اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (2)

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی

قسمت دوم: روش‌های اسپکتروفتومتری 

مهندس احسان درخشان نیا

Bme.ehsan@gmail.com

 

 

اسپكتروفتومتر

اشكال مختلف اسپكتروفتومتري در بيشتر وسايل آزمايشگاهي بيوشيمي، كاربرد دارند. به‌طور‌كلي عبارت اسپكتروفتومتر، به‌عنوان يك اصطلاح عام براي يك گروه يا يك طبقه از وسايل آزمايشگاهي بكار می‌رود كه فتومترها در اين گروه قرار دارند. دستگاه اسپكتروفتومتر از دو قسمت اسپكترومتر و فتومتر يا نورسنجي تشكيل شده است. اسپكترومتر بخشي است كه نوري با طول‌موج‌های مشخص بوجود آورده و شامل منبع نور، عدسی، شکاف‌ها و منوکروماتور می‌باشد و فتومتر از قسمت‌هاي سنجش نور و ضبط آن تشکیل شده است. اساس و مبناي روش‌هاي اسپكتروفتومتري بر روي خاصيت جذب انتخابي مواد يا نشر انرژي الكترومغناطيسي در طول‌موج‌های مختلف آنها بنا شده است.

 

اصول عملکرد دستگاه

به‌عنوان یک اصل پایه، نور نوعی از انرژی الکترومغناطیسي در نظر گرفته می‌شود. سرعت ثابت نور در فضا [C]، تقریباً m/s 10⁸×3 است. سرعت نور در صورت عبور از هر محيط شفاف ديگر، كمي كاهش مي‌يابد و از معادلة زير مي‌توان سرعت آن را بدست آورد:

به‌طوری‌که:

v₀، سرعت نور ورودي از هر محيط يا وسيله و n، شاخص بازتاب است که مقدار عددي آن معمولاً بین 1 تا 2/5 می‌باشد.

انرژی الکترومغناطیسي طیف وسیعی از طول‌موج‌ها را دارد که در جدول ذیل به برخی از آنها اشاره شده است:

 

درنتيجة عبور يا برخورد نور با محيط‌هاي مختلف یکی از پدیده‌های بازتاب، انکسار یا شکست، تجزیه، جذب، پخش، پلاریزه شدن و پدیده‌های دیگر اتفاق می‌افتد که با دستگاه‌ها و وسايل مختلف اندازه‌گيری می‌شود. جدول زیر محدودة طول‌موج‌های ديگر را نشان مي‌دهد که در آزمايش‌هاي اسپكتروفتومتري استفاده می‌شوند.

 

با توجه به برخورد نور و ماده، شكل ۱ در توضيح پيچيدگي پديده‌اي كه رخ مي‌دهد، كمك می‌کند. شكل نشان مي‌دهد كه نور ورودی [I₀] می‌تواند تغيير حالت‌های متعددي پیدا کند؛ می‌تواند منعكس یا بازتاب شود [I_r]، عبور کند [I_t]، پخش شود يا جذب شود و يا مستقيماً به صورت فلوئورسانس ساطع شود [I_f]. اساس كار اسپكتروفتومترها اصولاً بر جذب و عبور نور استوار است. براي درك اين موضوع قانون بيرـ لامبرت را مرور مي‌كنيم.

شکل ۱. برخورد نور با ماده

 

قانون بيرو يا بيرـ لامبرت رابطة بين غلظت نمونه و شدت نوری که از آن عبورمی‌کند را نشان مي دهد. با توجه به اين قانون، دو حالت وجود دارد: عبور کردن[T] و جذب کردن [A]

عبور [T]، بخشی از نور ورودی با طول‌موج مشخص است كه از داخل نمونه عبور مي‌كند.

 

که ، شدت نور عبور کرده (خروجي) و ، شدت نور اوليه یا ورودی است.

تعداد مولکول‌های جاذب نور در یک نمونه متناسب با ميزان جذب آن در نمونه است و به‌صورت رابطة رياضي زير بيان مي‌شود:

A = ε × l × c

که در رابطه بالا:

A، جذب قابل اندازه‌گیری نور

‌ε، ضريب جذب

‌l،‌ طول مسير عبور نور در نمونه و

c،‌ غلظت نمونه است.

رابطة بين جذب نور (T) و عبور (A) آن با معادلة زير نشان داده می‌شود:

 

طرح زير (شکل ۲) پديده جذب را توضيح مي‌دهد:

شکل ۲. پديده جذب

منحنی‌های ارائه شده در زير نمايانگر مدلي است كه چگونه مقدار جذب (A) و عبور نور (T) در اثر غلظت (C) بر اساس قانون بير تغيير مي‌كند (شکل ۳ و ۴).

شکل ۳. منحني عبور نور بر اساس غلظت

 

شکل ۴. منحني جذب نور بر اساس غلظت

 

همان‌طور که مشخص است با افزايش غلظت نمونه، ميزان عبور نور كم و جذب بيشتر می‌شود.

اجزاء اسپکتروفتومتر

شكل ۵ و ۶ دو نمونه شماي كلي از يك دستگاه اسپكتروفتومتر را نشان مي‌دهند.

شکل ۵. شمای کلی یک دستگاه اسپکتروفتومتر

شکل ۶. شمای کلی یک دستگاه اسپکتروفتومتر

 

چنانچه در این شکل‌ها ملاحظه می‌شود، منبع انرژي نوراني، نور لازم را براي آناليز نمونه، حاصل می‌نماید. براي اينكه نمونه را در مسير انرژي حاصله از منبع تغذيه قرار دهند، آن را در داخل لوله آزمايش (كووت) قرار داده و سپس نور به آشكارساز رسيده و از آنجا به خروجي دستگاه می‌رسد كه نمايانگر مقدار انرژي رسيده به آشكارساز است. در این روش با استفاده از خواص جذب انرژي ماده مي‌توان غلظت مواد تشکیل‌دهنده آن را به دست آورد.

در مراحل گسترده‌تر، نمونه‌هايي كه از بيماران گرفته می‌شود   به دليل اينكه اين نمونه‌ها هيچ‌گونه خاصيت جذب انتخابي انرژي را ندارند، بنابراين مي‌بايست كه يك عامل خارجي به نمونه اضافه شود و پس از آن، نمونه، مورد تجزيه و تحليل قرار گيرد.

 

قسمت‌های مختلف یا اجزای داخلی یک دستگاه اسپکتروفتومتر عبارتند از:

1. منبع انرژی الکتریکی: در اسپکتروفتومتر برای ایجاد نور، احتیاج به یک منبع انرژی الکتریکی ثابت است. این منبع می‌تواند باطری خشک و یا مرطوب و یا جریان الکتریکی متناوب– AC باشد.

 

2. منبع نوری –Light Source: در اکثر اسپکتروفتومترها منبع انرژی نورانی برای تولید نور مرئی،‌ لامپ تنگستن، برای تولید نور ماورا بنفش، لامپ دوتریوم و برای تولید نور با طیف مرئی و ماوراء بنفش لامپ هالوژنه به‌کار می‌رود. تفاوت میان انواع لامپ‌های مورد استفاده بیشتر مربوط به گستره طیف طول‌موج تولیدی و عمر مفید آنها می‌باشد، به‌عنوان مثال لامپ هالوژنه در مقایسه با لامپ تنگستن علاوه بر تولید طیف طول‌موج نور ماوراء بنفش و نور مرئی از طول عمر خیلی بیشتری نسبت به لامپ تنگستن برخوردار می‌باشد.

 

3. عدسی و شکاف: نور، قبل از آنکه به منوکروماتور برخورد کند از عدسی‌ها و شکافی عبور می‌کند که نقش فیلتر داشته و وظیفه عدسی‌ها تعیین مسیر عبور نور می‌باشد. به‌جای عدسی‌ها از آیینه‌هایی که به شکل نیم‌دایره یا محدب ساخته شده‌اند نیز می‌توان استفاده نمود. در هر دستگاه اسپکتروفتومتری دو شکاف یا شیار وجود دارد؛ یکی را شکاف ورودی و دیگری را شکاف خروجی می‌نامند. وظیفه این شیارها کنترل میزان نور عبوری می‌باشد. شیارها نقش مهمی در جدا کردن نور دلخواه با طول‌موج مشخص دارند، به همین جهت اندازه آنها بسیار مهم است. در بیشتر دستگاه‌ها پیچی برای تنظیم این شکاف‌ها موجود است که توسط آن اندازه این شکاف‌ها را برحسب نیاز می‌توان تغییر داد. هرچه طول این شکاف‌ها بیشتر باشد، پهنای نور عبوری بیشتر بوده و دامنه طول‌موج آن نیز زیاد می‌باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که موردنیاز نیستند عبور خواهند کرد.

 

4. منوکروماتور: اشعه نورانی پس از عبور از عدسی‌ها و شکاف،‌ به وسیله‌ای که می‌تواند نور پلی‌کروم را به منوکروم تبدیل کند، وارد می‌شود که نوری با طول‌موج مشخص و انتخابی بوجود می‌آورد. برای تجزیه نور از فیلتر، منشور و یا گریتینگ استفاده می‌کنند. هرچه شکاف‌های گریتینگ باریک‌تر باشد طول‌موج‌های دقیق‌تری تولید می‌شود. زاویه برخورد نور با منشور یا گریتینگ، طول‌موج نور را مشخص می‌کند. فیلترها علاوه بر اینکه می‌توانند یک طول‌موج را جداسازی کنند، به‌عنوان حذف‌کننده نورهای ناخواسته در سیستم‌های دارای گریتینگ نیز استفاده می‌شوند. جنس فیلترها معمولاً از شیشه رنگی است.

 

5. منشور و گریتینگ: منشور،‌ یک شیشه با لبه‌های تیز و به شکل هرم می‌باشد که ممکن است از جنس شیشه، کوارتز، سدیم کلراید و یا سایر موادی که نور را عبور می‌دهـــــــند، باشد. گریتینگ- Grating وسیله‌ای‌ است که به‌صورت یک صفحه دارای شیارهای کوچک می‌باشد که هرکدام مانند یک منشور عمل می‌کنند. نور در اثر برخورد با این شیارها به طیفی از طول‌موج‌ها تجزیه می‌شود. در سیستم گریتینگ نور منعکس می‌شود ولی در منشور نور عبور می‌کند. در منشور شدت نور خروجی کمتر از گریتینگ می‌باشد. در اسپکتروفتومترهای مرئي منشور شیشه‌ای بیشتر بکار می‌رود. از منشور کوارتز برای ناحیه UV و از منشور سدیم کلراید یا پتاسیم برمید برای ناحیه IR یا مادون قرمز استفاده می‌شود. گریتینگ دارای پهنای باند مساوی در ناحیه UV و IR می‌باشد. این وسیله، یک صفحه شیشه‌ای صاف پوشیده شده با بخار آلیاژ مس و آلومینیوم می‌باشد که همان‌طور که گفته شد، هر شیار آن مانند یک منشور عمل می‌کند و هر شیار یک طیف رنگی ایجاد می‌کند.

 

6. ظرف محتوی نمونه- Cuvett: کووت معمولاً از جنس شیشه کوارتز یا پلاستیک است و برای اندازه‌گیری شدت رنگ محلول‌ها و بلانک بکار می‌رود. کووت‌های شیشه‌ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی بکار می‌روند و در ناحیه ماوراء بنفش از کووت کوارتز استفاده می‌شود. دو نوع کووت وجود دارد؛ کووت‌های مکعبی و گرد. کووت‌های مکعبی دارای سطح مقطع مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و کوارتز (برای نور ماوراء بنفش) می‌باشند. کووت‌های مکعب، گران هستند و کارکردن و تمیز نگه داشتن آنها دقت بسیار لازم دارد. کووت‌های گرد دارای سطح مقطع گرد بوده و بیشتر برای کارهای روزمره آزمایشگاهی استفاده می‌شوند.

 

7. نورسنج: نور پس از عبور از عدسی‌ها و شکاف و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می‌رود. وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می‌تاباند مقداری از آن به‌وسیله محلولی که درون لوله وجود دارد، جذب‌شده و بقیه آن به نورسنج می‌رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به الکتریکی قادر است مقدار جذب نور توسط محلول و یا درصد ترانس‌میتانس (میزان نور عبوری-T) آن را اندازه‌گیری نماید. نورسنج‌ها دارای انواع فتوشیمیایی، فتوالکتریکی و حرارتی می‌باشند. در ناحیه مرئی و ماوراءبنفش از نورسنج‌های فتوالکتریکی مانند فتوتیوب، فتومولتی‌پلایر تیوب و فتودیود استفاده می‌شود.

 

8. الکتریک‌سنج (آشکارساز): وظیفه این قسمت، اندازه‌گیری جریان الکتریکی نورسنج می‌باشد. این وسیله در دو نوع عقربه‌ای و دیجیتالی وجود دارد.

 

نگهداری اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومترها دستگاه‌های بسيار تخصصی و گران‌قیمتی هستند. درستی کارکرد آنها تا حد زياد به روش راه‌اندازی و استفاده بستگی دارد، همچنين دستگاه به شرايط محيط كار و كيفيت برق مورد استفاده وابسته است. نگهداری معمول برای این دستگاه‌ها متفاوت است و اقداماتی نظير نظافت دقیق اجزا تا انجام روش‌های اجرايی تخصصی توسط مهندسين يا تكنيسين‌ها را شامل می‌شود. انجام دستورالعمل سازنده و استفادة صحیح، مدت فعاليت دستگاه را افزایش مي‌دهد. در مدل‌های جدید، سازندگان، سیستم خودكار براي کالیبراسیون را در دستگاه‌ها طراحی کرده‌اند. در ادامه توصيه‌های مربوط به نگهداري عمومي گروه وسيعي از اسپكتروفتومترها ارائه شده است. نگهداری تخصصی این دستگاه‌ها برای هر مدل خاص تنها بر اساس توصیه‌های سازنده می‌تواند انجام گیرد. روش نگهداری اسپکتروفتومتر و تواتر كنترل‌هاي لازم به‌طور تقريبي به شرح زیر است:

 

ارزیابی محیط نصب دستگاه (سالانه)

محیطي که دستگاه در آنجا نصب شده است، باید بررسی شده و به لحاظ الکتریکی مورد ارزيابي قرار گیرد تا سلامت کاربر تضمین شود. این بررسی شامل ارزیابی وضعيت الکتریکی و ارزیابی فضای اختصاص داده شده به دستگاه در هنگام نصب می‌شود.

 

• ارزيابي نحوة نصب الكتريكي

اين اقدام جهت ايجاد اطمينان از موارد زير بايد انجام گیرد:

1. یک خروجی یا پریز با سیم زمین موجود باشد.
2. پریز باید در شرایط خوب بوده و طول سيم اتصال آن بیشتر از یک و نیم متر تا دستگاه نباشد.
3. ولتاژ باید مناسب بوده و بنا به توصيه سازنده نبايد بيشتر از 5 درصد نوسان داشته باشد.

این موارد باید توسط یک تكنسين و یا مهندس برق کنترل شوند.

 

• محل نصب و راه‌اندازی

1. مطمئن شوید دستگاهی مانند سانتریفوژ که ارتعاش ايجاد مي‌کند، در نزدیک دستگاه اسپکتروفتومتر قرار نگرفته است.
2. دمای مناسب اتاق برای عملکرد این دستگاه‌ها بین 10 تا 40 درجه سانتی‌گراد است. رطوبت زیاد، گرد و خاک و یا حرارت بالا برای کارکرد صحیح دستگاه مناسب نيست.
3. از راه‌اندازی و نصب دستگاه در محلی که نور مستقیم خورشید وجود دارد، بپرهیزید.
4. دستگاه را در محلی که میدان‌های مغناطیسی و یا تشعشع قوی الکترومغناطیسي وجود دارد، نصب نکنید.
5. در محل نصب نباید بخار و مواد خورنده وجود داشته باشند.

 

ارزیابی فيزيكي دستگاه (هر شش ماه)

نماي ظاهري اسپکتروفتومترها باید برای اطمينان از سالم بودن اجزا با توجه به توصیه‌های سازنده ارزیابی شود. مهم‌ترین این ارزیابی‌ها شامل موارد زير است:

1. از مناسب بودن میزی که دستگاه روی آن قرارگرفته است، مطمئن شوید.
2. ساختار كلي دستگاه را كنترل نماييد. از محكم ‌‌بودن دکمه‌ها، سوئیچ‌های كنترل، دريچه‌هاي مکانیکی و برچسب شناسايي صحيح آنها اطمينان حاصل نمایید.
3. از تمیز بودن لوازم جانبی، تَرَک ‌نداشتن و عملکرد مناسب و خوب آنها مطمئن شوید.
4. از تنظیمات مکانیکی اجزا مانند (پیچ، مهره و غيره) و شرايط مناسب آنها اطمینان حاصل نمایید.
5. از سلامت سیم‌های اتصال الکتریکی و عدم وجود شکاف و سوراخ در آنها مطمئن شوید. از اتصال خوب، عدم گسيختگي و شكاف در رابطه‌ای الكتريكي اطمينان حاصل نمایید.
6. مطمئن شوید که سطوح عايق‌كاري كابل‌هاي برق نشانه‌هاي فرسودگي و مستهلک بودن را ندارند.
7. اطمينان حاصل کنید که گرد و خاك، خوردگي، آلودگي و استهلاك در مسیر اتصال کابل‌های دستگاه وجود ندارد.
8. اجزای الکتریکی خارجی دستگاه را از نظر وجود گرمای بیش از حد کنترل کنید.

 

نگهداری عمومی

• نظافت مواد پاشیده شده

در صورت نشت مواد به محفظة نگهداری نمونه، لازم است مراحل زیر برای تمیز کردن، انجام داده شود:

1. دستگاه را خاموش کنید و کابل برق را از پریز بکشید.
2. از سرنگ برای تمیز کردن محفظه استفاده نمایید و تا حد امكان محلول را از محفظه خارج نمایید.
3. محفظة نگهداری نمونه را با پارچة نرم کتان خشك کنید.
4. قسمت خارجی دستگاه را با پارچة نرم و آغشته به آب تمیز نمایید. این نظافت شامل صفحه نمايش، صفحه کلید و کنترل‌ها است.

 

• نظافت کووت‌های کوارتز

مراحل زیر برای نگهداري کووت‌های کوارتز در شرایط مناسب توصیه شده است:

1. کووت‌ها را با محلول قلیایی رقیق‌شده مانند محلول NaOH 0/1 مولار و يک اسید رقيق مانند محلول HCl 0/1 مولار شستشو دهيد.
2. با آب مقطر چند بار کووت‌ها را شستشو دهید. همیشه از کووت‌های تمیز برای اندازه‌گيری ميزان جذب استفاده کنید.
3. اگر نمونه‌هایی که استفاده می‌کنید در کووت رسوب ايجاد می‌کنند، مراحل تمیز کردن آنها را با دقت بیشتری انجام دهید. بعضی سازندگان استفاده از شوینده‌های خاص را برای این منظور پیشنهاد می‌کنند.

 

• تعویض باتری

در مدل‌های مختلفی از اسپکتروفتومتر برای ذخيره اطلاعاتي مانند تاریخ و زمان آزمايش از باتری استفاده می‌شود. مراحل تعویض باتری نیز مانند تجهیزات دیگر بوده و عبارت است از:

1. علامت (شارژ کم باتری) روي صفحة نمايش را کنترل کنید.
2. اسپکتروفتومتر را خاموش کنید.
3. كابل اتصال به منبع تغذية الكتريكي را قطع كنيد.
4. باتری‌های کهنه را از محفظة باتری درآورید.
5. محل اتصال برق را تمیز کنید.
6. باتری‌های جدید كه داراي مشخصات يكسان با باتری اصلی هستند را جايگزين كنيد.
7. در محفظه را ببندید.
8. دستگاه را دوباره به منبع تغذيه الكتريكي (پريز) وصل كنيد.
9. تاریخ و زمان را دوباره تنظیم نمایید.

 

• تعویض لامپ دستگاه

لامپ یک جزء مصرفي با طول عمر محدود است و بايد زمان تعويض آن را از قبل پيش‌بيني كرد. دلایلي مانند سوختن، رسوب فلز روی سطح داخلی لامپ و تبخير سبب می‌شود نور ساطع‌شده از لامپ با ويژگي‌هاي ذکرشده دستگاه مطابقت نداشته باشد. مراحل تعویض لامپ بسته به مدل‌های مختلف دستگاه متفاوت است و باید به توصیه‌های سازنده توجه شود. مراحلی که در تمام مدل‌ها برای این كار مشترک است عبارت است از:

1. از وجود نقص و يا سوختن لامپ اطمینان حاصل نمایید. در دستگاه‌های مدل جدید، در صفحة نمايش یک علامت يا كد خطا ظاهر می‌شود که نشان‌دهنده سوختن لامپ است. در مدل‌های قدیم، نوری از لامپ ساطع نمي‌شود.
2. اسپکتروفتومتر را خاموش‌کنید.
3. کابل اتصال به منبع تغذيه الكتريكي را قطع كنيد.
4. پیچ بالای محفظة لامپ را بازکنید.
5. پیچی که لامپ را ثابت و محكم نگه می‌دارد را باز کنید.
6. پیچ‌هايی که سیم برق را به لامپ متصل می‌کند را باز کنید (در بعضی مدل‌ها، این کار ممکن است، لازم نباشد؛ چون كابل برق مستقيم به انتهاي لامپ متصل می‌شود).
7. لامپ جدید با ویژگی‌های لامپ اصلی را جایگزین کنید. از دستکش برای تعویض لامپ استفاده کنید تا اثرانگشت روی سطح لامپ باقی نماند.
8. کابل برق را دوباره به لامپ متصل نمایید.
9. پیچ‌هايی که لامپ را جای خود نگه می‌دارد را ببندید.
10. پیچ‌هايی که در محفظة لامپ را محكم می‌کند را ببندید.
11. دستگاه را دوباره به منبع تغذية الكتريكي وصل نمایید.
12. كليد را روشن کنید و مراحل کالیبراسیون توصیه‌شده توسط سازنده را دوباره انجام دهید.

 

اقدامات پیشگیرانه

این اقدامات باید با توصیه‌های سازنده در مورد نحوه نگهداری معمول و تواتر آن مطابقت داشته باشد. مجموعه‌اي از مراحل رايج که در آزمایشگاه قابل اجرا است عبارتند از:

1. سطوح خارجی اسپکتروفتومتر شامل کنترل‌ها و صفحة نمايش را تمیز کنید. این کار با استفاده از یک پارچة تمیز و نرم که به آب مقطر آغشته است، انجام می‌شود.
2. کابل برق را بازبینی و تمیز کنید.
3. از سالم و تمیز بودن لامپ اطمینان حاصل کنید، در غیر اين صورت، لامپ را (با توجه به مشخصات لامپ اولیه) تعویض کنید. در اسپکتروفتومترهای مدل‌های جديدتر، وضعیت و کارکرد لامپ به‌صورت خودكار به‌وسیله نرم‌افزاری كه عملكرد و شرايط دستگاه را کنترل می‌کند، مشخص مي‌شود. استفاده از اين نرم‌افزار، تعیین زمان تعويض لامپ را آسان مي‌كند. پس از تعویض لامپ، تنظیمات بعدی توصیه‌شده توسط سازنده را انجام دهید.
4. شرايط فيوز محافظ را کنترل کنید. قبل از باز کردن محفظه فیوز مطمئن شوید که اسپکتروفتومتر خاموش و اتصالات فیوز تمیز است. اگر لازم است، فیوز را با یک فيوز جديد که مطابق توصیه‌های سازنده است، جایگزین سازید.
5. دستگاه را در وضعيت فعال قرار دهید.
6. كليد روشن را فعال و 5 دقیقه زمان براي گرم شدن دستگاه درنظر بگیرید.
7. جريان برق را در موقعيت‌هاي روشن و خاموش كليد بررسی نمایید.
8. پانل جلو در دستگاه را با توجه به توصیه‌هاي سازنده کالیبر ‌کنید.
9. دقت و حساسیت دستگاه را تعيين نمایید.
10. آزمایش خطی بودن را (براساس قانون بير) انجام دهید.
11. اسپکتروفتومتر را به وضعيت اوليه برگردانید.

 

روش استفادة مناسب از اسپکتروفتومتر

1. اسپکتروفتومتر را در هر نوبت استفاده کاليبر نماييد.
2. در طول زمان اندازه‌گیری محفظة نمونه را بسته نگهدارید.
3. از استفادة مجدد کووت‌های یکبار مصرف خودداری کنید.
4. در طول‌موج پايين‌تر از 310 نانومتر فقط از کووت‌های کوارتز استفاده کنید.
5. اگر از حلال‌های آلی استفاده می‌کنید، از کووت‌های پلاستیکی استفاده نکنید
6. برای تهیة محلول‌هاي استاندارد از لوازم شیشه‌ای از جنس سيليکات بور و با کيفيت بالا استفاده کنید. در صورت امكان، از ظرف‌هاي شیشه‌ای دارای تركيبات اکسید سدیم خودداري کنید، چون این ترکیب درنتیجه تماس طولانی با محلول استاندارد جذب محلول شده و نتايج نادرست ایجاد می‌کند.
7. با احتیاط کووت‌های شیشه‌ای را پس از استفاده تمیز نمایید و از کووت‌هایي كه روي سطوح خارجي آنها خراشيدگي دارد، استفاده نکنید.
8. از معرف‌هاي با کیفیت مطلوب استفاده کنید. محلول‌هاي با کیفیت پایین، حتی در غلظت‌های بسيار کم آلودگی ایجاد می‌کنند. آب يا محلول‌هايي که برای رقیق‌سازی استفاده می‌شود، باید عاری از ناخالصی باشند.

 

فتومتر

اساس کار فتومتر همانند اسپکتروفتومتر است. در فتومتر، منوکروماتور فیلترهای شیشه‌ای هستند که بخش اعظم نور را جذب کرده و فقط طول‌موج‌های محدود موردنظر را عبور می‌دهند. فتومترهای پیشرفته دارای شش فیلتر رنگی ثابت بوده و قابلیت افزایش دو فیلتر دیگر را نیز دارند. فیلترهای نصب شده معمولاً دارای طول‌موج‌های 340، 405، 492، 520، 546، 578 و 623 نانومتر می‌باشند.

فتومترهای نسل جدید تقریباً نیمه اتوماتیک هستند؛ به این معنی که دارای انکوباتور 37 درجه با قابلیت برنامه‌ریزی جهت خوانش جذب نوری در زمان‌های متفاوت می‌باشند. قسمتی از واکنش آزمایش‌های آنزیمی که نیاز به خوانش متوالی در زمان‌های معین و در دمای ۳۷ درجه دارند در داخل دستگاه انجام می‌گیرد. بسیاری از فتومترها علاوه بر نمایشگرهای دیجیتالی، چاپگر نیز دارند.

 

عوامل ایجاد خطا در سیستم‌های فتومتری

مهم‌ترین عوامل ایجاد خطا در سیستم‌های فتومتری عبارتند از:

1. کیفیت نامناسب منبع نوری: به علت کارکرد بیش از میزان ساعت استاندارد و یا کثیف شدن جداره بیرونی لامپ
2. کیفیت نامناسب منوکروماتور: بیشتر به علت کثیفی فیلترها و گریتینگ توسط گردوغبار محیط ایجاد می‌شود.
3. اشکال در آشکارساز: به دلیل کثیفی و یا ضعیف شدن گیرنده‌های نوری آشکارساز این اشکال بوجود می‌آید.

 

کنترل کیفی اسپکتروفتومتر و فتومتر

مهم‌ترین مواردی که در اسپکتروفتومترها و فتومترها مورد ارزیابی قرار می‌گیرند عبارتند از:

صحت فتومتریک، صحت طول‌موج، خطی بودن، رانش فتومتری و نورهای ناخواسته

در ادامه به بررسی این موارد و موارد بیشتر می‌پردازیم.

 

1. صحت فتومتری

منظور از صحت فتومتری این است که آیا حداکثر جذب نوری به مقدار مشخص در طول‌موج خاص صورت می‌گیرد یا خیر. انجام این کار برای آزمایشگاه‌هایی که از استاندارد استفاده نمی‌کنند برای اطمینان از درستی جذب نوری دستگاه ضروری است. صحت فتومتری به عواملی چون توانایی لامپ در ارائه حداکثر تابش، پهنای طیف نور و نوع کیفیت منوکروماتور وابسته است. برای بررسی صحت فتومتری سه روش متداول وجود دارد:

• استفاده از فیلترهای شیشه‌ای استاندارد با دانسیته خنثی و فیلتر شیشه‌ای دیدیمیوم

اولین نوع این شیشه‌ها شیشه‌های استاندارد با دانسیته خنثی می‌باشند که برای کنترل صحت فتومتری در طیف نور مرئی و برای کنترل درازمدت و به ‌شرط کالیبراسیون متداول، بسیار مناسب می‌باشند. این فیلترها با تغییر طول‌موج در گستره نور مرئی همواره میزان جذب ثابتی را نشان می‌دهند.

دومین نوع از فیلترهای شیشه‌ای استاندارد، فیلتر دیدیمیوم است که علاوه بر کنترل صحت فتومتر برای کنترل صحت طول‌موج نیز استفاده می‌شود. از این فیلتر در طول‌موج‌های 270، 280، 300، 320 و 340 برای کنترل صحت فتومتری استفاده می‌شود.

 

• استفاده از محلول‌های استاندارد

از جمله محلول‌های مورد استفاده می‌توان، دی کرومات پتاسیم، سولفات آمونیوم کبالت و نیترات پتاسیم را نام برد. ایراد این محلول‌ها در این است که به سبب تغییر جذبشان با زمان، دما و PH برای کنترل درازمدت مناسب نمی‌باشد. از محلول دی‌کرومات پتاسیم برای بررسی صحت فتومتری در طیف نور ماوراء بنفش و هم برای طیف نور مرئی استفاده می‌شود. در ادامه به بررسی صحت فتومتری با استفاده از محلول دی‌کرومات پتاسیم در طیف نور ماوراء بنفش و نور مرئي پرداخته خواهد شد.

 

• استفاده از محلول‌های تجاری آماده

محلول‌هایی مانند Preciset BM که در طول‌موج 405 نانومتر مورد استفاده قرار می‌گیرند.

 

بررسی صحت فتومتری با استفاده از محلول دی‌کرومات پتاسیم در طیف نور ماوراء بنفش:

برای این کار می‌توان از محلول 0/006درصد دی‌کرومات پتاسیم در اسید پرکلریک 0.001N و یا محلول 50 mg/Lit دی‌کرومات پتاسیم در اسید سولفوریک 0.01N استفاده کرد. محلول 0/006 درصد دی‌کرومات پتاسیم دارای دو پیک جذبی در طول‌موج‌های 257 و 350 نانومتر بوده و جذب نوری برای محلول 50 mg/Lit دی‌کرومات پتاسیم در طول‌موج 350 نانومتر در محدوده 0.005 ± 0.536 می‌باشد (شکل ۷).

شکل ۷. دو پیک جذبی محلول 0/006 درصد دی‌کرومات پتاسیم در طول‌موج‌های 257 و 350

 

لازم به ذکر است که این روش برای بررسی صحت فتومتری، فتومترهایی که طول‌موج 350 نانومتر ندارند امکان‌پذیر نیست.

 

بررسی صحت فتومتری با استفاده از محلول دی‌کرومات پتاسیم در طیف نور مرئي:

بررسی صحت فتومتری در طیف نور مرئی نیز می‌بایست انجام شود. به این منظور از محلول 0/06 درصد  دی‌کرومات پتاسیم در اسید پرکلریک 0.001N استفاده می‌شود. طیف جذبی این محلول در طول‌موج 430 نانومتر همان‌گونه که در شکل نشان داده شده است دارای جذب ثابتی برابر با 1A می‌باشد (شکل ۸).

شکل ۸. محلول دی‌کرومات پتاسیم 0.06 درصد و نمودار طیف جذبی نور مرئی

 

2. صحت طول‌موج

این روش برای کنترل اینکه طول‌موج جداشده توسط سیستم منوکروماتور صحیح است یا خیر، به کار می‌رود.

برای اطمینان از صحت طول‌موج جداشده روش‌هایی متداول است که در ادامه به برخی از آنها می‌پردازیم:

 

• راه چشمی:

می‌دانیم که هر طول‌موج نور دارای رنگ خاصی است. برای کنترل، طول‌موج اسپکتروفتومتر را بر روی طول‌موج موردنظر تنظیم کرده و رنگ نور را با قرار دادن یک مقوای سفید در جلوی شیار خروجی مشاهده می‌کنیم. مثلاً در 590 نانومتر، رنگ باید زرد باشد.

 

• جایگزینی منبع نور:

صحیح‌ترین راه برای بررسی صحت طول‌موج، جایگزینی منبع نوری معمولی اسپکتروفتومتری با منبع نوری دیگر است که دارای ماکزیمم تابش نوری در طول‌موج‌های مشخص می‌باشد؛ مثلاً لامپ جیوه دارای تابش قوی در طول‌موج‌های 546، 436، 405، 365 و 313 می‌باشد.

 

• استفاده از فیلترهای شیشه‌ای از قبیل Holmium oxide و didymium (دیدیمیوم):

این فیلترها دارای پیک‌های جذبی بسیار مشخصی در طول‌موج‌های خاصی می‌باشند. دستگاه را روشن کرده و طول‌موج را برای 530 نانومتر تنظیم کنید. فیلتر دیدیمیوم را در محفظه کووت قرار دهید. T یا عبور را بین 50 تا 60 درصد تنظیم کنید. طول‌موج را بر روی 520 نانومتر قرار دهید و به‌آرامی طول‌موج را زیاد کنید (به سمت 540 نانومتر) و کمترین درصد T را مشاهده کرده و طول‌موج را یادداشت کنید. حداقل درصد T باید در طول‌موج 1±530 نانومتر بدست آید. اگر این‌چنین نشد، باید طول‌موج تنظیم شود و دوباره مراحل فوق تکرار شود تا حداقل درصدT  در 530 نانومتر قرار گیرد. فیلتر didymium  در 530 و 585 نانومتر حداقل درصد عبور نور را دارد.

 

• استفاده از محلول‌های رنگی:

روش دیگر برای کنترل کیفی صحت طول‌موج استفاده از محلول‌های رنگی می باشد که در طول‌موج‌های مشخص دارای ماکزیمم جذب هستند، به‌عنوان مثال می‌توان محلول‌های رنگی زیر را نام برد: محلول دی‌کرومات پتاسیم، محلول پارانیتروفنل، محلول سولفات آمونیوم کبالت و محلول سیان‌مت‌هموگلوبین. راحت‌ترین و قابل دسترس‌ترین روش برای اسپکتروفتومترهایی که با نور مرئي کار می‌کنند، استفاده از محلول سیان‌مت‌هموگلوبین بوده که دارای حداکثر جذب نوری در طول‌موج 540 نانومتر است. روش کار به این صورت است که ابتدا دستگاه را با محلول درابکین (به‌عنوان بلانک) صفر کرده و سپس جذب نوری نمونه در ‌طول‌موج 530، 535، 540، 545 و 550 نانومتر قرائت می‌گردد. لازم به ذکر است پس از هر تغییر طول‌موج، باید جذب نوری دستگاه با محلول بلانک صفر گردد. براساس طول‌موج و میزان جذب، منحنی مربوطه رسم می‌گردد. درصورتی‌که دستگاه دارای صحت طول‌موج باشد، حداکثر جذب نوری را در 540 نانومتر نشان می‌دهد. هر سه تا شش ماه یک بار و یا پس از هر تغییر و تعمیری بر روی دستگاه، می‌بایست کنترل صحت طول‌موج انجام شود.

 

3. خطی بودن

هدف از این آزمون تعیین محدوده‌ای است که در آن ارتباط خطی بین نور جذب‌شده و خوانش فتومتر وجود دارد. با این آزمایش درواقع میزان عدم صحت جذب نوری در هر رقت بررسی می‌شود. برای این ارزیابی از محلول‌های مختلفی که تا حد امکان پایدار باشند می‌توان استفاده نمود. به دلیل تأثیر متغیرهایی از قبیل خطای رقت، کاهش پایداری، تغییرات PH و تأثیرات دما در محلول‌ها، باید در استفاده از این روش عوامل یادشده تحت کنترل قرار گیرند.

بررسی و ارزیابی خطی بودن دستگاه اسپکتروفتومتر با استفاده از رقت‌های مختلف محلول‌هایی نظیر دی‌کرومات پتاسیم در طول‌موج 350 نانومتر، محلول سیان‌مت‌هموگلوبین در طول‌موج 540 نانومتر، محلول پارانیتروفنل در طول‌موج 405 نانومتر، محلول سولفات مس در طول‌موج 650 نانومتر، محلول سولفات آمونیوم کبالت در طول‌موج 512 نانومتر و محلول سولفات نیکل در طول‌موج 550 نانومتر انجام می‌شود. محلول‌های مورد استفاده برای کنترل خطی بودن، باید دارای رنگ پایدار بوده و در محدوده جذب ۲ تا ۱ خطی باشند. محلول دی‌کرومات پتاسیم بسیار پایدار است و رنگ آن تا چند ماه پایدار می‌ماند. پودر دی‌کرومات را در Oven، 110 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت خشک کرده و100mg  آن را با اسید سولفوریک 0.01N به حجم یک لیتر می‌رسانیم، این محلول به‌صورت استوک در شیشه تیره نگهداری می‌شود. از این محلول استوک، رقت‌های زیر را تهیه کرده و جذب نوری خوانده‌شده را با جذب نوری مورد انتظار بر روی نمودار رسم می‌کنیم. طول‌موج موردنظر 350 نانومتر می‌باشد.

 

در جدول بالا، اگر نمودار جذب نوری مورد را برحسب جذب نوری بدست آمده رسم کنیم، نمودار بدست آمده خطی خواهد بود و شیب خط، یک است. در شکل ۹ با استفاده از نرم‌افزار متلب (MATLAB) این نمودار رسم شده است و همان‌طور که قابل مشاهده است، نمودار، خطی و شیب خط یک است.

شکل ۹. نمودار جذب نوری مورد انتظار (Jazbe Morede Entezar) برحسب جذب نوری

بدست آمده (Jazbe Bedast Amade)

 

آزمایش خطی بودن را باید بعد از هر بار تعمیر دستگاه و یا در فواصل زمانی معین انجام داد.

 

4. کنترل تعویض لامپ

لامپ‌ها به‌طور آرام و پیوسته در معرض فرسودگی قرار دارند، در نتیجه باید در فواصل زمانی مرتب آنها را کنترل و بررسی کرد. درصورتی‌که ناپایداری میزان جذب به علت خرابی لامپ باشد باید آن را تعویض کرد. بعد از نصب لامپ جدید باید سیستم نوری دستگاه تنظیم شود تا حداکثر میزان نور، پس از عبور از کووت به فتوسل برسد. کنترل تعویض لامپ به دور روش قابل اجراست:

 

روش اول: استفاده از آب مقطر

• یک کووت پر از آب مقطر در دستگاه قرار دهید و طول‌موج مناسب را انتخاب کنید (550 نانومتر)
• عقربه گالوانومتر در وسط صفحه تنظیم شود (T = 50%, A=0.3)
• لامپ و دیگر اجزای سیستم نوری به‌نوبت، کمی تغییر داده شوند و اثر آنها بر روی T یا A بررسی شود.
• محلی که حداکثر T بدست آید بهترین موقعیت هر یک از اجزای سیستم نوری می‌باشد.
• در صورت نیاز، تغییرات جزئی در موقعیت لامپ ایجاد کنید تا حداکثر میزان عبور نور بدست آید.

 

روش دوم:

در بعضی از اسپکتروفتومترها امکان قرار دادن یک صفحه سفید در برابر فتوسل وجود دارد که تصویر واضحی از فیلامنت لامپ بر روی آن مشاهده می‌شود. اگر این تصویر محو باشد یا عمودی نباشد تغییراتی در وضعیت لامپ داده شود تا بهترین و واضح‌ترین تصویر بدست آید.

 

5. آزمایش رانش فتومتری

یکی از منابع اصلی خطا در اسپکتروفتومتری وجود رانش فتومتری (عدم پایداری مقدار جذب قرائت‌شده) نسبت به زمان یا Drift می‌باشد. این رانش ممکن است به دلیل فرسودگی شدید منبع نور باشد. بهتر است پس از خواندن هر 5 تا 10 تست، رانش را کنترل کرده و دستگاه را مجدداً صفر کنید. صفر را با کووت خالی یا کووت محتوی آب مقطر یا محلول بلانک تنظیم کنید.

اگر اسپکتروفتومتر به مدت زیادی روشن باشد دستگاه گرم شده و عملکرد اولیه آن از دست می‌رود و drift ایجاد می‌شود. اسپکتروفتومتری خوب است که drift نداشته باشد.

 

روش کنترل:

• در موقع انجام تست‌های مختلف (مثلاً قند خون) به فاصله هر 10 تا 20 بار خواندن تست‌ها، بلانک را می‌گذاریم که نباید تغییر کرده باشد. در صورت وجود drift باید در فواصل کوتاه، دستگاه را صفر کنیم یا مقدار بالا یا پایین رفته را از عدد خوانده شده تست‌ها کم یا زیاد کنیم.
• طول‌موج مناسبی را انتخاب کنید (550 نانومتر). دستگاه را روشن کرده و کووت محتوی آب مقطر را در دستگاه قرار دهید و درصد عبور را 50 درصد تنظیم کنید، زمان را یادداشت کنید. پس از ۳۰ دقیقه دوباره درصد عبور را چک کنید.

 

6. نورهای ناخواسته

نورهای ناخواسته نورهایی هستند که غیر از نور عبور داده شده از منوکروماتور، به نمونه تابیده شده و موجب بروز خطا می‌شوند. برای بررسی این موضوع از محلول‌هایی که نور را به‌طور کامل جذب می‌کنند مانند استن یا نیتریت سدیم، یدید سدیم و کلرید پتاسیم در طول‌موج‌های خاص استفاده می‌شود. در این حالت می‌بایست ترانس‌میتانس صفر درصد (جذب بی‌نهایت و غیرقابل خوانش) باشد زیرا نور از محلول عبور نکرده و به دتکتور نمی‌رسد.

 

7. کدورت محلول‌ها

برای اندازه‌گیری فتومتری، معرف‌ها و محلول‌های حاصل باید شفاف باشد. در صورت کدورت، واکنش باید تکرار شود. در این مواقع، آزمایش را با رقیق کردن نمونه تکرار کنید و یا به‌صورت sample blank عمل کرده و جذب نوری بلانک نمونه را از سایر لوله‌ها کم کنید.

 

 

فتومترهاي شعله‌ای یا Flame Photometer

دستگاه‌هاي فتومترشعله‌اي سه اختلاف عمده با وسايلي كه تاكنون شرح داده شده است (اسپكترفتومترها) دارند كه اين تفاوت‌ها به‌صورت زير مي‌باشند:

1. در فتومترهاي شعله‌ای منبع انرژي و نگهدارنده نمونه، در لوله آزمايش قرار دارد.
2. اساس و مبناي اصلي اندازه‌گیری در فتومترهاي شعله‌ای اندازه‌گیری نشر نور به‌وسیله نمونه است و نه جذب نور (يك نوع فتومتر شعله‌ای بر اساس جذب اتمي نيز شرح داده خواهد شد)
3. در روش‌هاي فتومتر شعله‌ای، فقط غلظت فلزات خالص را مي‌توان اندازه‌گیری كرد.

اساس كار دستگاه‌هاي فتومتر شعله‌ای نشر اتمي بدين شكل است كه وقتي يك اتم از حالت تحريكي به حالت زمينه خود بازمی‌گردد، يك فوتون با طول‌موج مخصوص به خود گسيل می‌کند. منبع انرژي موردنیاز براي بردن اتم‌ها به حالت تحريكي، همان فوتون مي‌باشد. اندازه طول‌موج پرتو نشري حاصل از نمونه در يك طول‌موج، بستگي به غلظت اتم‌های نمونه دارد، اما دستگاه‌هاي فتومتر شعله‌ای جذب اتمي، واكنش عكس حالت فوق را دارند، يعني يك منبع انرژي با طول‌موج مخصوص، انرژي حاصل جهت تحريك اتم‌ها را براي آناليز نمونه تهيه كرده و نمونه انرژي حاصل از شعله را جذب می‌کند تا به حالت تحريكي برود. اتم‌هايي كه در شعله با طول‌موج‌های مخصوص، جذب انتخابي مي‌شوند، اتم‌ها را به حالت تحريكي می‌برند. درجه قدرت جذب نمونه در يك طول‌موج، متناسب با غلظت اتم‌های آن نمونه است.

 

فتومتر شعله‌ای نشر اتمي (Emission Atomic)

با استفاده از منابع انرژي معمولي، تنها حدود یک درصد از اتم‌های نمونه مورد بررسي، به حالت تحريكي برده مي‌شوند و طول‌موجي كه از اين طريق حاصل می‌شود فقط مربوط به اثر یک درصد از اتم‌هاست. اين عوامل باعث می‌شود كه از عناصر خاصي جهت فتومتر شعله‌ای نشر اتمي استفاده شود. به همين علت، اين روش براي محاسبه غلظت عناصر فلزي يوني مثل: ⁺K⁺، Na و ⁺Li مورد استفاده قرار می‌گیرد. البته به بيشتر دستگاه‌هاي مدرن، ضمائم الكتريكي بيشتري اضافه شده تا بتوان غلظت عناصری مثل ⁺Ca² را نيز به دست آورد. شماي كلي دستگاه‌هاي فتومتر شعله‌ای در شكل ۱۰ نشان داده شده است.

در روش‌هاي فتومتر شعله‌ای، نمونه در يك محلول، تركيب شده و سپس توسط قسمت Nebulizer به پودر تبديل می‌شود و بعداً به شعله تزريق می‌گردد. از گاز طبيعي يا پروپان همراه با تركيبي از هواي فشرده براي اين منظور استفاده می‌شود. پس از اينكه نمونه به پودر تبديل شد، ذرات درشت آن، ته‌نشین مي‌شوند و ذرات ريز آن به شعله مي‌رسند. در شعله تعدادي از اتم‌ها به حالت تحريكي رفته و سپس نشر مي‌كنند و يك طول‌موج اختصاصي بر اساس مقدار برانگيختگي اتم‌ها حاصل می‌شود. انرژي نشري توسط يك سيستم نوري ساده (عدسي و فيلتر) كانوني شده و به آشكارساز می‌رسد. براي جبران تغييرات در آهنگ جذب نمونه و تولید پودر از نمونه و همچنين خواص اختصاصي شعله، در بيشتر فتومترهاي شعله‌ای از استانداردهاي داخلي استفاده می‌شود.

معمولاً از ليتيم-  Li⁺ به‌عنوان استاندارد داخلي استفاده مي‌كنند، زيرا كه از تغييرات شدت و ميزان شعله جلوگيري می‌شود. بدين ترتيب مقداري از ليتيم كه در نمونه بيولوژيكي وجود ندارد، به نمونه اضافه می‌شود و سيستم، نوري با طول‌موج 760 نانومتر حاصل می‌کند كه اين نور چون طول‌موج بلندي دارد، به‌خوبی از نور حاصل از پتاسيم و سديم قابل تشخيص است.

نحوه استفاده از سيستم استاندارد داخلي بدين صورت است كه نمك ⁺Li به‌آهستگي و تحت شرايط كنترل شده، به نمونه اضافه می‌شود و يك كانال نوري جهت اندازه‌گیری نور حاصله از ⁺Li استفاده می‌شود كه به‌اتفاق غلظت شناخته شده ⁺Li براي محاسبه غلظت ⁺K⁺، Na بكار برده می‌شود. كاربرد استاندارد داخلي و بافر، امكان خوانش مستقيم غلظت‌هاي سديم و پتاسيم و نيز امكان رقيق كردن آسان سرم، از ويژگي‌هايي هستند كه فتومتر شعله‌ای را به دستگاه مناسبي براي سنجش الكتروليت‌ها مخصوصاً سديم و پتاسيم در آزمايشگاه باليني تبديل می‌کند.

مشكلاتي كه در هنگام استفاده از ⁺Li به‌عنوان استاندارد داخلي پيش مي‌آيد، عبارتند از اينكه اگر تغييرات ايجاد شده توسط دستگاه كوچك باشد، كارآيي آن خوب است ولي اگر تغييرات داخلي دستگاه زياد باشد از آن نمي‌توان استفاده كرد. چون از ⁺Li براي درمان بيماران رواني استفاده می‌شود، بنابراين براي كنترل مقدار آن در سرم بيماران لازم است كه مقدار آن را در سرم خون بيماران اندازه‌گیری كرد و مسلم است كه آن را نمي‌توان با سيستمي كه ⁺Li به‌عنوان استاندارد داخلي آن است، سنجش نمود و به‌ناچار دستگاه‌هاي فتومتر شعله‌ای جديدي ساخته شده‌اند كه مجهز به فيلتر مخصوص هستند و لیتیم سرم را با استفاده از پتاسيم به‌عنوان استاندارد داخلي، اندازه‌گیری مي‌كنند.

 

فتومتر شعله‌ای جذب اتمي (Absorption Atomic)

در فتومتر شعله‌اي، منبع نوري كه استفاده می‌شود فقط يك درصد اتم‌ها را به حالت تحريكي می‌برد و 99 درصد اتم‌ها در حالت زمينه‌شان باقي مي‌مانند. پس در عناصر فلزي، الكترون‌هايي كه بر اساس حرارت تهييج نشده‌اند، در حالت زمينه قرار دارند و قادرند انرژي نوراني الكترون‌هاي برانگيخته شده را جذب كرده و خود به مدارهاي بالاتر بروند و حتي از خود، فوتون گسيل نمايند. اساس كار اين نوع اسپكتروفتومتر بر مبنای پديده بالا، بنا شده است، بطوريكه نور لامپ مخصوص به فلزي كه در شعله قرار گرفته است، تابيده شده و مقدار انرژي كه به‌وسيله فلز موردنظر جذب می‌شود، اندازه‌گیری می‌گردد.

شکل ۱۰. شماي يك فتومتر شعله‌ای از نوع: 1) نشر اتمي و 2) جذب اتمي

عمدتاً از دستگاه‌هاي فتومتر شعله‌ای جذب اتمي براي محاسبه دقيق غلظت عناصر فلزي مثل مس، روي، آهن، سرب، منيزيم، سديم پتاسيم، كادميوم، كروميوم، جيوه، ليتيم، نيكل، بيسموت، كبالت، منگنز و تعدادي ديگر از عناصر در مايعات بيولوژيك استفاده می‌شود. اساس كار اين روش مبتني بر جذب انرژي با طول‌موج‌های مشخص، توسط اتم‌های نمونه در شعله مي‌باشد.

براي تهيه انرژي با طول‌موج‌های اختصاصي از يك منبع نوراني استفاده می‌شود كه اين منبع نوراني، طول‌موج‌های مشخص را براي تحريك اتم‌های نمونه مهيا می‌سازد. اين منبع انرژي يك لامپ خلأ كاتدي است. معمولاً اين لامپ‌ها به‌وسيله يك پوشش از عناصر فلزي كه اندازه‌گیری غلظت آنها موردنظر است، پوشيده شده‌اند. يعني براي هر فلز خاص، يك نوع لامپ مجزا مورد استفاده قرار می‌گیرد، اما خواص اختصاصي چند فلز مشخص اين امكان را مي‌دهد كه از دو يا سه لامپ در دستگاه‌ها استفاده شود. در اين لامپ‌ها، كاتد تحت شرايط اتمسفري، با يك گاز خنثي قرار می‌گیرد و هنگامي كه كاتد گرم می‌شود، اتم‌های كاتد سطح آن را ترك كرده و اين اتم‌ها در اثر برخورد با الکترون‌ها و یون‌ها تحريك مي‌شوند و در هنگام بازگشت آنها به حالت زمینه‌شان، طول‌موج‌های مشخص و اختصاصي آزاد مي‌نمايند كه مستقيماً به شعله رسيده و نمونه را تحت تأثیر قرار مي‌دهد.

ازآنجایی‌که نمونه مورد آزمايش، تحت تأثیر دو نوع انرژي حاصل از لامپ و حاصل از شعله قرار می‌گیرد، بنابراين مي‌بايست اين دو نوع انرژي از يكديگر تمايز يابند. براي تمايز اين دو از يك ديسك چرخان يا پره چرخان استفاده می‌شود تا اينكه بين اين دو نوع انرژي و واكنش آنها با اتم‌های نمونه مورد بررسي و رسيدن آنها به آشكارساز، تمايز وجود داشته باشد. اين ديسك چرخان، بين منبع انرژي نوراني و شعله قرار دارد؛ يعني هنگامي كه پره چرخان جلوي نور را می‌گیرد، اتم‌های نمونه فقط توسط شعله تحريك مي‌شوند و در حالتي كه پره چرخان جلوي نور لامپ نمی‌باشد، انرژي نوراني باعث تحريك اتم‌های نمونه می‌شود.

 

فلورومتري Fluorometry

از ديگر روش‌هاي طیف‌سنجی، استفاده از خاصيت فلورسانس است كه در برخي مواد وجود دارد. اين خاصيت در بعضي از كريستال‌ها وجود دارد كه اگر آنها انرژي جذب نمايند، اين انرژي را به‌صورت نور مرئي، گسيل مي‌نمايند. مبناي فيزيكي اين روش براساس خاصيت تعدادي از مولکول‌هاست كه در يك طيف اختصاصي، نور نشر مي‌نمايند. اين طيف نشري ضرورتاً پس از جذب انرژي توسط نمونه و به حالت تحريكي رسيدن آن انجام می‌شود و مقدار برانگيختگي اين مولکول‌ها بستگي به دامنه و طول‌موج منبع نوراني، تغييرات منبع انرژي الكتريكي، طول‌موج انتخابي و مدارهاي آشكارسازي كه در فلورومتري استفاده شده و خيلي حساس هستند، دارد.

از لامپ‌هاي دايره‌اي جيوه‌اي براي تهيه انرژي نوراني تحريكي در محدوده طول‌موج‌های 365 و 405 و 436 و 456 نانومتر استفاده می‌گردد. در شكل ۱۱ شماتیک يك نوع دستگاه فلورومتري نشان داده شده است.

شکل ۱۱. شماي يك دستگاه فلورومتري كه براي اندازه‌گیری غلظت موادي كه خاصيت فلورسانس دارند، بكار برده می‌شود

 

در اين روش، از لوله افزاينده نوري به‌عنوان آشكارساز استفاده می‌شود. از مزاياي اين روش بر روش‌هاي متداول اسپكتروفتومتري، حساسيت بسيار بالاي اين روش است، چرا كه در روش‌هاي اسپكتروفتومتري اختلاف جذب محلول كه غلظت آن صفر است يعني تمامي نور از آن عبور می‌نماید و ماده مجهول و نمونه‌اي كه براي اندازه‌گیری بكار می‌رود، مشخص نيست. در اين روش، اندازه‌گیری مستقيم فلورسانس نمونه، براي محاسبه غلظت ماده مجهول استفاده می‌گردد.

از ديگر مزاياي اين روش، اختصاصي بودن آن است، چرا كه فقط تعداد اندكي از مواد، خاصيت فلورسانس دارند. از عمده معايب روش‌هاي فلورومتري، حساسيت آنها به pH و دماي نمونه را مي‌توان نام برد. به‌طور كلي بايد متذكر شد كه خاصيت فلورسانس به pH حساس است و اين حساسيت به pH به‌عنوان يكي از معايب كلي اين روش محسوب می‌گردد.

 

اسپكتروسكوپي مادون قرمز

نور مادون قرمز به آن بخش از طيف الكترومغناطيس كه بين امواج مرئي و مايكروويو قرار دارد، گفته می‌شود كه به سه ناحيه نزديك، مياني و دور تقسيم می‌شود. قسمت مفيد و عملي اين بخش در طیف‌سنجی مادون قرمز، ناحيه مياني آن است كه طول‌موجي در حدود 2500 – 800 نانومتر دارد.  طیف‌سنجی مادون قرمز روشي براي شناسايي مولکول‌ها و بخصوص گروه عاملي مولکول‌هاست. هر ماده‌اي، طيف مادون ‌قرمز مخصوص به خود را دارد و همانند اثرانگشت، مختص خود مولكول مي‌باشد. انرژي امواج مادون‌ قرمز در حدي نيست كه بتواند باعث برانگيختگي الکترون‌ها شود و آنها را به ترازهاي بالاتر ببرد، بلكه فقط باعث ايجاد ارتعاش پيوندهاي كووالانسي اتم‌ها و مولکول‌ها می‌شود. جذب تابش مادون قرمز همانند هر فرآيند جذب ديگر، يك فرآيند كوانتائي است؛ بدين صورت كه فقط فركانس‌هاي مشخصي از تابش مادون قرمز توسط مولكول جذب می‌گردد. به‌طور كلي وقتي پرتو مادون قرمز به نمونه‌اي مي‌تابد، امكان دو نوع ارتعاش در اتم‌های نمونه وجود دارد؛ يك نوع ارتعاش از نوع كششي است كه در اين نوع، فاصله بين اتم‌ها كم و زياد می‌شود و نوع ديگر ارتعاش خَمِشي است كه اين نوع ارتعاش باعث تغيير زاويه بين پيوندها می‌شود (شكل ۱۲) در فرآيند جذب، فركانس‌هايي از مادون قرمز كه با فركانس‌هاي ارتعاشي طبيعي مولكول موردنظر تطبيق كند، جذب خواهد شد و انرژي جذب‌شده براي افزايش دامنه حركت پيوندهاي موجود در مولكول بكار گرفته می‌شود. در طيف مادون قرمز، فقط آن دسته از ارتعاشات كه زایيده تغيير هماهنگ در دي پل ممان مولكولي است، ديده مي‌شوند. يعني تا تغيير در ممان مغناطيسي مشاهده نشود، طيف مادون قرمز ملاحظه نخواهد شد. در طیف‌سنجی مادون قرمز، انرژي جذب‌شده توسط ماده بيشتر به‌صورت گرما ظاهر می‌شود.

شکل ۱۲. انواع ارتعاش‌های مولکول‌ها در اثر تابش مادون قرمز

 

در اين ناحيه، انرژي امواج 1 تا 10 كيلوكالري بر مول است كه براي تحريك الکترون‌ها كافي نيست و فقط صرف مرتعش شدن پيوندها می‌شود كه به آن طيف ارتعاشي (Vibrational) می‌گويند كه از منابع توليد آن مي‌توان خروجي يك منوكرومات با شدت زياد كه طيف وسيعي از طول‌موج‌ها را شامل می‌شود را نام برد.

بايد توجه داشت كه تمامي پيوندهاي موجود در مولكول قادر به جذب انرژي مادون قرمز نيستند، حتي اگر فركانس پرتو كاملاً با فركانس ارتعاش طبيعي مولكول تطبيق كند. فقط آن پيوندهايي كه داراي گشتاور دوقطبي هستند، قادر به جذب انرژي مادون قرمز خواهند بود؛ مثلاً پيوندهاي متقارن موجود در H₂ و Cl₂ مادون قرمز را جذب نمي‌كنند. يك پيوند بايد از خود خصلت الكتريكي بروز دهد تا انتقال انرژي از پرتو به مولكول صورت گيرد. اكثر پيوندهايي كه چنين خصلتي را دارند، پيوندهاي موجود در آلكن‌ها وآلكين‌هاي متقارن هستند.

 

طیف‌سنجی تفكيكي مادون قرمز

قسمت‌هاي مختلف يك دستگاه طیف‌سنجی تفكيكي مادون قرمز به شرح زير است (شكل ۱۳):

شكاف جهت ورود نور: هر چقدر شكاف ورود نور باریک‌تر باشد، طيف حاصل‌شده نيز مجزاتر خواهد بود و اجزاي نمونه، بهتر قابل تشخيص است.

عدسي يا كليماتور: از عدسي براي كانوني كردن نور فرودي به نمونه استفاده می‌شود و كليماتور نيز پرتوها را به‌صورت موازي درآورده تا به‌صورت يكنواخت به‌تمامی نمونه برخورد نمايند.

عامل پخش‌کننده (منشور يا توريپراش): اين قسمت، نور حاصله از نمونه را به طول‌موج‌های مختلف آن مجزا می‌نماید.

عدسي يا آينه ثانويه: اين بخش براي كانوني كردن يا جمع‌آوری نور ايجاد شده از واكنش نور اوليه با نمونه بكار می‌رود.

عدسي چشمي و يا فتومتر: اگر به قسمت‌هاي اشاره شده قبلي يك عدسي چشمي اضافه شود به آن اسپكتروسكوپ گويند و اگر به آنها فتومتر اضافه گردد به آن اسپكتروفتومتر گويند. براي انجام آزمايش، ابتدا پرتو مادون قرمز توسط يك آينه به دو پرتو تقسيم می‌شود؛ يكي از اين پرتوها از نمونه و ديگري از يك مرجع كه حلالي است كه نمونه در آن حل شده، عبور داده می‌شود. علت استفاده از مرجع اين است كه با استفاده از نور عبوري از هر دو، بتوان درصد نور عبوري از نمونه را به‌دست آورد. پس از عبور مادون قرمز از هر دو، بار ديگر با استفاده از دو آينه، آنها به سمت آشكارسازها هدايت مي‌شوند تا در آنجا ميزان پرتو عبوري از هر دو را تعيين و سپس طيف نمونه توسط ثبات ترسیم شود.

شکل ۱۳. دياگرام يك دستگاه طیف‌سنجی تفكيكي مادون قرمز

 

برخی از منابع:

• کتاب راهنمای نگهداشت تجهیزات آزمایشگاهی، ویرایش دوم، سازمان بهداشت جهانی، مترجمان: خانم مهری علی‌اصغرپور، مهناز صارمی
• کتاب تجهیزات آزمایشگاهی، اصول فنی و نگهداری و روش‌های کنترل کیفی، سیدبهزاد سیدعلیخانی
• کتاب PAS تکنیک‌های عملی آزمایشگاهی تشخیصی، جلد ششم، کنترل کیفی مواد و تجهیزات آزمایشگاهی، جدیدترین مرجع مقادیر آزمایشگاهی، دکتر امیر سیدعلی مهبد، سیدرضا موسوی
• کتاب مقدمات آشنایی و اصول کلی آزمایشگاه تشخیص طبی، رضا انصاری، سعید طهماسبی
• کتاب اصول فیزیکی دستگاه‌های آزمایشگاهی، دکتر داریوش شهبازی گهرویی
• Maintenance Manual for Laboratory Equipment, 2nd Edition, World Health Organization (book)
• Webster John G. Encyclopedia of Medical Divices and Instrumentation. 2nd ed., John Wiley & Sons Inc.,
• Bronzino Joseph D. The Biomedical Engineering Handbook. 2nd ed.,

اسپکتروفتومتری

فلیم فتومتر Flame Photometer

بيولومينسانس

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید