تکنیک واکنش ‘‍‍۵ نوکلئاز

5′ nuclease

تکنیک واکنش ‍‍۵ نوکلئاز

 دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا…(عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

 

 

در این تکنیک پس از مخلوط کردن نمونه و دیگر ترکیبات واکنش، آزمایش در میکروتیوب دربسته انجام شده و احتیاجی به فرایندهای بعد از PCR نیست. پس از اتمام واکنش، با اندازه‌گیری فلورسنت، نتیجۀ آزمایش مشخص خواهد شد. با حذف فرایندهای پس از PCR، زمان آزمایش،‌ میزان کار، هزینه آزمایش، احتمال آلودگی متقاطع و منابع خطا کاهش خواهد یافت. حساسیت روش به اندازۀ PCR است، در نتیجه با میزان خیلی کم DNA می‌توان آزمایش را انجام داد. اندازه‌گیری میزان فلورسنت به‌عنوان نتیجۀ آزمایش موجب می‌شود که بتوان در واحد زمان تعداد بیشتری SNP را مورد شناسایی قرار داد.

در واکنش ‘۵ نوکلئاز[۱] که اولین بار توسط Holland و همکاران توضیح داده شد، یک کاوشگر به ترکیبات واکنش PCR اضافه شده و در هنگام واکنش PCR، با فعالیت ‘۵ نوکلئازی آنزیم Taq پلی‌مراز تجزیه می‌شود. کاوشگر فلورسنتۀ این واکنش دارای رنگ فلوروفور گزارشگر و خاموش‌کننده[۲] می‌باشد. نزدیکی خاموش‌کننده، موجب کاهش پیغام فلورسنت می‌گردد. برش کاوشگر فلوروژن در طی PCR، موجب آزاد شدن فلوروفور و تشدید پیغام فلورسنس می‌شود (شکل ۱). امروزه دستگاه‌های ترموسایکلر به سیستم آشکارسازی فلورسنس مجهز بوده و طی هر سیکل PCR، افزایش فلورسنت را به‌صورت زمان واقعی[۳] نشان می‌دهند.

 '‍‍5 نوکلئاز

شکل ۱: انجام واکنش PCR و تشخیص محصول به کمک کاوشگر فلوروژن در واکنش ‍‍۵ نوکلئاز. مراحل اصلی این واکنش پلیمریزاسیون، جایگزینی رشته و برش است. دو رنگ گزارشگر و خاموش‌کننده به کاوشگر متصل شده است و تا هنگامی که این اتصال برقرار است، تهییج گزارشگر رخ نمی‌دهد. در هر چرخه از طویل سازی، آنزیم DNA پلیمراز گزارشگر را از کاوشگر بریده و جدا می‌کند. گزارشگر آزاد رنگ فلورسانس از خود ساطع می‌کند.

 

تشخیص SNP

در سیستم‌های دو آللی، کاوشگرهای اختصاصی هر آلل به واکنش PCR اضافه می‌شوند. ازآنجاکه هر کاوشگر یک فلوروفور اختصاصی با رنگ مشخص دارد، بنابراین شناسایی آن‌ها آسان خواهد بود. عدم اتصال یک باز بین کاوشگر و هدف و ایجاد یک باز ناجور، موجب کاهش دورگه‌سازی و عدم برش کاوشگر می‌شود. افزایش هرکدام از رنگ‌های فلورسنت، نشان‌دهنده وجود آن آلل در نمونه می‌باشد. همچنین افزایش هر دو رنگ، حکایت از هتروزیگوسیتی نمونه دارد (شکل ۲).

چندین فاکتور در تشخیص و افتراق آلل‌ها- بر اساس عدم اتصال یک باز- دخیل می‌باشند. یکی از این عوامل تأثیر ترمودینامیکی عدم اتصال یک باز بر روی تشکیل دورگه می‌باشد. یک کاوشگر حاوی باز ناجور، دمای ذوب (Tm) پائین‌تری نسبت به یک کاوشگر کاملاً متصل را دارا می‌باشد، به همین دلیل در انتخاب دمای اتصال پرایمر و طویل‌سازی باید دقت بیشتری شود. دوم این‌که واکنش تحت شرایط رقابتی انجام می‌‌شود، زیرا هر دو کاوشگر در واکنش حضور دارند، بنابراین تا حدودی کاوشگری که به‌طور کامل به DNA هدف متصل می‌شود، از اتصال کاوشگر حاوی باز ناجور ممانعت به عمل می‌آورد. سوم این‌که انتهای ‘۵ کاوشگر باید قبل از برش نوکلئاز، از هدف جدا و جابه‌جا شود. فعالیت ‘۵ نوکلئازی آنزیم Taq پلی‌مراز، ساختار چنگال مانند حاصل از جدا شدن ۳-۱ نوکلئوتید انتهای ‘۵ کاوشگر را شناسایی می‌کند. در این حالت که چند نوکلئوتید ابتدای کاوشگر جدا شده است، کاوشگر حاوی باز ناجور سریع‌تر از کاوشگر کاملاً متصل، جدا خواهد شد. این بدان معناست که زمان کمتری برای برش کاوشگر حاوی باز ناجور وجود دارد؛ به عبارت دیگر وجود باز ناجور موجب می‌شود تا کاوشگر به‌جای بریده شدن، از هدف جدا گردد.

 '‍‍5 نوکلئاز

شکل ۲: افتراق آللی به کمک واکنش ۵ نوکلئاز. حضور یک جفت باز ناجور بین کاوشگر و توالی هدف موجب ناپایداری این اتصال شده و کارآیی برش آنزیمی را کاهش می‌دهد.

 

 

مواد لازم جهت انجام واکنش ۵ نوکلئاز:

۱: کاوشگر TaqMan MGB: همان‌طور که قبلاً نیز ذکر شد، یکی از نکات کلیدی به‌کارگیری تکنیک ‘۵ نوکلئاز برای افتراق بین آلل‌ها، استفاده از کاوشگر حاوی باز ناجور می‌باشد. این کاوشگر دارای دمای ذوب (Tm) پایین‌تری نسبت به کاوشگر با اتصال کامل می‌باشد. در این‌جا اختلافی بین دمای ذوب (∆Tm) دو پرایمر، تحت عنوان اختلاف دمای پنجره[۴] وجود دارد. افتراق بین آلل‌ها با استفاده از این دمای پنجره صورت خواهد گرفت؛ بدین صورت که دمای اتصال پرایمر و دمای طویل‌سازی را معادل این دمای پنجره می‌گیرند. هر چه کاوشگر بزرگ‌تر باشد، نقش یک باز ناجور در اتصال کاوشگر کمتر می‌شود. این بدان معناست که در کاوشگرهای بزرگ‌تر، دمای پنجره کوچک‌تر است، زیرا دمای ذوب دو پرایمر نزدیک می‌باشند و در نتیجه کاوشگرهای کوچک بهتر می‌توانند بین آلل‌ها افتراق قائل شوند.

دانشمندان دریافته‌اند که با اتصال یک ماده متصل‌شونده به شیار کوچک [۵](MGB) اولیگونوکلئوتید، ساختار دو رشته‌ای پایدار شده و دمای ذوب پرایمر به‌شدت افزایش خواهد یافت. کاوشگرهای به‌کاررفته در این تکنیک در انتهای ‘۳ خود دارای MGB می‌باشند. این ماده موجب بهبود دمای ذوب کاوشگرهای کوچک (۲۰-۱۳ نوکلئوتیدی) می‌شود، بنابراین استفاده از MGB باعث می‌شود که بتوان از کاوشگرهای کوچک برای افتراق آلل‌ها بهره جست. در یک مطالعه‌، دمای ذوب ۶۰ کاوشگر ۱۳-۱۰ نوکلئوتیدی حاوی MGB اندازه‌گیری شد. در این آزمایش، اختلاف دمای ذوب کاوشگرهای کاملاً متصل و کاوشگرهای حاوی باز ناجور به‌طور متوسط ۹/۷ درجه سلسیوس بود. این اختلاف دمای گسترده، طراحی کاوشگر را آسان می‌کند، به‌طوری‌که دمای ذوب کاوشگر کاملاً متصل، بالاتر از دمای اتصال پرایمر و دمای طویل‌سازی (معمولاً ̊۶۰) و دمای ذوب کاوشگر حاوی باز ناجور پایین‌تر از آن قرار می‌گیرد، در نتیجه کاوشگر کاملاً متصل، پیغام‌های قوی از خود ساطع می‌کند. درحالی‌که پیغام کاوشگر حاوی فقط یک باز ناجور، بسیار ضعیف خواهد بود.

 

۲: ترکیبات PCR: تمام ترکیبات موردنیاز واکنش PCR در یک میکروتیوب ریخته شده و به‌صورت تجاری در دسترس می‌باشد، بنابراین باید مرحله بهینه‌سازی[۶] ترکیبات برای هر نمونه را حذف نمود. این امر با توسعۀ روش‌ها و رهنمودهای اختصاصی انتخاب پرایمر و کاوشگر محقق شده است. اگر این رهنمودها به‌درستی رعایت شوند، مواد مورد استفاده در TaqMan PCR، غلظت پرایمر و کاوشگر و برنامۀ دستگاه ترموسایکلر به‌درستی کار کرده و آزمایش جواب خواهد داد. مهم‌‌ترین قسمت این رهنمود مربوط به اندازه محصول PCR می‌باشد، به عبارت دیگر اندازۀ محصولات PCR باید تا حد ممکن کوچک باشند (۱۵۰-۵۰ جفت باز). این بدان معنا نیست که محصولات بزرگ‌تر با این تکنیک مورد آزمایش قرار نمی‌گیرند؛ بلکه برای قطعات بزرگ‌تر نیاز به بهینه‌سازی بیشتری می‌باشد. نکته دیگر این‌که در این تکنیک باید از DNA پلی‌مراز AmpliTaq® Gold استفاده شود، زیرا این پلی‌مراز به‌صورت Hot start بوده و در دمای بالا فعال می‌شود. این امر مانع ایجاد مشکلات و آرتیفکت‌هایی از قبیل دایمر پرایمر می‌گردد و در نتیجه طراحی پرایمر راحت‌تر صورت می‌گیرد.

محلول PCR حاوی تمام مواد موردنیاز در واکنش ‘۵ نوکلئاز، به استثناء کاوشگر، پرایمر و DNA نمونه می‌باشد. این محلول همچنین دارای AmpErase® UNG می‌باشد. این ماده موجب محافظت در برابر آلودگی شده و به‌عنوان مرجع داخلی برای حذف فلورسانس زمینه به کار می‌رود. بهتر است محلول حاصل را در دمای ̊ ۸-۲ نگهداری کرده تا نیازی به ذوب کردن مجدد آن نباشد.

 

نکات مورد توجه در طراحی کاوشگر:

  1. کاوشگر نباید در انتهای ‘۵ دارای گوانین باشد، زیرا گوانینی که در مجاورت رنگ فلوروفور قرار گرفته است، به‌عنوان یک خاموش‌کننده عمل کرده و حتی پس از برش کاوشگر نیز فلورسانس را خاموش خواهد کرد.
  2. با استفاده از نرم‌افزار، کاوشگری را انتخاب کنید که دمای ذوب آن ۶۷-۶۵ درجه سلسیوس باشد.
  3. کاوشگر هر چه کوچک‌تر باشد، بهتر است. دقت شود که کاوشگر کوچک‌تر از ۱۳ جفت باز نشود.
  4. نباید یک نوع باز به‌صورت پشت سر هم در کاوشگر قرار گیرد. این امر در مورد گوانین از اهمیت بیشتری برخوردار است. تکرار یک باز نباید به بیش از سه بار برسد.
  5. محل پلی‌مورفیک در مرکز کاوشگر قرار گیرد. اگر لازم است این قانون نقض شود، پس این محل در قسمت ‘۳ کاوشگر قرار گیرد. در این صورت باز ناجور در ناحیۀ اتصال به شیار کوچک قرار می‌گیرد. دقت شود هرگز این باز ناجور در اولین و دومین باز کاوشگر قرار نگیرد.
  6. در مورد کاوشگرهایی که بیش از ۵۰% CG دارند، بهتر است میزان C آن‌ها بیشتر از G باشد.

 

نکات مهم در طراحی پرایمر:

  • دمای ذوب پرایمر در حدود ۶۰-۵۸ درجه سلسیوس باشد.
  • نباید یک نوع باز به‌صورت پشت سر هم قرار گیرد. این امر در مورد گوانین از اهمیت بیشتری برخوردار است. تکرار یک باز نباید به بیش از سه بار برسد.
  • میزان گوانین+ سیتوزین ۸۰-۲۰% باشد.
  • هر دو پرایمر تا حد ممکن باید در نزدیکی کاوشگر قرار گیرند، ولی بر روی هم قرار نگیرند.
  • در ۵ نوکلئوتید انتهای ‘۳ نباید بیش از دو باز گوانین+ سیتوزین قرار گیرد.

برای طراحی پرایمر و کاوشگر از نرم‌افزار Primer Express Version 1.5 می‌توان استفاده نمود.

 

روش کار برای حجم lµ۲۵:

پس از طراحی دقیق پرایمر و کاوشگر، استفاده از محلول PCR TaqMan و اضافه نمودن nM200 کاوشگر و nM900 پرایمر، واکنش با اطمینان کامل انجام خواهد شد. به‌طور معمول مخلوط کاوشگر و پرایمر را با غلظت X10 به‌صورت زیر تهیه می‌‌کنند:

۲ µM VIC Probe

 ۲ µM FAM Probe

۹µM Forward Primer

۹ µM Reverse Primer

۱۰ mM Tris-HCl, pH 8.0

۱ mM EDTA

این محلول در دمای ۲۰- درجه سلسیوس به مدت یک سال پایدار خواهد بود. دقت شود که هنگام استفاده، محلول با کمترین مواجهه با نور- به‌خصوص نور مستقیم آفتاب- ذوب شود. پس از ذوب، محلول به‌آرامی مخلوط می‌شود. به‌سرعت بقیۀ مخلوط به فریزر ۲۰- درجه منتقل می‌شود.

 

سایر مواد برای انجام آزمایش بر روی ۹۶ نمونه به مقدار زیر می‌باشد:

۱۳۰۰ µL 2X TaqMan Universal PCR Master Mix

۲۶۰ µL10X Probe/Primer Mix

۵۲۰ µL H2O

µl5 از DNA ژنومی (با غلظت ng/µl10-1) را درون چاهک پلیت ریخته و سپس µl20 از محلول فوق را به آن اضافه کنید. روی پلیت را پوشانده و از نور محافظت کنید. پلیت را تا ۷۲ ساعت در دمای ۴ درجه سلسیوس می‌توان نگهداری کرد.

پلیت را درون دستگاه ترموسیکلر قرار داده و برنامه زیر به دستگاه داده ‌شود:

 '‍‍5 نوکلئاز

 

اگر مقدار DNA کمتر از ng10 باشد، تعداد سیکل‌های PCR به ۴۰ بار افزایش خواهد یافت.

نرم‌افزار SDS نتایج فلورسانس VIC را در مقابل FAM نشان می‌دهد. در نمودار حاصل از این نرم‌افزار، حداکثر تا ۴ بخش مشاهده خواهد شد. این بخش‌ها شامل هموزیگوت آلل ۱، هموزیگوت آلل ۲، هتروزیگوت و نمونه‌های بدون DNA و PCR نشده می‌باشند.

در تشخیص SNP، موقعیت پلی‌مورفیسم، مکان کاوشگر را تعیین می‌کند، به همین دلیل شاید مجبور شوید کاوشگری را طراحی و انتخاب کنید که هیچ‌یک از شرایط ذکرشده را نداشته باشد.

[۱] ۵nuclease

[۲] Quencher

[۳] Real Time

[۴] ∆Tm window

[۵] Minor groove binder

[۶] Optimization

انواع روش‌های شناسایی جهش‌ها

تکنیک‌های شناسایی جهش‌ها

انواع تکنیک « واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)» و انواع آنزیم‌های DNA پلیمراز مقاوم به حرارت

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • '‍‍5 نوكلئاز
  • PCR
  • SNP
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی
  • كاوشگر

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *