رديابی آسپرژيلوس‌‍‌‌ها در نمونه‌های BAL با استفاده از روش‌های قارچ‌شناختی
(آزمايش مستقيم و کشت) و روش‌های مولکولی (Nested-PCR و Real-time PCR)
به‌‍‌‌‌‍‌‌منظور تشخيص سريع و دقيق آسپرژيلوزيس ريوی در بيماران مستعد
دکتر حسین زرین‌فر
استادیار قارچ‌شناسی پزشکی، دانشکده پزشکی، مرکز تحقیقات آلرژی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد
مقدمه و اهداف:
عفونت‌های مهاجم قارچی ریوی به علت استفاده وسیع از آنتی‌بیوتیک‌ها و کورتیکواستروئیدها بخصوص در بیماران دارای بدخیمی‌های خونی، گیرندگان پیوند مغز استخوان، بیماران اتوایمیون و مصرف‌کنندگان کورتیکواستروئیدها، گیرندگان پیوند بافت سخت، بیماران بستری در بخش ICU و نیز بیماران دارای سرطان بافت سخت و به نسبت کمتر در بیماران دارای اختلالات ریوی تنفسی در حال افزایش است. ازجمله این عفونت‌ها آسپرژیلوزیس ریوی مهاجم (IPA) است که توسط گونه‌های مختلف آسپرژیلوس به‌ویژه آسپرژیلوس فومیگاتوس و آسپرژیلوس فلاووس ایجاد می‌گردد. اهداف این مطالعه عبارت بود از بررسی امکان پایه‌ریزی تست تشخيص سريع، حساس و ويژه آسپرژيلوزيس ريوی (PA) در بيماران مستعد با استفاده از روش‌های قارچ شناختی (آزمايش مستقيم و کشت) و مولکولی (Nested-PCR و Real-time PCR) و نیز بررسی بروز عفونت‌های آسپرژيلوسی در گروه‌های مختلف بيماران مستعد. در این مطالعه برای پایه‌ریزی روش‌های مولکولی برای تشخیص آسپرژیلوزیس ریوی در ایران، چهار روش آزمایش مستـقیم، کشت، Nested-PCR و Real-time PCR بر روی نمونه‌های لاواژ برونش ریوی (BAL) مورد استفاده قرار گرفت.
واژه‌های کلیدی: BAL،IPA ،Nested-PCR ،Real-time PCR ، آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس فومیگاتوس
کلنی آسپرجیلوس فلاووس
کلنی آسپرجیلوس فلاووس
کلنی آسپرجیلوس فلاووس
روش کار:
428 نمونه BAL در طی یک دوره 16 ماهه از بیمارانی که برای برونکوسکوپی به بخش ریه بیمارستان شریعتی مراجعه کرده بودند و نیز بیمارانی که به آزمایشگاه دانشکده بهداشت ارسال شده بودند، جمع‌آوری گردید. بعد از آماده‌سازی نمونه‌های BAL، 150 میکرولیتر آن با افزودن پتاس 20% مورد آزمایش مستقیم میکروسکوپی قرار گرفت و 150 میکرولیتر نیز با تلقیح در محیط‌های کشت سابورو دکستروز آگار 4% و عصاره مغز و قلب آگار (BHI) جهت رشد قارچ‌ها بررسی شدند. برای ردیابی DNA آسپرژیلوس فومیگاتوس و آسپرژیلوس فلاووس، پس از هموژن کردن نمونه‌های BAL، ابتدا 4 بار فریز- ذوب و خرد شده و سپس به روش فنل کلروفرم و تعداد معدودی هم با کیت NucliSENS، DNA استخراج و تخلیص گردید. در روش Nested-PCR از ژن هدف ITS1 در rDNA و در روش Real-time PCR با تکنیک TaqMan از ژن β-tubulin استفاده گردید. برای تهیه پلاسمیدها به‌عنوان استاندارد و بررسی کمی واکنش Real-time PCR از کلونینگ (TA cloning) استفاده گردید. برای اطمینان از صحت نتایج بدست آمده در روش‌های مولکولی، برخی از نتایج Nested-PCR و پلاسمیدها نیز تعیین توالی (Sequencing) شدند. حساسیت و ویژگی تست‌های PCR با استفاده از رقت‌های سریالی تهیه‌شده با اسپور و میسلیوم و نیز سوش‌های استاندارد تعیین گردید. برای شناسایی برخی مخمرهای رشد کرده در محیط کشت، DNA با استفاده از فیلتر FTA از کشت تازه استخراج شد و ناحیه ITS مخمرها با پرایمرهای عمومی ITS1 و ITS4 تقویت و پس از برش با آنزیم محدودالاثر MspI و برحسب الگوی الکتروفورتیک محصولات RFLP، گونه مخمرها تعیین شد.
دستگاه زایشی آسپرجیلوس فلاووس
دستگاه زایشی آسپرجیلوس فلاووس
نتایج:
از بین 428 نمونه مورد بررسی، 21 مورد (5%) آزمایش مستقیم مثبت (19 مورد میسلیوم با تیغه میانی و 2 مورد میسلیوم بدون تیغه میانی)، 61 مورد (14/2%) کشت مثبت (35 مورد آسپرژیلوس فلاووس، 7 مورد آسپرژیلوس نایجر، 6 مورد آسپرژیلوس فومیگاتوس، 6 مورد آسپرژیلوس فلاووس/آسپرژیلوس نایجر (به‌صورت مخلوط)، 1 مورد آسپرژیلوس ترئوس، 3 مورد پنی‌سیلیوم، 2 مورد رایزوپوس و 1 مورد فوزاریوم)، 73 مورد (17%) Real-time PCR مثبت و 193 مورد (45%) Nested PCR مثبت شناسایی گردید. همچنین در آزمایش مستقیم 81 مورد (19%) میسلیوم کاذب و در کشت 66 مورد کاندیدا و 90 مورد مخمر مشاهده گردید و در بررسی 75 کلنی با روش PCR-RFLP، 37 مورد (49/3%) کاندیدا آلبیکنس، 20 مورد (26/8%) کاندیدا تروپیکالیس، 12 مورد (16%) کاندیدا گلابراتا، 4 مورد (5/3%) کاندیدا کروزئی، 1 مورد (1/3%) کاندیدا پاراپسیلوزیس و 1 مورد (1/3%) کاندیدا پاراپسیلوزیس شناسایی گردید.
از بین 22 نمونه (19 نمونه BAL و 3 نمونه بافت) دارای آزمایش مستقیم مثبت (میسلیوم با تیغه میانی)، در 20 مورد کشت مثبت، 17 مورد Nested-PCR مثبت و 7 مورد Real-time PCR مثبت مشاهده گردید که با در نظر گرفتن موارد آزمایــش مستقیم مثبت به‌عنوان استاندارد، حساسیت کشت 91%، Nested-PCR 94% و Real-time PCR 39% برآورد گردید (به علت در اختیار نداشتن DNA، بر روی 4 نمونه تست‌های مولکولی انجام نشد). در این مطالعه میزان بروز آسپرژیلوزیس ریوی در دریافت‌کنندگان پیوند مغز استخوان با انسیدانس 27/7% و بعد از آن در گيرندگان پيوند بافت سخت با انسیدانس 25% نسبت به بقیه بیماران مستعد، بالاتر بود. شایع‌ترین عامل آسپرژیلوزیس ریوی یا کلنیزاسیون در بین گروه‌های مختلف بیماران آسپرژیلوس فلاووس تشخیص داده شد.
آسپرجیلوس فومیگاتوس برروی محیط سابورو دکستروز آگار
آسپرجیلوس فومیگاتوس بر روی محیط مالت اکسترکت آگار
دستگاه زایشی آسپرجیلوس فومیگاتوس
آسپرجیلوس نایجر
دستگاه زایشی آسپرجیلوس نایجر
بحث و نتیجه‌گیری:
در بین نمونه‌های دارای آزمایش مستقیم مثبت، 11 مورد (61%) با هر دو روش کشت و Nested-PCR و 6 مورد (33%) با هر سه روش کشت، Nested-PCR و Real-time PCR همخوانی داشتند. با توجه به حساسیت بیش‌ازحد روش Nested-PCR و اینکه احتمالاً اسپورهای محیطی و کلنیزاسیون نیز موجب مثبت شدن می‌گردند، این روش برای نمونه‌های BAL توصیه نمی‌شود، هرچند ممکن است برای نمونه‌های استریل مثل سرم، خون و مایع مغزی نخاعی بسیار مفید باشد. از سویی دیگر با توجه به قابلیت بررسی کمی روش Real-time PCR، می‌توان با در نظر گرفتن موارد واقعاً مثبت (Proven) و نیز افراد سالم و با در نظر گرفتن وضعیت بالینی و زمینه‌ای بیماران آن را طوری اصلاح کرد که بتواند به‌صورت حساس‌تر و ویژه‌تری عمل نماید. بااین‌حال، در یک بیمار با سرکوب ایمنی حتی نتیجه مثبت یک روش مولکولی با وجود منفی بودن دیگر روش‌های سنتی می‌تواند ارزشمند باشد. در این مطالعه بعد از آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر به‌عنوان دومین عامل در کشت شناسایی شد که بهتر است در تحقیقات آینده از روش‌های مولکولی نیز برای شناسایی آن استفاده کرد.
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام