران ژن در شرایط فیزیولوژیکی و محیطی متفاوت است. کاربرد دیگر این روش، مطالعه چندشکلی است که در آن نواحی چند شکل ژنوم پیمایش می‌شوند تا همبستگی آن‌ها با صفت خاص (مثل بیماری) پیدا شود. بدین ترتیب می‌توان ژن‌های عامل مستعد کننده ابتلا به بیماری را شناسایی کرد. از این فناوری همچنین برای تعیین و بررسی تنوع ژنتیکی نیز استفاده شده است.

ریزآرایه‌ها معمولاً از قرار دادن نقاط DNA بر روی یک صفحه جامد مانند یک سطح شیشه‌ای ایجاد می‌شوند. برخلاف روش‌های مرسوم مبتنی بر فیلترها یا غشاهای نایلونی که در آن DNA هدف بر روی فیلتر یا غشاء قرار گرفته و سپس با کاوشگر دورگه می‌شود، در سیستم ریزآرایه کاوشگر بر روی یک صفحه جامد قرار می‌گیرد و سپس با DNA هدف دورگه می‌شود. استفاده از سطوح شیشه‌ای صاف برای قرار دادن DNA امکانات زیر را فراهم می‌سازد:

  1. قرار دادن مولکول‌ها به‌طور موازی در کنار هم
  2. کوچک کردن اندازه کل فرایند
  3. استفاده از رنگ‌های فلورسانس برای شناسایی
  4. امکان استفاده از اسکنرهای لیزری به دلیل این‌که موادی که بر روی سطح قرار می‌گیرند به داخل نفوذ نکنند.

با توجه به مطالب فوق هدف در ریزآرایه‌ها می‌تواند اولیگوها (در فتولیتوگرافی) یا cDNA (در روش شبکه‌سازی مکانیکی) باشد.

پس از ایجاد اسلایدها، عمل دورگه‌سازی بین کاوشگر و هدف صورت می‌گیرد. شرایط واکنش در دورگه‌سازی در دو روش کاملاً متفاوت است و آماده‌سازی نمونه‌ها نیز باید به‌طور خاص برای آن‌ها صورت گیرد. نوع اسلاید که برای قرارگیری هدف استفاده می‌شود، مواردی که روی آن‌ها را می‌پوشاند، سیستم برچسب‌زنی نمونه‌ها و نشان‌دار سازی آن‌ها با فلورسانس متفاوت بوده و باید برای هر سیستمی بهینه شود.

پس از انجام دورگه‌سازی، عمل شناسایی و سپس تجزیه‌وتحلیل داده‌ها انجام می‌شود. در این مرحله حساس از فرایند، مولکول‌های کاوشگر که با مولکول‌های هدف پیوند شده‌اند، باید شناسایی و به‌صورت کمّی ارزیابی شوند. برای شناسایی نقاط، اسلایدها معمولاً توسط اسکنرهای دو کاناله که بتواند در ۵۴۳ و ۶۳۳ نانومتر کار کرده و به ترتیب CY5 و CY3 را برانگیخته کنند، اسکن می‌شوند. اسلایدها ابتدا بر روی CY5 و سپس CY3 اسکن می‌شوند؛ زیرا CY5 به شکستگی در مقابل نور حساس‌تر است. داده‌های حاصل از این اسکن‌ها به‌طور جداگانه ضبط می‌شوند و سپس ترکیب آن‌ها برای محاسبه میزان نسبی بیان هر ژن و بیان ژن‌هایی که به‌طور متفاوت بیان می‌گردند، مورداستفاده قرار می‌گیرد.

برای مقایسه داده‌های حاصل از آرایه‌های مستقل در آزمایشگاه‌های متفاوت، نیاز به استانداردسازی است. آرایه‌هایی که حاوی هدف‌های ۵۰-۲۵ نوکلئوتیدی هستند، یا به‌وسیله سطح بیان ژن‌های خاص (مثل اکتین که بیان آن با شرایط محیطی تغییر نمی‌کند) و یا با استفاده از شدت بیان کل در تمام نقاط اسلاید استاندارد می‌شوند. آرایه‌هایی که محصول PCR هستند نیز نیاز به استانداردسازی دارند، اما روش مورداستفاده کاملاً متفاوت و پیچیده است. به‌طورکلی روش استانداردسازی به‌کاربرده شده، منعکس‌کننده هدفی است که بر اساس آن آرایه ایجاد شده است. برای مثال برای بررسی بیان ژن‌ها در سلول‌های سرطانی سینه، ترکیبی از رده‌های سرطانی می‌تواند استاندارد خوبی باشد. به نظر می‌رسد که روشی کاملاً مناسب برای استانداردسازی در موارد مختلف وجود ندارد و در نتیجه مقایسه داده‌های حاصل از آزمایشگاه‌های مختلف مشکل است و باید از فناوری‌های دیگر مانند Real time PCR برای تائید داده‌ها استفاده کرد. استفاده از روش‌های مختلف طبقه‌بندی برای تجزیه داده‌ها کاملاً متداول است و برای مطالعه بیشتر آن‌ها می‌توان به منابع مختلف در زمینه تجزیه داده‌های ریزآرایه‌ها مراجعه کرد.

آنالیز ژنوتیپی

تغییر در ردیف DNA دربرگیرنده بیشترین تفاوت‌های موجود در داخل و بین گونه‌ها است. مکان‌یابی و شناسایی این تفاوت‌های ژنوتیپی، نخستین مرحله در ایجاد ارتباط بین تفاوت ژنتیکی و فنوتیپی است. طراحی آرایه‌ها برای این منظور آسان است. با در نظر گرفتن یک ردیف مرجع در یک ناحیه، چهار ردیف هدف طراحی می‌شوند که انواع احتمالات موجود در یک نوکلئوتید را در بر می‌گیرند. یکی از ردیف‌ها کاملاً مکمل ردیف مرجع است و سه ردیف دیگر در تمام نوکلئوتیدها به‌جز یکی شبیه به ردیف مرجع هستند. پس از دورگه‌سازی با ردیف مرجع کاوشگر مکمل با ردیف مرجع بیشترین شدت فلورسانس را خواهد داشت. در صورت حضور نمونه‌ای حاوی یک جایگزین در ناحیه موردنظر، کاوشگری که حاوی آن باز جانشین شده باشد، بیشترین شدت فلورسانس را خواهد داشت؛ بنابراین چهار هزار دسته چهارتایی از ردیف‌ها برای یافتن تغییرات تک نوکلئوتیدی در هزار باز موردنیاز است. این راهکار به‌خوبی می‌تواند تغییرات کوچک اتفاق افتاده در ردیف مرجع و حتی مکان و نوع جانشینی صورت گرفته را شناسایی کند. البته درصورتی‌که چندشکلی به علت تغییرات طول و حذف یا اضافه شدن قطعه بزرگ باشد، این روش مناسب نیست. کاربرد این روش برای شناسایی چندشکلی‌های تک نوکلئوتیدی نیز به‌خوبی تعریف شده است. تراشه‌های SNP هم‌اکنون به‌صورت تجاری در دسترس‌اند. این آرایه‌ها را همچنین می‌توان برای یافتن SNPهای جدید مورداستفاده قرار داد. این راهکارها می‌توانند خیلی راحت‌تر برای ژنوم های کوچک به کار برده شوند.

تکنیک‌های مینیاتوری شده، به‌شدت در بیوتکنولوژی در حال گسترش می‌باشند. تراشه‌های زیستی مانند DNA Chips کاربردهای نوین و فراوانی در بیوتکنولوژی پیدا کرده‌اند. در یکی از این کاربردها، دانشمندان توانسته‌اند با استفاده از رشته‌های DNA به تولید تراشه‌هایی دست بزنند که سرعت پردازش اطلاعات در آن‌ها در مقایسه با حجم کوچک آن‌ها بسیار بیش از تراشه‌های معمولی می‌باشد. از کاربردهای دیگر و اصلی تراشه‌های زیستی در مورد DNA Chips و DNA Microarray می‌باشد.

امروزه تکنیک‌های دورگه‌سازی بین کاوشگر و توالی هدف (ساترن، نورترن، دات بلات و دات بلات معکوس)، به کمک فناوری نانو در حجم وسیعی تحت عنوان ریزآرایه قابل انجام است.

در این تکنیک که در دانشگاه استنفورد ابداع شده است، از یک سطح شیشه‌ای یا سلیکونی به مساحت cm2 6/1 که به مربع‌های بسیار زیادی تقسیم شده است، استفاده می‌شود. در سطح هر کدام از این مربع‌ها، کاوشگری وجود دارد که می‌تواند به بخشی از DNA ژنومی و یا cDNA متصل شود. طول کاوشگرها ۵۰۰۰-۵۰۰ باز می‌باشد. هر کدام از این تراشه‌های DNA به‌صورت یک دات بلات معکوس عمل می‌کنند، اما در اینجا تراکم کاوشگرها طوری است که هزاران قطعه و مولکول مختلف DNA به‌طور هم‌زمان بررسی شده و حتی می‌تواند به‌صورت کمّی اندازه‌گیری شوند. اندازه‌گیری کمّی نمونه‌ها در این روش به‌شدت پیغام دریافت شده توسط سیستم آشکارکننده بستگی دارد. این سیستم آشکارکننده شامل یک رایانه می‌باشد که میکروسکوپ Confocal را کنترل می‌نماید.

این تکنیک در کشف ژن‌ها و جهش‌ها، در تشخیص بیماری‌ها، در علم فارماکوژنومیک و توکسیکوژنومیک و … مورداستفاده قرار می‌گیرد؛ اما دو کاربرد اصلی این تراشه‌های DNA، مطالعه ترانسکریپتوم[۱] و شناسایی جهش ژنتیکی می‌باشد.

مطالعه بیان ژن

تکنیک ریزآرایه، هنگامی‌که برای مطالعه بیان ژن به کار می‌رود معادل نورترن بلات معکوس می‌باشد. با استفاده از این تکنیک می‌توان مطالعات کیفی و کمّی روی بیان ژن در یک بافت خاص و در زمان مشخص انجام داد. بدین منظور ریزتراشه به نقاط بسیار زیادی تقسیم شده است که فاصله بین نقطه‌ها ۴۰۰ میکرون می‌باشد. در هر کدام از این نقاط مقدار زیادی کاوشگر اختصاصی یک ژن وجود دارد که cDNA و یا کاوشگر سنتتیک می‌باشد. این تراشه‌ها با کتابخانه cDNA توسط تکنیک RT-PCR که بر روی mRNA بافتی انجام شده است، مخلوط شده و دورگه می‌شوند. البته شایان‌ذکر است که این کتابخانه cDNA با مواد فلورسنته نشان‌دار شده است (شکل ۱).

کاربردهای میکرواری (قسمت دوم)

شکل ۱- mRNA از بافت یا سلول کشت داده‌شده جدا می‌شود. با استفاده از نوکلئوتید فلورسنته (F)، cDNA نشان‌دار ساخته می‌شود. سپس mRNA حذف‌شده و cDNA با تراشه‌های حاوی آرایه‌هایی از اولیگونوکلئوتید و یا cDNA مخلوط و دورگه می‌گردد.

تراکم ریزتراشه طوری است که ۲۶۰۰۰۰ اولیگونوکلئوتید که برای مطالعه ۶۰۰۰ ژن مخمر به کار می‌رود، بر روی سطحی به مساحت  cm21/28 قرار دارند. همچنین ۸۰۰۰ ژن سازنده ژنوم گیاه  Arabidopsis thaliana  به‌راحتی بر روی یک تراشه قابل‌بررسی است. بر روی همین یک تراشه، میزان بیان ژن‌های این گیاه در ساقه، ریشه، برگ و اندام‌های گل‌زایی بررسی‌شده و ترانسکریپتوم گیاه به‌طور کامل تعیین می‌شود.

در انسان، از این تکنیک برای مقایسه سطح بیان ژن در سلول‌های سالم با سلول‌های سرطانی استفاده می‌شود. همچنین برای ارزیابی اثرات داروهای ضد سرطانی نیز می‌توان از این تکنیک بهره جست.

 

شناسایی جهش در ژن‌ها

تکنیک‌های اولیه مورداستفاده در تشخیص جهش‌ها، اختصاصی یک جهش بودند، اما شناسایی جهش‌های متعدد موجود در یک ژن، با استفاده از تکنیک‌های اولیه نیازمند صرف هزینه و وقت زیادی است، لذا به یک پروتکل و روشی نیاز بود تا چندین جهش موجود در یک ژن به‌طور هم‌زمان مورد ارزیابی قرار گیرند.

تکنیک‌های اولیه (مثل ASO[2], ARMS[3], OLA[4]) در بهترین شرایط قادر به شناسایی ۳۰-۱۰ جهش در یک ژن می‌باشند. درحالی‌که کارایی تراشه‌ها قابل‌مقایسه با این تکنیک‌ها نمی‌باشد. ریزتراشه‌ها قادر هستند تا کل ژنوم را اسکن کرده و تمام جهش‌های موجود در ژن‌ها، پروموتر‌ها و توالی‌های خاتمه را شناسایی کنند.

کاوشگرهای اولیگونوکلئوتیدی مورداستفاده در ریزآرایه، فقط برای جهش‌های شناخته‌شده (نه همه جهش‌های ممکن) طراحی و ساخته شده‌اند. بنابراین برای غربال‌گری ناقلین بیماری‌های مغلوب و تشخیص قبل از تولد اولین حاملگی کاربرد دارد.

 

[۱] Transcriptome

[۲] Allele-specific oligonucleotid

[۳] Amplification refractory mutation system

[۴] Oligonucleotide ligation assay

فناوری ریزآرایه DNA

انواع روش‌های شناسایی جهش‌ها

تکنیک Invader

تکنیک‌های شناسایی جهش‌ها

پیروسکوئنسینگ

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • آنالیز ژنوتیپی
  • دكتر رضا ميرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی
  • میکرواری

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *