کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالای دناتوره

كروماتوگرافي مايع با كارآيي بالاي دناتوره

کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالای دناتوره

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا… (عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

 

کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالای دناتوره[۱](dHPLC) روشی سریع و قابل اعتماد برای غربالگری تغییرات DNA می‌باشد. این تکنیک می‌تواند در چند دقیقه، جانشینی تک نوکلئوتیدی و حذف و اضافه‌های در حد ۱۵۰۰-۸۰ نوکلئوتیدی را با حساسیت و اختصاصیت در حدود ۱۰۰% شناسایی کند. در این تکنیک محصول PCR نمونۀ سالم (وحشی[۲]) و نمونۀ بیمار (حاوی جهش[۳]) را با هم مخلوط کرده و با حرارت دناتوره (دگرگون) می‌کنند. سپس با سرد کردن این مخلوط، رشته‌های همودوبلکس و هترودوبلکس ایجاد خواهند شد (شکل ۱و ۲).

کروماتوگرافی

شکل (۱): نحوه انجام کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالای دناتوره

 

اگر نمونه حاوی جهش باشد، در این مرحله چهار نوع رشته حاصل خواهد شد.

کروماتوگرافی

شکل ۲: نمایی از چهار رشته تشکیل‌شده در صورت وجود جهش در رشته‌ها

سپس این مخلوط را از درون ستون کروماتوگرافی خاصی عبور می‌دهند. این مخلوط حاوی هترودوبلکس و همودوبلکس بوده و به مسیر حاوی تری‌اتیل آمونیوم استات و استونیتریل تزریق می‌شود. در این حالت یون تری‌اتیل آمونیوم با بار مثبت حاصل شده که هم دارای سر آبگریز و هم سر آب‌دوست می‌باشد. ستون کروماتوگرافی که درون آون قرار دارد دارای ذرات با بار مثبت می‌باشد. تری‌اتیل آمونیوم مثبت به فسفات منفی DNA متصل شده و خاصیت آبگریزی را القاء می‌کنند. در اینجا DNA که آبگریز شده است، به ذرات آبگریز متصل می‌شود (شکل ۳).

کروماتوگرافی

شکل ۳: نحوه عملکرد ستون کروماتوگرافی

 به این ستون یک شیب دمایی با گسترۀ ۶۷-۴۸ درجه سلسیوس داده می‌شود. در این مرحله غلظت استونیتریل را رفته‌رفته افزایش داده تا قدرت یونی تری‌اتیل آمونیوم کاهش یابد و قطعات DNA از ستون جدا شوند.

رشته‌های هترودوبلکس هنگام عبور از ستون زودتر و بیشتر دناتوره می‌شوند. این رشته‌های دناتوره شده کمتر در ماتریکس ستون باقی مانده و زودتر از درون ستون عبور می‌کنند. بعد از عبور و خارج شدن رشته‌ها از ستون، آشکارساز UV آن‌ها را تشخیص داده و نمودار مربوط به هرکدام از این رشته‌های هترودوبلکس و همودوبلکس را به‌طور جداگانه ترسیم می‌کند. اگر هیچ جهشی وجود نداشته باشد، تنها یک قله دیده می‌شود، ولی اگر جهش وجود داشته باشد ۴-۲ قله در کروماتوگرام مشاهده می‌گردد.

کروماتوگرافی

شکل ۴: تفسیر قله‌های تشکیل‌شده در کروماتوگرام

 

این سیستم کروماتوگرافی شامل یک فاز ثابت آبگریز و فاز متحرک حاوی یک یون دوگانه دوست و یک یون آب‌دوست کوچک می‌باشد. جذب یون مثبت تری‌اتیل آمونیوم بر سطح فاز ثابت و آبگریز، موجب ایجاد یک پتانسیل الکتریکی بر روی آن شده است. اتصال DNA بر روی سطح فاز ثابت، وابسته به اندازه مولکول DNA، میزان پتانسیل سطحی فاز ثابت و نمونه و نهایتاً ناحیۀ تماس DNA با فاز ثابت می‌باشد. با افزایش دمای ستون، DNA دورشته‌ای شروع به دناتوره شدن نسبی کرده و حبابی را تشکیل می‌دهد. با تشکیل این حباب میزان سطح بیرونی DNA افزایش می‌یابد. در نتیجه مقدار پتانسیل سطحی این نقطه از DNA کاهش یافته و اتصال DNA به سطح فاز ثابت سست‌تر می‌شود. در یک نمونه حاوی هترودوبلکس و همودوبلکس، چهار گونۀ متفاوت زنجیره‌ها، براساس میزان ناپایایداری خود از هم جدا می‌شوند. قطعات DNA کوچک‌تر از ۱۵۰ جفت بازی ناپایدار بوده و جهش‌های موجود در آن‌ها با دناتوره کردن نسبی[۴] تعیین نمی‌شود. برای تشخیص جهش در قطعات کوچک محصول PCR (50-150 جفت باز)، از تکنیک
[۵]IP-RP-HPLC استفاده می‌شود. در این حالت نمونه‌ها تحت شرایط دناتوره‌سازی کامل قرار می‌گیرند. حفظ و نگهداری زنجیره‌های تک‌رشته‌ای اسید نوکلئیک وابسته به توالی باز‌های زنجیره می‌باشد. این بازها و همچنین سطح فاز ثابت هر دو آبگریز بوده و تمایل به دوری و فرار از فاز متحرک[۶] را دارند، در نتیجه اگر دو تک‌رشتۀ هم‌اندازه حتی در یک باز با هم اختلاف داشته باشند، توسط این تکنیک مشخص خواهد شد. در این تکنیک فقط یک استثناء وجود دارد که مربوط به جابجایی C و G می‌باشد. تکنیک dHPLC حساس و با تکرارپذیری بالا بوده و برای افزایش کارآیی و مقرون به‌صرفه بودن آن، باید از ستون‌های کاپیلاری با قطر داخلی ۳۲۰-۵۰ میکرومتری به‌عنوان کانال‌های جداسازی استفاده نمود. مهم‌ترین مزیت استفاده از سیستم کاپیلاری، سیگنال بهتر این سیستم می‌باشد، زیرا اندازۀ قله نمودار نسبت معکوس با مجذور قطر ستون دارد. از لحاظ تئوری ارتفاع نمودار حاصل از یک نمونه با سیستم ستون ۰/۲ میلی‌متری، ۵۰۰ برابر نمودار همان نمونه با سیستم ۴/۶ میلی‌متری می‌باشد، اما در عمل میزان نمونه‌ای که به سیستم کاپیلاری تزریق می‌شود به چندصد نانولیتر کاهش یافته و مصرف مواد موردنیاز PCR کاهش می‌یابد.

حساسیت بالای روش کاپیلاری، امکان ترکیب dHPLC را با تکنیک الکتروفورز کاپیلاری DNA بوجود آورده است. در این تکنیک تشخیص SNP با کمک فلورسنت تهییج شده با لیزر صورت می‌پذیرد. در این تکنیک از پرایمرهای نشاندار شده با رنگ‌های فلورسنت متفاوت در PCR استفاده شده و در نتیجه محصولات مختلف PCR نشاندار می‌باشند. نمونه‌ها به‌طور اتوماتیک در ستون‌های کروماتوگرافی آنالیز شده و بر اساس طول‌موج تابشی آن‌ها شناسایی می‌شوند.

برای افزایش کارایی، می‌توان مشابه آنچه در الکتروفورز کاپیلاری انجام می‌شود، ستون‌ها را به هم متصل کرده و از یک پمپ، سیستم تزریق و دستگاه آشکارسازی استفاده نمود. نهایتاً فرار ترکیبات فاز متــــــــــــحرک، جریان آرام مایع و خروج مداوم کاتیون از نمونه DNA باعث شده که IP-RP-HPLC مناسب‌ترین گزینه برای جفت شدن با ESI-MS[7] باشد. اسپکترومتری جرمی به تعیین دقیق ژنوتیپ محصولات PCR کمک می‌کند.

 

مواد موردنیاز انجام آزمایش dHPLC:

محلول واکنش PCR:

۱۰ mM Tris-HCl, pH 8.3

 ۵۰ mM KCl

۲٫۵ mM MgCl2

 ۰٫۱ mM each of the four dNTPs

 ۰٫۲ µM of each primer

۱ U of AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA) in deionized distilled water

به‌منظور آشکارسازی با فلورسانس تهییج شده توسط لیزر، یکی از پرایمرها باید با ماده فلوروفور نشاندار شده باشد.

 

ستون‌های کروماتوگرافی برای IP-RP-HPLC اسید نوکلئیک:

  1. در HPLC معمولی فاز ثابت شامل ذرات قلیایی و غشاء‌دار PS/DVB به قطر ۲ میکرون می‌باشد. این ذرات در ستون‌های ۴/۶×۵۰ میلی‌متری ریخته می‌شوند.
  2. در HPLC کاپیلاری، ستون‌ها (۰/۲×۶۰ میلی‌متری) حاوی چند فاز ثابت شامل استیرن و دی‌وینیل بنزن می‌باشند.

محلول‌های مورد استفاده در IP-RP-HPLC اسید نوکلئیک:

محلول ذخیرۀ M2 تری‌اتیل آمونیوم استات (TEAA) با pH=7.0. این محلول با حل کردن تعداد مول مساوی از تری‌اتیل آمین و اسید استیک گلاسیال در آب به دست می‌آید. برای ساخت محلول‌ها از آب‌ کاملاً خالص باید استفاده شود.

  1. محلول A: mM100 تری‌اتیل آمونیوم استات با pH=7.0 و mM1/0 Na4EDTA
  2. محلول B: mM100 تری‌اتیل آمونیوم استات با pH=7.0 و ۲۵% استونیتریل، mM0/1 Na4EDTA

این محلول‌ها به مدت یک هفته در دمای اتاق قابل نگهداری می‌باشند.

 

روش انجام کار:

  1. واکنش PCR با حجم Lµ۵۰ انجام می‌شود. برای هر واکنش ng50 از DNA مصرف می‌شود.
  2. برنامۀ واکنش PCR به‌صورت زیر می‌باشد:
  • دناتوره‌‌سازی اولیه: ۹۵ درجه به مدت ۱۰ دقیقه
  • دناتوره‌سازی: ۹۴ درجه به مدت ۲۰ ثانیه
  • اتصال پرایمر: یک دقیقه در دمای ۶۳-۵۶ درجه با ۰/۵ درجه کاهش در هر چرخه
  • طویل‌سازی: ۷۲ درجه به مدت ۱ دقیقه
  • تکرار سه مرحلۀ فوق برای ۱۴ چرخه
  • دناتوره‌سازی: ۹۴ درجه به مدت ۲۰ ثانیه
  • اتصال پرایمر: دمای ۵۶ درجه به مدت یک دقیقه
  • طویل‌سازی: ۷۲ درجه به مدت ۱ دقیقه
  • تکرار سه مرحله فوق برای ۲۰ چرخه
  • طویل‌سازی نهایی در دمای ۷۲ درجه سلسیوس به مدت ۵ دقیقه
  • خنک‌سازی و نگهداری نمونه در دمای ۶ درجه سلسیوس

 

تشکیل هترودوبلکس و همودوبلکس:

در این تکنیک برای تشکیل دوبلکس، محصول PCR مربوط به هر آلل را با نسبت یکسان مخلوط کرده و در دمای ۹۵ درجه سلسیوس به مدت ۳ دقیقه قرار داده تا دناتوره شوند. دما را به‌تدریج از ۹۵ به ۶۵ درجه کاهش داده و نیم ساعت در این دما قرار دهید تا رشته‌ها به هم متصل شده و دوبلکس‌ها تشکیل شوند. در این هنگام نسبت‌های یکسانی از هترودوبلکس و همودوبلکس‌ها به‌وجود آمده است. این محصولات را می‌توان به مدت چندین هفته در دمای ۴ درجه سلسیوس نگهداری کرد.

 

کروماتوگرافی  dHPLCبا استفاده از ستون‌های معمولی

آماده‌سازی و آزمایش ستون‌ها:

  1. ستون‌های جدید مورد استفاده در این تکنیک، با استفاده از محلول A 50% و محلول B 50% و با سرعت جریان ml/min0/9 در دمای ۵۰ درجه سلسیوس و به مدت ۶۰ دقیقه آماده می‌شوند.
  2. کارآیی این ستون‌ها با تزریق gµ۰/۵ (fmol300) از محصول هضم‌شدۀ pUC18 توسط آنزیم محدودگر Hae III به سیستم و سرعت جریان ml/min0/9 در دمای ۵۰ درجه سلسیوس ارزیابی می‌شود.
  3. محلول‌ها باید شیب غلظت خطی به‌صورت زیر را دارا باشند:

۰٫۰–۳٫۰ min 43–۵۶% eluent B

۳٫۰–۱۰٫۰ min 56–۶۸% eluent B

  1. ستون‌ها را باید با محلول B 95% به مدت ۱ دقیقه شستشو داد.
  2. نحوۀ جداسازی قطعات مورد آزمایش، با استفاده از UV با طول‌موج nm254 موجود در قسمت خروجی ستون ارزیابی می‌شود.
  3. با تزریق pUC18 هضم شده، باید قطعات ۲۵۷، ۲۶۷، ۴۳۴، ۴۵۸ جفت بازی را با وضوح بالا به دست آورد.

 

آنالیز کروماتوگرافی  dHPLCبا استفاده از ستون‌های معمولی

به‌منظور تشخیص دقیق اتصال بازهای ناجور، دما و شیب غلظتی محلول‌ها باید با دقت کامل انتخاب و کنترل شود. به‌خصوص در مورد شرایط دمایی سیستم HPLC باید حداکثر دقت را داشت. دمای بهینۀ تشخیص باز ناجور را می‌توان به‌صورت تجربی و یا در صورت مشخص بودن توالی قطعات، توسط محاسبه به دست آورد. شیب غلظت محلول شروع و پایان را نیز می‌توان به‌وسیله برنامه ذوب HPLC و یا براساس اندازه محصول PCR و مقایسۀ آن با زمان باقی ماندن قطعات هضم شدۀ DNA که در هنگام آزمایش ستون به کار رفت، تعیین نمود.

 

نکات قابل‌توجه

  1. پس از تنظیم سرعت جریان، شیب غلظت و دما، ۱۰ میکرولیتر از نمونه به دستگاه HPLC تزریق می‌شود.
  2. ماده مؤثره موجود در محلول، استونیتریل می‌باشد. برای به دست آوردن کروماتوگرام برنامۀ شیب غلظتی زیر باید رعایت شود:

۰٫۰–۰٫۵ min 50–۵۲% eluent B

۰٫۵–۴٫۰ min 52–۵۹% eluent B

  1. نتایج آزمایش با استفاده از آشکارساز جذبی UV با طول‌موج ۲۵۴ نانومتر به دست می‌آید.
  2. پس از اتمام آزمایش، ستون‌های دستگاه به مدت یک دقیقه به‌وسیله محلول B 95% شسته می‌شوند.
  3. به‌منظور حفظ کارآیی این ستون‌ها برای آزمایش هزاران نمونه، باید از آلودگی سیستم به کاتیون‌های فلزی پرهیز شود.
  4. هنگامی که از سیستم استفاده نمی‌شود، باید جریان بسیار کوچکی (ml/min0/05) از محلول A 50% و محلول B 50% از ستون عبور کند.

 

ارزیابی کروماتوگرام‌ها:

تشکیل هترودوبلکس در نتیجۀ وجود جهش در قطعۀ مورد بررسی، با وجود بیش از یک قله[۸] در نمودار کروماتوگرام مشخص می‌شود. شکل زیر بررسی کروماتوگرافیک نمونۀ هموزیگوت را نشان می‌دهد.

کروماتوگرافی

شکل ۵: نتایج بررسی کروماتوگرافیک یک نمونۀ هموزیگوت

جهش‌های مختلف موجب ایجاد درجاتی از ناپایداری دوبلکس‌ها در دمای داده‌شده به سیستم می‌شوند. این درجات مختلف از ناپایداری‌ها، خصوصیات پروفایل کروماتوگرافیک را تشکیل می‌دهند. مثال‌هایی از این پروفایل را در زیر می‌توان مشاهده نمود.

  کروماتوگرافی

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی

شکل ۶: پروفایل کروماتوگرافیک مختلف ناشی از وجود جهش‌های متفاوت

جهش‌هایی که در نواحی ذوب[۹] مشابه رخ می‌دهند، پروفایل یکسان یا مشابهی را ایجاد می‌کنند. به این دلیل به‌منظور تشخیص دقیق نوع و محل جهش باید از تعیین توالی قطعۀ موردنظر بهره جست. این تکنیک برای بررسی و تشخیص بازهای ناجور و حذف و اضافه‌های یک یا چند بازی کاربرد دارد.

 

کروماتوگرافی dHPLC با استفاده از ستون‌های کاپیلاری

هنگامی که ستون‌های کروماتوگرافی از قطر mm6/4 به قطر mm0/2 تبدیل می‌شوند، حجم نمونه، تغییر شیب غلظت، اتصالات و آشکارساز باید تغییر یافته و بهینه شوند. در این سیستم فاز متحرک باید ابتدا گرم شود، به همین دلیل از یک لوله موئینۀ[۱۰] سیلیکونی به طول ۲۰ سانتی‌متر و با قطر داخلی mµ۲۵ استفاده شده که این لوله درون آون موجود در بین تزریق‌کننده[۱۱] و ستون، قرار دارد.

 

آماده‌سازی و آزمایش ستون:

  1. ستون‌های یک‌پارچۀ جدید موجود در این تکنیک، با استفاده از محلول A 50% و محلول B 50% و با سرعت جریان µl/min3 در دمای ۵۰ درجه سلسیوس و به مدت ۶۰ دقیقه آماده می‌شوند.
  2. کارآیی این ستون‌ها با تزریق ng3(fmol2) از محصول هضم‌شدۀ pUC18 توسط آنزیم محدودگر Hae III به سیستم (با سرعت جریان و دمای ثابت و مشابه فوق) آزمایش می‌شود. برنامۀ شیب لازم برای این آزمایش به‌صورت زیر می‌باشد:

۰٫۰–۳٫۰ min 35–۵۰% eluent B

۳٫۰–۱۰٫۰ min 50–۶۲% eluent B

  1. ستون‌ها را باید با محلول B 95% به مدت ۳۰ ثانیه شستشو داد. در اینجا نیز باید قطعات ۲۵۷، ۲۶۷، ۴۳۴، ۴۵۸ جفت بازی را با وضوح بالا در کروماتوگرام UV به دست آورد.

 

آنالیز کروماتوگرافی  dHPLC با استفاده از ستون‌های کاپیلاری

در کروماتوگرافی با استفاده از لوله موئینه، محلول فاز متحرک با غلظت استونیتریل کمتری مورد استفاده قرار می‌گیرد، زیرا سطح PS/DVB ستون کاپیلاری در مقایسه با ستون‌های معمولی قطبی‌تر می‌باشد. از آنجا که DNA دورشته‌ای پایدارتر از دیگر مواد آلی است، بنابراین باید دمای بالاتری را برای دناتوره‌سازی نسبی آن به سیستم داد. معمولاً یک افزایش دو درجه سلسیوس برای نیل به این هدف کافی است.

  1. سیستم HPLC با جریان min/Lµ۳ و دما و شیب غلظت اولیه، تنظیم می‌شود.
  2. برای شروع آنالیز، برنامۀ شیب غلظت به‌صورت زیر به پمپ دستگاه داده می‌شود:

۰٫۰–۰٫۵ min 43–۵۰% eluent B

۰٫۵–۴٫۰ min 50–۵۴% eluent B

  1.  nL500-1000 از محصول PCR به درون ستون کاپیلاری تزریق می‌شود.
  2. از هنگام تزریق نمونه، کار ثبت کروماتوگرام توسط آشکارساز UV با طول‌موج nm254 آغاز می‌شود.
  3. بعد از آزمایش هر نمونه، ستون به مدت ۱ دقیقه با محلول B 95% شسته می‌شود.

 

HPLC تحت شرایط دناتوره‌سازی کامل:

تمام تجهیزاتی که قبلاً گفته شد، در این روش نیز به کار می‌رود.

  1. به‌منظور اطمینان از دناتوره شدن کامل نمونه، دمای ستون بر روی̊ ۷۵ سلسیوس تنظیم می‌شود.
  2. بعد از تنظیم جریان محلول B 29% با سرعت min/Lµ۳ به مدت ۵ دقیقه، یک شیب خطی از غلظت به‌صورت زیر به دستگاه داده می‌شود:

۰٫۰–۱۰٫ min 29–۳۹% eluent B

  1. nL500 از محصول PCR را به دستگاه تزریق نموده و کروماتوگرام توسط آشکارساز ثبت می‌شود.

 

ارزیابی کروماتوگرام:

شکل زیر مثالی از افتراق آللی براساس جداسازی زنجیره‌های تک‌رشته‌ای محصول PCR به طول ۶۲ جفت بازی است. این زنجیره‌ها دارای جهش G به T بوده که با تکنیک dHPLC کاپیلاری و تحت شرایط دناتوره‌سازی کامل آشکار شده است.

در قسمت A و B از شکل زیر نمونه‌های هتروزیگوت نشان داده شده است. در اینجا هر دو زنجیره‌های تک‌رشته‌ای که کاملاً دناتوره شده‌اند، به‌طور کامل توسط IP-RP-HPLC از هم جدا شده‌اند. در نمونه‌های هتروزیگوت سه قله مشاهده می‌شود که مربوط به وجود دو نوع تک رشته می‌باشد. تغییر یک باز منجر به تغییر الگوی نگهداری تک رشته شده و افتراق نمونه حاوی جهش از نمونۀ وحشی (طبیعی) را موجب می‌شود.

کروماتوگرافی

شکل ۷: افتراق آللی براساس جداسازی زنجیره‌های تک‌رشته‌ای

در تکنیک dHPLC با دناتوره‌سازی کامل، به‌منظور تکثیر قطعۀ موردنظر، از پرایمر‌های با طول کمتر از ۲۰ باز استفاده می‌شود. کاهش اختصاصیت پرایمر موجب تکثیر قطعات اضافی شده و در کروماتوگرام به‌صورت قله‌های اضافی دیده می‌شود.

 

نکات قابل‌توجه:

  1. از برخورد و تماس مستقیم ستون با دیوارۀ فلزی آون باید پرهیز نمود، زیرا سطح آون از هوای درون آن گرم‌تر است، بنابراین این تماس موجب گرم‌ شدن بیش از حد فاز متحرک شده و تکرارپذیری آزمایش را کاهش می‌دهد.
  2. دمای بهینۀ این تکنیک̊ ۶۸-۴۸ سلسیوس می‌باشد. به‌منظور به دست آوردن دمای بهینه، نمونۀ آزمایش را به دستگاه می‌دهند و کم‌کم دما را افزایش داده تا زمان نگهداری قلۀ مربوط به زنجیرۀ دورشته‌ای به حداقل (حدود ۱ دقیقه) برسد. در این هنگام، وجود باز ناجور با مشاهدۀ یک یا دو قله بلافاصله قبل از قله زنجیرۀ دورشته‌ای مشخص می‌شود. باید مراقب نواحی با دمای ذوب پایین بود که از دید محقق مخفی نماند. اگر زنجیره‌ها به‌طور کامل دناتوره شوند، احتمال از دست دادن جهش‌های موجود در این نواحی بالا می‌باشد.

[۱] Denaturing high performance liquid chromatography

[۲] Wild type

[۳] Mutant

[۴] partially denaturing HPLC

[۵] Ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography

[۶] Solvophobic

[۷] Electrospray ionization mass spectrometry

[۸] Peak

[۹] Melting domain

[۱۰] Capillary

[۱۱] Injector

مقدمه‌ای بر تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع آن

تکنیک‌های تعیین توالی اسید نوکلئیک

تکنیک واکنش ‘‍‍۵ نوکلئاز

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • دناتوره
  • زهرا کریمی
  • كروماتوگرافي مايع

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *