الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا

نویسنده: محمدرضا یزدانی، کارشناسی ارشد آزمایشگاه (ایمنولوژی) دانشگاه علوم پزشکی شیراز

اصول:

دستگاه خوانشگر ميـكروپليت كه فتومتر خـوانشگر ميكروپليت يا خوانشگر الايزا ELISA نيـز ناميـده می‌شود، يک اسپكتروفتومتر اختصاصي است و براي خواندن نتايج آزمايش الايزا طراحي شده است. اين روش در ايمونولـوژي و سرولـوژي كاربرد مستقيم دارد. از كاربردهاي ديگر، تأييد حضور آنتي‌بادي يا آنتی‌ژن يک عامل عفوني در يک موجود زنده و همچنين آنتی‌بادی‌های حاصل از واكسيناسيون و يا اتوآنتي‌بادی‌ها در بیماری‌هایی مثل روماتيسم است. درنهايت، جذب محصول واكنش ايجادشـده بـا اسپكتروفتومترخوانده می‌شود.

اجزاء اصلی یک دستگاه الایزا ریدر شامل یک منبع نور، یک صافی، یک ظرف، یک ردیاب نور و یک وسیله نشان‌دهنده می‌شود. نور یا روشنایی که به‌وسیله یک منبع تغذیه با ولتاژ ثابت ایجاد می‌شود، تابش نور را در همان حد طول‌موج دلخواه محدود می‌کند. پس از این که محدوده موردنظر به‌وسیله روزنه ثابتی که در ظرف حاوی نمونه قرار دارد مشخص شد، نوری که پخش می‌شود به قسمت ردیاب می‌تابد. اینجا انرژی نورانی به انرژی الکتریکی تبدیل می‌شود و این انرژی به‌عنوان میزان جذب‌شوندگی خوانده شده و روی یک نشان‌دهنده یا به‌صورت دیجیتال نشان داده می‌شود.

دستگاه‌های الایزا ریدر بر اساس نوع و سیستم خوانشگر به سه دسته تقسیم می‌گردند که عبارت است از:

1- Single Reader که تنها یک چاهک را به طریق دستی قرائت نموده و هیچگونه مد محاسباتی ندارند؛ لذا بایستی منحنی استاندارد تست‌های کمی توسط آزمایشگر به طریق دستی رسم گردد. به همین علت از قیمت و کیفیت پائینی برخوردار است.

2- Strip Reader که تعداد 3-1 استریپ 8 یا 12 تایی را به‌صورت اتومات قرائت نموده و در عین حال منحنی تست‌های کمی را بر اساس مد محاسباتی رسم می‌نمایند. علاوه بر این، به علت دارا بودن فیلتــــرهای افتراقی (Differential Filters) قابلیت خوانش در دو طول‌موج (Bichromatic Reading) را که به دلایل متعددی موردنیاز است، به‌طور همزمان دارند که این دلایل عبارت است از:

الف- حذف رنگ زمینه آبی که در اثر واکنش آنزیم HRP با TMB بعد از نوآرایی رنگ آبی به زرد قرائت در طول‌موج رفرانس موردنیاز است.

ب- با توجه به اینکه رنگ زرد دارای طیف بلند گذر است که طول‌موج‌های بالاتر از nm500 را به‌خوبی عبور داده و جذب آن در طول‌موج‌های حدود nm 600 صفر است، لذا نمونه در طول‌موج رفرانس نیز قرائت می‌شود تا نیاز به بلانک منتفی گردد؛ زیرا در روش(Bichromatic Reading) ، نمونه در طول‌موج‌های گوناگون خوانده شده و سپس تفاضل جذب‌های حاصله، مبنای تعیین غلظت قرار می‌گیرد.

3– Plate Reader که قابلیت خوانش یک پلیت 96 تایی را در حداقل زمان دارا بوده و لذا از سرعت، دقت و صحت بیشتری نسبت به دستگاه‌های Strip Reader برخوردارند. از این ‌رو قیمت بالاتری را نیز دارند.

الزامات نصب و راه‌اندازی

برای اينكه دستگاه خوانشگر ميكروپليت عملكرد صحيح داشته باشد، رعايت نکته‌های زير الزامي است:

1) وجود يک محيط تميز و عاری از گردوخاک

2) وجود يک ميز كار ثابت، دور از تجهيزاتي كه ايجاد ارتعاش می‌کنند، مانند سانتريفوژ و دستگاه همزن. اين ميز بايد اندازة مناسب داشته باشد تا فضای كار كافي در كنار دستگاه خوانشگر باقی بماند. وسايل جانبی لازم عبارت است از: شستشودهنده انكوباتور، توزيع‌گر و كامپيوتر با ضمائم جانبی.

3) وجود يک منبع تغذية الكتريكي كه با استانداردهای كشور هماهنگ باشد (برای امريكا 110V با فركانس 60Hz و برای كشورهای ديگر V220-240 با فركانس 60Hz).

کنترل كيفى الايزا ريدر:

بسیاری از شرکت‌های تولیدکننده کیت‌های آزمايشگاهى، جهت ارزيابى عملكرد الايــزا ريــدر، کیت‌های كنتــرل كيفى معرفى کرده‌اند كه با اســتفاده از آنها می‌توان عملكرد الايزا ريدر، واشر و سيستم سمپلينگ را مورد ارزيابى قــرار داد. در ايــن روش پارامترهاى مهمى چون خطى بودن (Linearity)، دقت الايزا ريدر(Precision) ، كارايى الايزا واشــر (Efficiency) و صحت سيستم توزیع‌کننده دستى (سمپلرها) يا دستگاهى (Accuracy) را مورد ارزيابى قرار می‌دهند.

كنترل خطى بودن (Linearity):

كنتــرل Linearity بايــد ماهانه مورد ارزيابى قــرار گيرد و هدف از آن تعيين قابليــت دســتگاه در تبعيت از قانــون بير (bear,s Law) اســت كه طبق اين قانون غلظت محلول نســبت مستقيم با مقدار نور جذب‌شده دارد. كنترل خطى بودن در دســتگاه الايزا يك پارامتر مهم در كارايى دستگاه اســت چرا كه كنتــرل صحت فتومتريك تا حدود زيادى با بهره‌گیری از اســتانداردهاى مختلف در هــر ران كارى قابل كنترل اســت؛ اما اگر خطى بودن دستگاه دچار اشكال باشد تفاوت‌های فاحشى در جواب‌ها حاصل می‌شود.

روش کنترل خطی بودن (Linearity):

ابتدا محلول اسيد پيكريك یا محلول مناسب دیگر (باید دارای حداكثر جذب نــورى در طول‌موج 450 نانومتر يا نزديك به آن باشد) را در تمــام چاهک‌های پليت بريزيد و پليــت را در طول‌موج 450 نانومتر قرائت كنيد. نتيجه جذب نورى تمام چاهک‌ها در صورت سالم بودن فيلتر بايســتى بیشتر از 3 باشد، ســپس يكبار ديگر بدون پليت جذب نورى را قرائــت می‌کنیم، در چنين شــرايطى بايد جذب نــورى براى تمام چاهک‌ها بين 01± باشــد. در صورتى كه نتايج بالا حاصل نشــد با شرکت پشتيبان تماس بگيريد.
در بررســى خطى بودن دســتگاه مقدار محتويات داخل wellهاحتماً بايد يكسان باشد (چون مسير نورى path lengthچاهک‌های مختلف بايد حتماً يكسان باشد.(ابتدا معرف دى كرومات پتاســيم (3/1 گرم دى كرومات پتاســيم را در 800 میلی‌لیتر آب مقطــر حل كرده، ســپس 3/3 گرم پتاسبــه آن اضافه می‌کنیم و حجــم را به يك ليتر می‌رسانیم). يك رقت ســريال تهيه كرده (به نســبت 1/2، 1/4 و 1/8)، سپس با يك سمپلر200 λكاليبر شــده، 200 λ از هر رقت (از رقيق نشــده هم به‌عنوان رقــت 1/1) بــه 3 چاهك به‌طور متوالى اضافــه می‌کنیم (از هر رقت در سه چاهك ريخته می‌شود) سپس در Absorbance Mode بــا فيلتر اوليه nm450 و فيلتــر افتراقى nm630 جذب آنها خوانده شــده و با مقادير مورد انتظار به دســت آمده از ميانگين جذب نورى 3 چاهك اول (كه مستقیماً از خوانش OD معرف اصلى به دســت می‌آید) مورد مقايسه قرار می‌دهیم.

براى بدســت آوردن محدوده مورد انتظار Expected valueدر هر رقتى ابتدا ميانگين جذب نورى بدست آمده براى محلول اصلى را به‌عنوان عدد پايه در نظر گرفته و براى رقت‌های مختلف ضربدر ضريب رقت می‌کنیم. براى به دست آوردن محدوده موردنظر در هر رقت از فرمول ذيل استفاده می‌کنیم:

TEST 186

همچنين جهت چــك فيلترها می‌توانیم از برنامه Test # 186اســتفاده كنيم. چنانچه عدد بدســت آمده بين 10-2 باشــد عملكرد فيلترها مناســب اســت، در غيــر این صورت دســتگاه را براى سرويس به شــركت پشتيبان ارسال نماييد. براى انجام تست ابتدا دستگاه را روشن كرده و 15 دقيقه صبر كرده تا گرم شود و ســپس بعد از ظاهر شدن كلمه selection، mode دكمــه Testرا زده و ســپس عــدد 186را وارد كــرده و Enterمی‌کنیم. بعد از چند ثانيه چهار عــدد براى فيلترهاى 0،1،2،3 ظاهر می‌شود كه اگر اين اعداد بين 10-2 باشــد نشان‌دهنده ســلامت فيلترها است (در فيلترهاى نو اين عدد به 10 نزدیک‌تر است و در فيلترهاى كهنه به 2 نزديكتر است).

كنترل صحت فتومترى

آزمون صحت فتومترى براى بررســى اين مســئله است كه آيا حداكثر جذب نــورى به مقدار مشخص در طول‌موج خاصى صورت می‌گیرد؟ به عبارت ديگر هــدف، تعيين تفاوت جذب واقعى با جذب مشــاهده شده است. صحت فتومتــرى بــه توانايى لامــپ در ارائه حداکثر تابش فتوالكتريك، نوع و كيفيت منوكروماتور (تک‌رنگ كننده) بستگى دارد. راه‌های زیادی برای بررسی صحت فتومتریک وجود دارد که در اینجا به دو مورد اشاره شده است:

الف) براى بررســى صحت فتومتريك از محلول رنگزاى قليائى دى كرومات پتاســيم (40 میلی‌گرم دى كرومات پتاســيم را در 800 میلی‌لیتر آب مقطــر حل كرده، ســپس 3/3 گرم پتاس به آن اضافــه می‌کنیم و حجــم را به يك ليتر می‌رسانیم) اســتفاده می‌کنیم. با يك سمپلر 200 λ (كه به‌دقت كنترل كيفى شــده و CV آن زير 3 اســت) مستقیماً از معرف فوق به داخل 5 چاهــك ريخته و در Absorption Mode با فيلتر اوليــــه nm405 و فيلتر افتراقى nm630 جــذب آن را می‌خوانیم و ســپس ميانگين آن را محاســبه می‌کنیم. عدد به‌دست‌آمده بايــد در محـــــــدوده 0/04±0/235 قرار گیرد.

ب) در صورت استفاده از محلول رنگی متیل اورنج (متیل اورنج در 0.1% توئین 20 تازه تهیه شده) باید OD خوانده شده توسط الایزا ریدر با OD خوانده شده در اسپکتروفتومتر مرجع طبق فرمول زیر مقایسه و درصد inaccuracy یا Bias مربوطه محاسبه شود. عدم صحت نباید از 1.5% بیشتر باشد و یا OD دستگاه موردنظر باید در محدوده 0.001± اسپکتروفتومتر مرجع باشد. البته این روش به دلیل اختلاف در زاویه تابش نور و نیز اختلاف در کووت اسپکتروفتومتر و میکروپلیت ریدر مورد تأیید کامل کارشناسان نیست.

كنترل تكرارپذيرى

ايــن آزمــون بــراى پــى بــردن بــه وجــود هرگونه اختــلال در كثيــف بــودن حس‌گرها، لنزهاى دســتگاه و كاليبراســيون نامنــاسب يــك يا چنــد كانال دســتگاه و يا ناپايــدارى لامــپ دســتگاه اســت.

الف) ابتدا يك رقت1/2 از معرف تهيه شــده براى كنترل خطى بودن،تهيه كرده و ســپس از معــرف اصلى و معرف رقیق‌شده λ 200 به 8 چاهــك اضافه كرده و در Absorption Modeبــا فيلتــر اوليه 405 nm و فيلتــر افتراقــى nm630 جــذب آن را می‌خوانیم و ســپس ميانگيــن، انحراف معيار و ضريب تغييرات آن را محاســبه می‌نماییم. در ايــن حالت حداقــل 8 بار خوانــش OD در غلظت‌های مختلــف انجام شــود و ســپس CV آن را محاسبه كنيد (كمتر از 3 درصد قابل قبول است).

ب) یک میکروپلیت مناسب انتخاب کنید، محلول متیل اورنج در 0.1% توئین 20 را تازه تهیه کرده و رقت‌های مختلفی از این محلول را آماده نمایید و در طول‌موج 492 نانومتر خوانش کنید. هر رقت را حداقل ده بار خوانده و میانگین، انحراف معیار و CV را بدست آورید. CV بدست آمده باید کمتر از 3% باشد.

كاليبراسيون الايزا ريدر

كاليبراسيون اليزا ريدر به‌عنوان يك روند تخصصــى اســت كه بايســتى به‌وسیله يك تكنيسين يا مهندس آموزش‌دیده با استفاده از دستورالعمل‌های تهيه شده به‌وسیله سازنده آن دستگاه انجام گيرد. براى انجام كاليبراسيون، نياز به در اختيار داشتن يك مجموعه از فيلترهاى خاكســترى سوار شده بر روى يك پليت با همان اندازه هندسى مورد اســتفاده در تحلیل‌ها است. سازندگان دستگاه‌ها اين گونه پليت‌هاى كاليبراسيون را براى استفاده در هر طول‌موج تدارك ديده و در اختيار مصرف‌کنندگان قرار می‌دهند. پليت‌هاى كاليبراســيون حداقل به 3 محدوده از دانسيته نورى در دامنه‌های كم، متوســط و زياد مجهز هستند. براى انجام كاليبراسيون رعايت فرايند زير الزامى است:

1- پليت كاليبراسيون را بر روى دستگاه قرار دهيد.

2- يــك قرائت كامل به‌وسیله پليت كاليبرشــده را انجام دهيد و بررســى كنيد كه آيا اختلافى ميان مقادير قرائت‌شده در هر چاهك از حفره‌ها وجود دارد یا نه. در صــورت وجود چنين اختلافی، پليت را 180 درجــه چرخانده و عمل قرائت را مجدداً تكرار كنيد تا دريابيد كه آيا اين اختلاف برطرف شده است يا خير؟ به‌طور كلى اگر نتايج پليت در دو طول‌موج مطابق بــا نتايج مورد انتظار بود، معمــولاً نيازى به كاليبراسيون اضافى نيست.

3- بررســى كنيد كه آيا پليت خوان‌ها نياز به كاليبراسيون دارند يا خير؟

در صــورت نيــاز بــه انجــام كاليبراســيون اين عمــل را مطابق دستورالعمل شركت سازنده دستگاه ادامه داده و سپس بررسى كنيد كه خطى بودن پليت‌خوان‌ها در همه مراحل بدست آمده است يا خير؟

4- در صورتى كه اين دســتگاه از يك پليت كاليبراسيون برخوردار نيست می‌توان عمل كاليبراسيون را با پر كردن حفره‌هاى پليت از يك محلول رنگى، نسبت به قرائت كامل و سريع آن به عمل آورد و سپس با چرخاندن پليت به ميزان 180 درجه براى بار دوم عمل قرائت را مجدداً تكرار كرد. در صورت يكســان بــودن نتايج هر دو قرائت، ميانگين نتايج در هر رديف را به دست آوريد. بدين ترتيب پليت‌خوان كاليبره شده است.

5- بررســى كنيد كه آيا پليت‌خوان ستون به ستون كاليبره است.

بديــن منظور يك پليت خالى و تميز را بر روى دســتگاه قرار داده و عمل قرائــت را انجام دهيد. در صورت عدم وجود هرگونه اختلاف ميــان مقدار ميانگين ستون‌های اول تا آخر پليــت، می‌توان گفت كه پليت‌خوان كاليبره است.

ذكر اين نكته ضرورى اســت كــه نحوه كاليبره كــردن بعضى از دستگاه‌ها از طريق ســازندگان دستگاه و در قالب بروشور و جزواتى كه به همراه دستگاه به خريدار ارائه می‌شود، مشخص گردیده است.

نگهدارى الايزا ريدر

نگهداری روزانه:

برای کنترل روزانه دستگاه باید در هر روز حس‌گرها و منبع نورانی هر کانال آن مورد بازبینی قرار گرفته و در صورت نیاز تمیز گردند.
تأیید کنید که کالیبراسیون خوانشگر کافی است. هنگام کار روزانه اجازه دهید خوانشگر به مدت 30 دقیقه گرم شود. در محله بعد قرائت بلانک را انجام دهید و سپس یک پلیت کامل از سوبسترا را قرائت کنید. خوانش‌ها می‌بایست یکسان باشند. اگر این‌طور نبود، پلیت را چرخانده و قرائت را به‌منظور تعیین اینکه آیا اختلاف در پلیت یا خوانشگر است، تکرار کنید.
سیستم کشنده اتوماتیک اسلایدها را بررسی کنید که نرم و ثابت باشد.

نگهداری پیشگیرانه: هر چهار ماه يكبار

پايدارى نور لامپ را بررســى كنيد. در اين رابطه با استفاده از يك پليت كاليبره شــده، قرائت‌های پیوسته‌ای را با دوره زمانى 30 دقيقه با استفاده از يك پليت يكسان انجام دهيد. اين نتايج قرائت شده را مقايسه كنيد. در بين آنها نبايد هیچ‌گونه اختلافى مشاهده شود.
سیستم‌های حسگر نورى و نور دهنده را تميز كنيد.
كشوی پليت را تميز كنيد.
انطبــاق محــور هــر حفــره بــا سیستم‌های انتشاردهنده و آشکارساز را بررسى كنيد.

بروز خطا در قرائت اطلاعات

قرائت‌های غلط به‌وسیله دســتگاه الايزا ريدر می‌تواند ناشى از عوامل زير باشد:

1- چاهــك ميكروپليت در ســمت پائين خش برداشته باشد.

2- از طول‌موج غلط استفاده شده باشد.

3- دســتگاه به‌طور غلط برنامه‌ريزى شده باشد.

4- میکروپروسسور فعال‌کننده دستگاه در اســتفاده از طول‌موج درســت دچار خطا باشد.

5- دســتگاه الايزا ريدر در معرض گردوخاک، لغــزش، الكترومغناطيــس زياد، نور مستقيم خورشيد، نوسان، رطوبت و حرارت زياد قرار گرفته باشد.

6- بررســى منظــم دســتگاه بــر اســاس دستورالعمل‌های تولیدکننده يــا توصیه‌های ارائه‌شده انجام نگرفته باشد.

7- تعويــض لامپ يا منبع نور به‌درستی انجام نگرفته باشد.

8- دستگاه بدون توجه به احتیاط‌های لازم جابه‌جا شده باشد.

در ادامــه، جــدول زيــر بــه عمده‌ترین مشــكلات احتمالــى كــه ممكن اســت يك دســتگاه الايــزا ريــدر بــا آن روبــرو شــود بــه همــراه علــت احتمالــى پيدايــش و راه‌حل‌های پيشنهادى اشاره دارد.