تکنیک‌های مولکولی بر پایه لیگاز

تکنیک‌های مولکولی بر پایه لیگاز

تکنیک‌های مولکولی بر پایه لیگاز 

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا… (عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

 

تکنیک‌های لیگازی موجب اتصال دو اولیگونوکلئوتید ۲۰-۱۵ بازی به یکدیگر می‌شود، در این تکنیک‌ها دو کاوشگر (پرایمر) به مولکول هدف، شامل محصول PCR و یا DNA ژنومی متصل شده و توسط آنزیم DNA لیگاز به هم جوش می‌خورند. اتصال دو کاوشگر به مولکول هدف در محل جوش[۱]، شرط اصلی این واکنش لیگازی است، به‌طوری که حتی اگر یک باز در این محل آزاد باشد، این واکنش رخ نخواهد داد؛ به عبارت دیگر برای انجام واکنش، دو کاوشگر باید کاملاً در کنار هم قرار بگیرند.

از این تکنیک برای شناسایی و تشخیص نوکلئوتید جهش‌یافته در محل جوش و همچنین به‌منظور مطالعه و شناسایی حذف و اضافه‌ها استفاده می‌گردد. برای تعیین ژنوتیپ DNA به روش لیگاز، مجموعه‌ای از کاوشگرهای اولیگونوکلئوتیدی ساخته می‌شود. کاوشگرها طوری طراحی می‌شوند که در محل جایگزینی باز و یا محل جهش در کنار هم قرار گیرند؛ به عنوان مثال برای تعیین ژنوتیپ یک جایگزینی دو آللی، دو کاوشگر اختصاصی آلل (که در نوکلئوتید انتهای ‘۳ با هم متفاوت باشند) و یک کاوشگر عمومی طراحی می‌شود. این کاوشگر عمومی مکمل قطعه‌ای از DNA هدف است که دقیقاً در کنار نوکلئوتید جهش‌یافته قرار می‌گیرد. علاوه بر این سه نوع کاوشگر، DNA لیگاز و DNA هدف نیز باید به واکنش اضافه شوند. اگر هنگام هیبریداسیون، اتصال کامل بین بازها رخ دهد، آنزیم لیگاز، دو قطعه کاوشگر را به هم متصل می‌کند. اگر یک باز متصل‌نشده وجود داشته باشد، واکنش صورت نمی‌پذیرد. نتیجه واکنش با الکتروفورز محصولات بر روی ژل مشاهده می‌شود. روش دیگر برای قرائت نتیجه واکنش به‌صورت زیر امکان‌پذیر است؛ در این سیستم انتهای کاوشگر را با ماده‌ای نشان‌دار ساخته و با روش ELISA و یا تکنیک‌های فلورسنت نتیجه را بررسی می‌کنند. در این بخش به دو تکنیک تعیین ژنوتیپ DNA اشاره می‌شود که توسط آن‌ها می‌توان جهش‌های شناخته‌شده را تعیین و مطالعه نمود. تکنیک اول روش اتصال اولیگونوکلئوتید[۲](OLA) نام داشته و بر پایه رنگ‌سنجی است و تکنیک بعدی واکنش زنجیره‌ای لیگاز[۳](LCR) نام داشته و تکثیر و تعیین ژنوتیپ DNA را امکان‌پذیر می‌نماید.

 

طبقه‌بندی لیگازها

DNA لیگازها از موجودات مختلفی جدا شده‌اند. بر اساس نوع کوفاکتور موردنیاز، این آنزیم‌ها به دو دستۀ عمده تقسیم می‌شوند؛ لیگازهای جداشده از یوباکترها (باکتری‌های حقیقی) به +NAD به عنوان کوفاکتور نیاز دارند. درحالی‌که لیگازهای حاصل از یوکاریوت‌ها، آرکی‌باکترها و ویروس‌ها از ATP به عنوان کوفاکتور استفاده می‌کنند. در سال‌های اخیر اساس مولکولی شناسایی سوبسترا توسط آنزیم لیگاز مشخص شده است. ساختار کریستالی آنزیم DNA لیگاز T7 حاوی ATP، شباهت زیادی با ساختار آنزیم سازنده کلاهک mRNA در ویروس کلورلا[۴] دارد. این امر احتمال تشابه مکانیسم فعالیت این دو آنزیم را قوت می‌بخشد. این اطلاعات به عنوان پایه‌ای برای مطالعۀ دقیق‌ و جزئی‌تر فعالیت و نقش بخش‌های مختلف مولکول آنزیم تلقی می‌شود.

 

مکانیسم اتصال و جوش دادن DNA

واکنش جوش دادن DNA به چهار مرحله تقسیم می‌شود که برای همه لیگازهای شناخته‌شده یکسان است؛ ابتدا آنزیم به‌طور کووالانت به AMP متصل شده و در اصطلاح شارژ می‌شود. این AMP را از NAD یا ATP گرفته و مولکول NMN و یا پیروفسفات آزاد می‌شود. مولکول AMP به گروه آمین اسیدآمینۀ لیزین در موتیف حفاظت‌شده KXDG آنزیم لیگاز متصل می‌گردد. آنزیم آدنیله به محل‌های شکاف در DNA دو‌رشته‌ای متصل شده و مولکول AMP را به انتهای ‘۵ فسفریله شکاف منتقل می‌کند. در مرحلۀ آخر آنزیم، تشکیل پیوند فسفودی‌استر بین انتهای ‘۵ شارژ شده و انتهای ‘OH3 را کاتالیز کرده و AMP آزاد می‌شود.

 

تکنیک اتصال اولیگونوکلئوتید (OLA)

توانایی آنزیم DNA لیگاز در اتصال اسید نوکلئیک، توسط بازهای ناجور موجود در سوبستراها، به‌شدت تحت تأثیر قرار می‌گیرد. این خاصیت موجب بوجود آمدن تکنیک‌هایی شده است که در آن‌ها، توانایی اتصال و جوش خوردن اولیگونوکلئوتید، ژنوتیپ نمونۀ مورد آزمایش را تعیین می‌کند. مهم‌ترین مزیت این تکنیک تعیین دقیق و قابل اعتماد آلل‌ها و تشخیص SNPها توسط آنزیم لیگاز می‌باشد. این واکنش تحت شرایط استاندارد و با استفاده از دو کاوشگر صورت می‌پذیرد. استفاده از دو کاوشگر اختصاصیت واکنش را بالا می‌برد. همچنین این روش نیازی به PCR ندارد.

در این تکنیک از دو کاوشگر استفاده می‌شود که این دو کاوشگر، طی آزمایش به‌صورت کووالانت به یکدیگر متصل شده و می‌توان نتیجۀ آزمایش را پیگیری نمود. یکی از این کاوشگرها حاوی بیوتین می‌باشد که از آن برای اتصال و نگه داشتن محصول جوش‌خورده استفاده می‌شود. کاوشگر بعدی نیز دارای فعالیت قابل تشخیص می‌باشد. این ترکیب کاوشگرها، برای تشخیص‌های بر پایۀ فاز جامد مناسب هستند. نتیجه آزمایش با چندین روش قابل بررسی است؛ به عنوان مثال می‌توان از تفاوت طول قطعات کاوشگر پس از واکنش لیگاز استفاده کرد. روش متداول برای بررسی نتیجۀ واکنش لیگاز، استفاده از رنگ فلورسنت می‌باشد. با استفاده از تکنیک فلورسانس، می‌توان چندین واکنش را به‌طور همزمان مورد ارزیابی قرار داد. همچنین می‌توان به یکی از کاوشگرها توالی‌های اختصاصی و بی‌نظیری به عنوان برچسب[۵] اضافه نمود و پس از اتمام واکنش، با استفاده از هیبریداسیون و ریزآرایه[۶] محصول واکنش جوش‌خورده را جدا و شناسایی نمود. در حالت فوق غیر از ریزآرایه، می‌توان از ذرات[۷] نشان‌دار شده با فلورسانس حاوی توالی مکمل توالی برچسب استفاده نمود. روش دیگر بررسی نتیجۀ واکنش، اندازه‌گیری FRET بین دو کاوشگر متفاوت می‌باشد. در این سیستم می‌توان با استفاده از آنتی‌دیگوکسیژنین و پلیت ۹۶ خانه‌ای تست ELISA طراحی و نتیجه واکنش را با آن مشاهده کرد. در نتیجه، علاوه بر سرعت و حساسیت، سهولت نیز به مزایای این تکنیک اضافه شده و نتایج توسط رایانه قرائت و تفسیر می‌شود. جهش‌های نقطه‌ای جایگزینی، حذف و اضافه‌های دو آللی و همچنین سیستم‌های چند آللی از قبیل HLA را می‌توان با این تکنیک تعیین ژنوتیپ نمود.

 

اصول طراحی تکنیک

بیشترین آنزیم‌هایی که در تکنیک‌های بر پایۀ جوش و اتصال به کار گرفته می‌شوند آنزیم‌های DNA لیگاز T4 و DNA لیگاز Tth می‌باشند. لیگاز T4 از باکتریوفاژ T4 بدست آمده و وابسته به ATP می‌باشد. در صورتی که لیگاز Tth را از یوباکتر ترموس ترموفیلوس[۸] جدا می‌کنند و به +NAD به عنوان کوفاکتور نیازمند است. چند نکتۀ مهم در راه‌اندازی تکنیک‌های بر پایۀ لیگاز وجود دارد که باید موردتوجه قرار گیرد؛ هیبرید کاوشگر و DNA هدف باید آن قدر بزرگ باشند که آنزیم لیگاز بتواند بر روی آن‌ها قرار گیرد. آنزیم لیگاز T7 که شباهت زیادی با لیگاز T4 دارد، برای اتصال به ۹-۷ نوکلئوتید از سمت ‘۵ فسفات و ۵-۳ نوکلئوتید از سمت ‘OH3 نیاز دارد. مطالعات نشان داده است که آنزیم لیگاز Tth به دورگه‌های شش نوکلئوتیدی و کمتر از آن متصل نمی‌شود، اما لیگاز T4 به اولیگونوکلئوتیدهای شش نوکلئوتیدی نیز متصل می‌گردد. در کل اگر حدود ۲۰ یا بیشتر از ۲۰ نوکلئوتید در دو طرف شکاف باشد، این DNA دورگه، سوبسترای مناسبی برای آنزیم لیگاز محسوب می‌شود. واکنش اتصال و جوش در دمایی صورت می‌گیرد که همه اولیگونوکلئوتیدها به‌طور پایدار به توالی‌های مکمل خود متصل شوند. آنزیم T4 و Tth بازهای ناجور انتهای ‘۳ را بیشتر از بازهای ناجور در انتهای ‘۵ شناسایی کرده و افتراق می‌دهند، در نتیجه اگر باز ناجور در انتهای ‘۳ شکاف قرار داشته باشد، میزان اتصال و جوش خوردن دو کاوشگر پایین خواهد آمد. لیگاز Tth بازهای ناجوری که چند نوکلئوتید از شکاف فاصله دارند را نیز شناسایی کرده و افتراق می‌دهد.

از تکنیک OLA برای تشخیص واریانت‌های RNA نیز می‌توان بهره جست. البته شرایط بهینۀ این آزمایش کاملاً متفاوت از شرایط حاکم بر آزمایش بر روی DNA می‌باشد.

 

بهینه‌سازی شرایط آزمایش

به‌منظور به حداقل رساندن اتصال بازهای ناجور، باید از کمترین مقدار آنزیم لیگاز موردنیاز برای اتصال سوبسترای کاملاً متصل استفاده نمود. لیگاز T4 و Tth در نوع کوفاکتور، میزان دما و pH با همدیگر متفاوت هستند. لیگاز T4 در دمای ۳۷ سلسیوس فعال است درحالی‌که بهترین دمــا برای فعالیـــــت لیگاز Tth دمای ۷۲-۶۵ درجه سلسیوس می‌باشد. هر دو آنزیم به کاتیون‌های دو ظرفیتی نیاز دارند. عموماً هر دو نوع آنزیم وابسته به +NAD و ATP از +Mg2 استفاده می‌کنند. کاتیون‌های یک ظرفیتی نیز بر روی واکنش تأثیر می‌گذارند. افزودن NaCl تا غلظت mM200، موجب حداقل دو برابر شدن قدرت افتراق بازهای ناجور توسط لیگاز T4 می‌شود. افزودن کوفاکتور بیش از مقدار Km، ممکن است کمک کند تا اتصال سوبستراهای حاوی باز ناجور به حداقل برسد. غلظت بالای کوفاکتور، مهار آنزیم لیگاز را موجب می‌شود، زیرا ATP زودتر از موعد مقرر بر روی آنزیم قرار می‌گیرد درحالی‌که آنزیم لیگاز به بلوغ مدنظر نرسیده است. در این حالت آنزیم پس از آدنیلاسیون انتهای ‘۵ از سوبسترا جدا می‌شود، در نتیجه آنزیم آدنیله به‌سختی می‌تواند انتهای ‘۵ آدنیله را جوش دهد. Km لیگاز T4 برای ATP معادل µM14 و Km لیگاز Tth برای کوفاکتور +NAD برابر با nM18/5 می‌باشد. در واکنش‌های اتصال و جوش حدود mM1 کوفاکتور اضافه می‌کنند. دو روش برای انجام این تکنیک وجود دارد؛ در یکی از این روش‌ها از فلورسانس و در دیگری از آنزیم برای بررسی نتیجه استفاده می‌شود.

در این تکنیک یکی از کاوشگرها دارای فعالیت قابل تشخیص بوده و کاوشگر دیگر به‌طور کوالان به سطح جامد متصل می‌شود، در نتیجه می‌توان نتیجۀ آزمایش را بررسی نمود. واکنش‌های انجام‌شده با کاوشگرهای حاوی آنزیم را می‌توان با سیستم ELISA plate readers آنالیز نمود. همچنین در مورد فلورسانس، از سه کاوشگر استفاده می‌شود. دو تا از کاوشگرها اختصاصی آلل می‌باشند. این دو کاوشگر هرکدام با یک رنگ فلوروفور متفاوت نشان‌دار شده‌اند. کاوشگر سوم نیز یک کاوشگر عمومی و مشترک[۹] برای لوکوس مدنظر می‌باشد (شکل ۱). در نتیجه طی یک واکنش، واریانت‌های مختلف مشخص شده و دقت آزمایش بالا می‌رود.

محصول واکنش لیگاز به یک سطح جامد متصل می‌شود تا بتوان آن را شستشو داد. چندین نوع سطح جامد حاوی استرپتوآویدین بدین منظور به وجود آمده است.

لیگاز

شکل ۱: تکنیک OLA توانایی تشخیص واریانت‌های مختلف محصول PCR را داراست. در این تکنیک از سه کاوشگر و آنزیم لیگاز برای شناسایی SNP استفاده می‌شود. در تصویر بالا اولیگونوکلئوتید شماره سه برای هر دو واریانت استفاده می‌گردد (اولیگونوکلئوتید مشترک). این اولیگونوکلئوتید دارای قدرت اتصال به یک سطح جامد می‌باشد. اولیگونوکلئوتیدهای شماره ۱ و ۲ هرکدام با یک رنگ فلورسنت متفاوت نشان‌دار شده و اختصاصی واریانت‌های مختلف توالی مورد بررسی می‌باشند. البته اگر هرکدام از این دو اولیگونوکلئوتیدها به‌طور جداگانه و در دو واکنش مجزا استفاده شوند می‌توان از یک نوع رنگ فلورسانس استفاده کرد.

 

مواد موردنیاز:

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز:

  1. دستگاه ترموسایکلر برای پلیت میکروتیتر
  2. بافر X1:

 

۵۰ mM Tris-HCl, pH 8.3

۵۰ mM KCl

۱۲٫۵µg/mL BSA

۱٫۵ mM MgCl2

۲۰۰ µM dNTP

Double-distilled water

*برای بهینه‌سازی واکنش، غلظت MgCl2 را می‌توان در هر مرحله به میزان mM0/5 تغییر داد.

  1. اولیگونوکلئوتید پرایمر
  2. Taq پلیمراز

 

واکنش اتصال و جوش اولیگونوکلئوتید:

  1. محلول اتصال و جوش X2:

۱۸ mM Tris-acetate, pH 7.5

۲۰ mM magnesium acetate

۱۰۰ mM potassium acetate

۴۰۰ mM NaCl

۲ mM ATP

۰٫۴ µM of T4 DNA ligase

Double-distilled water

۲: سه نوع اولیگونوکلئوتید نشان‌دار به مقدار fmol600

در مورد اولیگونوکلئوتیدهای فلورسنته، یکی از آن‌ها بیوتینه و دو اولیگونوکلئوتید اختصاصی آلل دیگر، به‌طور جداگانه با شلات‌های[۱۰] یوروپیوم[۱۱] و یا تربیوم[۱۲] نشان‌دار می‌شوند.

در سیستم‌های تشخیص بر پایۀ ELISA احتیاج به یک کاوشگر بیوتینه و دو کاوشگر اختصاصی آلل که با دیگوکسیژنین نشان‌دار شده‌اند، می‌باشد.

 

اتصال محصول واکنش لیگاز به سطح جامد:

  1. شیکر پلیت
  2. پلیت‌های کوت شده با استرپتواویدین که به‌صورت زیر آماده می‌شود:

lµ۶۰ از استرپتواویدین µl100  بر ml در بافر فسفات[۱۳](PBS) را درون چاهک‌های پلیت ریخته و به مدت ۲ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس قرار دهید. چاهک‌ها را به مدت حداقل نیم ساعت در دمای اتاق با well /µl200  بر بافر بلوکان بلوکه کنید.

بافر بلوکان را به‌صورت زیر تهیه نمایید:

۰٫۵% fat-free dry milk

۱۰۰ µg/mL denatured salmon sperm DNA

۰٫۰۲% (w/v) NaN3 in solution B

پلیت‌های حاوی بافر بلوکان را می‌توان در دمای ْ ۴ سلسیوس نگهداری کرد.

۳: محلول A:

۱ M NaCl

۱۰۰ mM Tris-HCl, pH 7.5

۰٫۱% Triton X-100

۴: محلول B:

۱۵۰ mM NaCl

۱۰۰ mM Tris-HCl, pH 7.5

۰٫۱% Triton X-100

۵: محلول دناچوره کننده:

۰٫۱ M NaOH

۱ M NaCl

۰٫۱% Triton X-100

شناسایی محصول اتصال در سیستم فلورسنت:

  1. دستگاه فلورومتر که توانایی خواندن پلیت را دارد.
  2. شیکر پلیت
  3. محلول تقویت فلورسنت یوروپیوم یا ساماریوم[۱۴]:

۰٫۱ M acetatphthalate, pH 3.2

۱۵ mM 2-naphtoyl trifluoroacetone

۵۰ mM tri-N-octylphosphine oxide

۰٫۱% Triton X-100

۴: محلول تقویت تربیوم

۱۰۰ mM 4-(2,4,6-trimethoxyphenyl)-pyridine-2,6-dicarboxylic acid

۱% cetyl trimethyl ammonium bromide in 1.1 M NaHCO3

۵: دو برچسب لانتانید برای حذف یون‌های یوروپیوم و تربیوم. این برچسب‌ها به اندازه‌گیری حساس و دقیق مقدار کمی از محلول واکنش (در حد µl0/1) که حاوی دو رنگ فلورسانس می‌باشد، کمک می‌کنند.

از فلورفور ساماریوم به‌جای تربیوم می‌توان استفاده کرد. فلورسانس حاصل از یون ساماریوم را می‌توان با استفاده از محلول تقویت یوروپیوم تعیین و ثبت کرد، اما فلورسانس حاصل از ساماریوم ۱۰ برابر حساسیت کمتری نسبت به یون یوروپیوم دارد.

 

شناسایی محصول اتصال با استفاده از سیستم ELISA:

  1. دستگاه خوانش پلیت ELISA[15]
  2. آنتی‌بادی ضد دیگوکسیژنین که با آنزیم آلکالین فسفاتاز کونژوگه شده است. این آنزیم به نسبت ۱:۱۰۰۰ در محلول B که قبلاً عنوان شد، رقیق می‌شود.
  3. سوبسترای تازۀ آنزیم آلکالین فسفاتاز: یک قرص ۵ میلی‌گرمی پارا نیتروفنیل فسفات را در محلول زیر با ۹/۵ pH حل کنید:

۱۰۰ mM diethanolamin

۰٫۵ mM MgCl2

روش کار:

ابتدا قطعۀ موردنظر از DNA ژنومی با PCR تکثیر شده، سپس واکنش لیگاز صورت می‌پذیرد.

  1. به هر چاهک پلیت میکروتیتر µl5 از نمونه DNA با غلظت ng/µl 2 در بافر PCR 1X اضافه کنید.
  2. µl5 آنزیم Taq پلی‌مراز (U/µl0/1) و µM2 از هر پرایمر را به چاهک اضافه کنید.
  3. دستگاه ترموسایکلر را برای ۳۰ سیکل با برنامۀ ̊۹۴، ̊۵۵ و̊ ۷۲ هرکدام برای ۳۰ ثانیه، تنظیم نمایید.

 

واکنش اتصال و جوش اولیگونوکلئوتید

بعد از تکثیر، محصول واکنش در دستگاه ترموسایکلر دناچوره می‌شود. در همین حال، محلول لیگاز حاوی سه کاوشگر و آنزیم لیگاز را درون چاهک‌های پلیت میکروتیتر جدید اضافه می‌شود (این پلیت‌ها یا با استرپتواویدین پوشیده شده‌اند یا اینکه از ذرات مغناطیسی استفاده می‌شود). هنگامی که دمای محصولات PCR به̊  ۳۷ رسید، این محصولات به درون چاهک‌های پلیت جدید افزوده می‌شوند. در سیستم‌های بر پایۀ ELISA، آلل‌های مختلف در دو چاهک مجزا شناسایی می‌شوند، اما در سیستم فلورسانس، هر دو آلل در یک چاهک شناسایی می‌گردند (شکل ۲).

  1. در سیستم ELISA، محصول PCR را با µl60 آب مقطر رقیق کرده و در دمای ̊ ۹۶ به مدت ۵ دقیقه حرارت دهید تا دناچوره شوند. در سیستم فلورسانس روش کار از مرحلۀ ۲ شروع می‌شود.
  2. محصول PCR را در دمای ̊ ۹۶ را به مدت ۵ دقیقه حرارت داده تا دناچوره شود. سپس دما را به‌سرعت تا ̊  ۳۷کاهش دهید.
  3. سریعاً µl10 از محلول لیگاز را به چاهک‌های یک پلیت جدید اضافه کنید.
  4. µl10 از محصول PCR دناچوره شده را به این چاهک‌ها منتقل کرده تا حجم نهایی به µl20 برسد.
  5. پلیت را به مدت نیم ساعت در دمای اتاق و یا ۱۵ دقیقه در دمای̊ ۳۷ قرار دهید تا واکنش اتصال و جوش صورت پذیرد.

 

اتصال محصول لیگاز به سطح جامد

a) پلیت‌های پوشیده با استرپتواویدین

  1. پلیت را دو بار با محلول B شستشو داده تا استرپتواویدین‌های آزاد حذف شوند.
  2. محصول واکنش لیگاز به اضافۀ µl20 از محلول A را درون پلیت بریزید.
  3. پلیت را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
  4. پلیت را دو بار با محلول A و بعد دو بار با محلول دناچوران شستشو دهید. نهایتاً یک بار دیگر پلیت را با محلول A بشویید.

 

b) ذرات پارامغناطیسی پوشیده‌شده با استرپتواویدین

  1. بعد از واکنش لیگاز، µl20 از محلول A را به واکنش لیگاز اضافه نمایید.
  2. µl2 از ذرات پارامغناطیسی پوشیده‌شده با استرپتواویدین را به محلول واکنش فوق اضافه کنید.
  3. پلیت واکنش را در دمای اتاق به مدت حداقل ۱۵ دقیقه و بر روی شیکر انکوبه کنید.
  4. ذرات را دو بار با محلول A شستشو دهید. بدین منظور باید پلیت حاوی ذرات را در کنار آهن‌ربا نگاه دارید.

 

تشخیص و آشکارسازی محصول لیگاز

a) آشکارسازی بر پایۀ ELISA

  1. µl30 از آنتی‌بادی آنتی‌دیگوکسیژنین همراه با بافر بلوکان را به درون چاهک ریخته و نیم ساعت در دمای̊ ۳۷ سلسیوس انکوبه کنید. پس از انکوباسیون شش بار پلیت را با محلول B شستشو دهید.
  2. µl50 از محلول سوبسترا را به هر چاهک اضافه کرده و در دمای اتاق انکوبه نمایید تا جذب نوری آن در طول‌موج nm405 به ۲ برسد.

 

b) آشکارسازی بر پایۀ فلورسانس

  1. ذرات پارامغناطیسی شسته‌شده را در چاهک‌های حاوی µl180 از محلول تقویت فلورسانس یوروپیوم بریزید.
  2. پلیت را به مدت ۱۰ دقیقه بر روی شیکر قرار دهید.
  3. پیغام فلورسانس ناشی از یوروپیوم را با فلورومتر تعیین و ثبت نمایید.
  4. µl20 از محلول تقویت تربیوم را اضافه نمایید.
  5. پلیت را به مدت ۱۰ دقیقه بر روی شیکر قرار دهید.
  6. پیغام حاصل از تربیوم را نیز ثبت نمایید.

 

نکات قابل‌توجه:

  1. تکنیک OLA تحت شرایط استاندارد، توانایی تشخیص و افتراق واریانت‌های مختلف توالی موردنظر را دارد. محققین مختلف ممکن است مقادیر متفاوتی از لیگاز را به‌کار گیرند تا میزان بهینۀ آن را بیابند.
  2. یکی از اولیگونوکلئوتیدها، مکمل توالی مشترک بین دو واریانت می‌باشد. این اولیگونوکلئوتید دو نوع تغییر را به همراه دارد؛ این دو تغییر شامل فسفات ‘۵ برای اتصال و جوش و بیوتین ‘۳ برای اتصال به سطح جامد می‌باشد. دو اولیگونوکلئوتید دیگر هرکدام مکمل یک واریانت از توالی می‌باشند. برای تشخیص SNP، توالی این دو کاوشگر فقط در یک باز ‘۳ با هم متفاوت است. این دو اولیگونوکلئوتید اختصاصی آلل، در ‘۵ خود دارای دیگوکسیژنین (برای سیستم ELISA) و یا ترکیبات فلورسنت می‌باشند.
  3. اگر پیغام ضعیفی از آزمایش حاصل شد، تمام مراحل آزمایش باید مورد بررسی قرار گیرند، به عنوان مثال مرحلۀ اتصال و جوش، با نشاندارکردن ‘۵ یک اولیگونوکلئوتید توسط فسفات ۳۲γ و آنزیم پلی‌نوکلئوتید کیناز بررسی می‌شود. محصول اتصال بر روی ژل پلی‌اکریلامید دناچوران ۱۵% الکتروفورز شده و اتورادیوگرافی می‌شود. مرحلۀ اتصال اولیگونوکلئوتید به سطح جامد، با استفاده از اولیگونوکلئوتیدهای حاوی دو نوع نشانه[۱۶]، شامل دیگوکسیژنین و بیوتین ارزیابی می‌شود. ممکن است اشکال در مرحلۀ پوشش استرپتواویدین موجب ایجاد پیغام ضعیف گردد.
  4. شدت پیغام حاصل از سیستم ELISA را می‌توان با تغییر نوع سوبسترای آنزیم آلکالین فسفاتاز افزایش داد.

لیگاز

شکل ۲: تصویر شماتیک OLA

برای مطالعه یک جایگزینی (جایگزینی G به T در این مثال) دو واکنش OLA بر روی محصول PCR انجام می‌شود. یک واکنش آلل G (واکنش ۱) و واکنش دیگر آلل T (واکنش ۲) را شناسایی می‌کند. هنگامی که کاوشگرها به‌طور کامل به DNA هدف متصل شوند، آنزیم لیگاز کاوشگر حاوی بیوتین را به کاوشگر نشان‌دار شده با دیگوکسیژنین متصل می‌کند (سمت چپ تصویر)، اما هنگامی که یک نوکلئوتید آزاد وجود داشته باشد واکنش صورت نمی‌گیرد (سمت راست تصویر). برای مشاهده نتیجه واکنش، کاوشگر حاوی بیوتین به کف پلیت متصل شده و پس از شستشوی پلیت، واکنش ایمونواسی برای دیگوکسیژنین انجام می‌شود. حضور یا عدم حضور رنگ نمایانگر وضعیت واکنش است. در این مثال، نمونه برای آللG  هموزیگوت بوده و رنگ فقط در آن واکنش ظاهر شده است. در نمونه‌های هموزیگوت، فقط یکی از واکنش‌ها مثبت شده و رنگ ظاهر می‌شود، اما در نمونه‌های هتروزیگوت، پیغام مثبت در هر دو واکنش مشاهده می‌شود.

 

واکنش زنجیره‌ای لیگاز

در این سیستم از آنزیم لیگاز به‌منظور اتصال بین اولیگونوکلئوتیدهای مکمل DNA هدف استفاده می‌شود. نتیجه این روش تکثیر تصاعدی محصول واکنش لیگاز است. همانند تکنیک PCR، در دسترس بودن آنزیم مقاوم به حرارت، موجب سهولت آزمایش شده است. این تکنیک حاوی سه مرحله است: واسرشت شدن DNA الگو، اتصال آغازگر و انجام واکنش اتصال. از آنجا که مطالعه جایگزینی نوکلئوتید، هدف آزمایش است استفاده از تکنیک LCR حساسیت آزمایش را بالا می‌برد. اگر از مواد رادیواکتیو به‌منظور نشان‌دار کردن آغازگر استفاده شود، حساسیت آزمایش افزایش یافته و حدود ۲۰۰ مولکول DNA  هدف را می‌توان در نمونه شناسایی کرد، اما اگر این حد از حساسیت نیاز نباشد، می‌توان از گزارشگرهای فلورسنته استفاده نموده و با استفاده از دستگاه تعیین توالی DNA که بر اساس فلورسانس عمل می‌کند، نتیجه واکنش را خواند. همچنین می‌توان مشابه تکنیک OLA، از سیستم ELISA برای مشاهده نتیجه واکنش استفاده کرد (شکل ۳).

لیگاز

شکل ۳: روش اجرای LCR

در این تصویر گروه فسفات با ماده رادیواکتیو نشان‌دار شده است. چهار آغازگر مورد استفاده در این تکنیک باید طوری طراحی شوند که در انتهای ‘۳ خود و در محل اتصال یک نوکلئوتید آزاد باشد (همانطور که در تصویر به‌صورت مستطیل آغازگر نشان داده شده است). همچنین به‌منظور جلوگیری از واکنش اتصال مستقل از الگو، می‌توان دو نوکلئوتید آزاد به انتهای ‘۵ آغازگرهای اختصاصی آلل اضافه نمود.

 

مواد موردنیاز:

  • محلول LCR

۲۰ μl 1M KCl (0.2 M final)

۲۰ μl 10X thermostable ligase buffer (see recipe; 2X final)

۲۰ μl 10 mM NAD+ (Sigma; 2 mM final)

۴۰ μl 0.1% (v/v) Triton X-100 in H2O (0.04% final) Prepare fresh

NAD+ can be stored up to 6 months at −۲۰°C

  • آغازگرها: آغازگرهای اختصاصی آلل و آغازگرهای اتصالی نشان‌دار شده با P32 مکمل هر دو رشته هدف
  • ۵U آنزیم لیگاز مقاوم به حرارت
  • DNA هدف: ۱۰µl از محصول PCR یا ۱۰ng از DNA ژنومی
  • روغن معدنی
  • فرمامید
  • نشانگر اندازه مولکولی DNA

 

انجام واکنش لیگاز

  • محلول واکنش را برای هر یک از آلل‌ها تهیه نمایید:

۱۰۰ μl LCR mix

۴۰ fmol of each of the allele-specific primers for each strand

۴۰ fmol of the 32P-labeled joining primers for each strand

۰٫۵ U thermostable ligase.

هر محلول حاوی دو آغازگر اختصاصی آلل و دو آغازگر اتصالی است.

  • DNA مورد آزمایش را به محلول واکنش اضافه نموده و محلول را با ۳۰µl روغن معدنی بپوشانید.
  • نمونه‌ها را در دستگاه ترموسایکلر قرار داده و برنامه دمایی زیر را به دستگاه بدهید:
  1. واسرشت سازی: °۹۴ سلسیوس به مدت ۳۰ ثانیه
  2. اتصال آغازگر و انجام واکنش اتصال: °۶۵ سلسیوس به مدت ۲ دقیقه
  3. تکرار برنامه فوق به میزان ۳۰-۲۵ چرخه

اگر ۳۰ چرخه واکنش انجام شود، واکنش اتصال زمینه‌ای نیز مشاهده می‌شود؛ به عبارت دیگر با طولانی شدن مدت واکنش، اتصالات غیراختصاصی آغازگر به‌صورت تصاعدی افزایش می‌یابد.

  1. تشخیص و شناسایی محصول واکنش با الکتروفورز
  • ۴µl از محصول واکنش را با ۴µl فرمامید مخلوط کرده و به مدت ۲ دقیقه در دمای °۱۰۰ سلسیوس قرار داده تا نمونه‌ها واسرشت شوند. نمونه‌های واسرشت‌شده را بر روی ژل ۱۰% پلی‌اکریل امید ببرید. نشانگر وزن مولکولی نشان‌دار شده را نیز در کنار نمونه ­ها قرار داده و با ولتاژ ۶۰W به مدت ۲ ساعت الکتروفورز نمایید.
  • ژل را خشک نموده و بر روی فیلم رادیولوژی قرار دهید تا محل باندها مشخص شود.

[۱] Junction

[۲] Oligonucleotide ligation assay

[۳] ligase chain reaction

[۴] Chlorella

[۵] Tag

[۶] Microarray

[۷] Micro bead

[۸] Thermus thermophilus

[۹] Common probe

[۱۰] Chelates

[۱۱] Europium

[۱۲] Terbium

[۱۳] Phosphate-buffered saline

[۱۴] Samarium

[۱۵] ELISA plate reader

[۱۶] Label

تکنیک واکنش ‘‍‍۵ نوکلئاز

الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا

انواع روش‌های شناسایی جهش‌ها

مقدمه‌ای بر تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع آن

مقدمه‌ای بر تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع آن

پلی‌مورفیسم طولی قطعات تکثیرشده (AFLP)

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی
  • لیگاز

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *