اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (۲)

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی قسمت دوم: روش‌های اسپکتروفتومتری

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی

قسمت دوم: روش‌های اسپکتروفتومتری 

مهندس احسان درخشان نیا

Bme.ehsan@gmail.com

 

 

اسپکتروفتومتر

اشکال مختلف اسپکتروفتومتری در بیشتر وسایل آزمایشگاهی بیوشیمی، کاربرد دارند. به‌طور‌کلی عبارت اسپکتروفتومتر، به‌عنوان یک اصطلاح عام برای یک گروه یا یک طبقه از وسایل آزمایشگاهی بکار می‌رود که فتومترها در این گروه قرار دارند. دستگاه اسپکتروفتومتر از دو قسمت اسپکترومتر و فتومتر یا نورسنجی تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نوری با طول‌موج‌های مشخص بوجود آورده و شامل منبع نور، عدسی، شکاف‌ها و منوکروماتور می‌باشد و فتومتر از قسمت‌های سنجش نور و ضبط آن تشکیل شده است. اساس و مبنای روش‌های اسپکتروفتومتری بر روی خاصیت جذب انتخابی مواد یا نشر انرژی الکترومغناطیسی در طول‌موج‌های مختلف آنها بنا شده است.

 

اصول عملکرد دستگاه

به‌عنوان یک اصل پایه، نور نوعی از انرژی الکترومغناطیسی در نظر گرفته می‌شود. سرعت ثابت نور در فضا [C]، تقریباً m/s 108×۳ است. سرعت نور در صورت عبور از هر محیط شفاف دیگر، کمی کاهش می‌یابد و از معادله زیر می‌توان سرعت آن را بدست آورد:

به‌طوری‌که:

v0، سرعت نور ورودی از هر محیط یا وسیله و n، شاخص بازتاب است که مقدار عددی آن معمولاً بین ۱ تا ۲/۵ می‌باشد.

انرژی الکترومغناطیسی طیف وسیعی از طول‌موج‌ها را دارد که در جدول ذیل به برخی از آنها اشاره شده است:

 

درنتیجه عبور یا برخورد نور با محیط‌های مختلف یکی از پدیده‌های بازتاب، انکسار یا شکست، تجزیه، جذب، پخش، پلاریزه شدن و پدیده‌های دیگر اتفاق می‌افتد که با دستگاه‌ها و وسایل مختلف اندازه‌گیری می‌شود. جدول زیر محدوده طول‌موج‌های دیگر را نشان می‌دهد که در آزمایش‌های اسپکتروفتومتری استفاده می‌شوند.

 

با توجه به برخورد نور و ماده، شکل ۱ در توضیح پیچیدگی پدیده‌ای که رخ می‌دهد، کمک می‌کند. شکل نشان می‌دهد که نور ورودی [I0] می‌تواند تغییر حالت‌های متعددی پیدا کند؛ می‌تواند منعکس یا بازتاب شود [Ir]، عبور کند [It]، پخش شود یا جذب شود و یا مستقیماً به صورت فلوئورسانس ساطع شود [If]. اساس کار اسپکتروفتومترها اصولاً بر جذب و عبور نور استوار است. برای درک این موضوع قانون بیرـ لامبرت را مرور می‌کنیم.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۱. برخورد نور با ماده

 

قانون بیرو یا بیرـ لامبرت رابطه بین غلظت نمونه و شدت نوری که از آن عبورمی‌کند را نشان می دهد. با توجه به این قانون، دو حالت وجود دارد: عبور کردن[T] و جذب کردن [A]

عبور [T]، بخشی از نور ورودی با طول‌موج مشخص است که از داخل نمونه عبور می‌کند.

 

که ، شدت نور عبور کرده (خروجی) و ، شدت نور اولیه یا ورودی است.

تعداد مولکول‌های جاذب نور در یک نمونه متناسب با میزان جذب آن در نمونه است و به‌صورت رابطه ریاضی زیر بیان می‌شود:

A = ε × l × c

که در رابطه بالا:

A، جذب قابل اندازه‌گیری نور

‌ε، ضریب جذب

‌l،‌ طول مسیر عبور نور در نمونه و

c،‌ غلظت نمونه است.

رابطه بین جذب نور (T) و عبور (A) آن با معادله زیر نشان داده می‌شود:

 

طرح زیر (شکل ۲) پدیده جذب را توضیح می‌دهد:

 اسپکتروفتومتری

شکل ۲. پدیده جذب

منحنی‌های ارائه شده در زیر نمایانگر مدلی است که چگونه مقدار جذب (A) و عبور نور (T) در اثر غلظت (C) بر اساس قانون بیر تغییر می‌کند (شکل ۳ و ۴).

 اسپکتروفتومتری

شکل ۳. منحنی عبور نور بر اساس غلظت

 

 اسپکتروفتومتری

شکل ۴. منحنی جذب نور بر اساس غلظت

 

همان‌طور که مشخص است با افزایش غلظت نمونه، میزان عبور نور کم و جذب بیشتر می‌شود.

اجزاء اسپکتروفتومتر

شکل ۵ و ۶ دو نمونه شمای کلی از یک دستگاه اسپکتروفتومتر را نشان می‌دهند.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۵. شمای کلی یک دستگاه اسپکتروفتومتر

 اسپکتروفتومتری

شکل ۶. شمای کلی یک دستگاه اسپکتروفتومتر

 

چنانچه در این شکل‌ها ملاحظه می‌شود، منبع انرژی نورانی، نور لازم را برای آنالیز نمونه، حاصل می‌نماید. برای اینکه نمونه را در مسیر انرژی حاصله از منبع تغذیه قرار دهند، آن را در داخل لوله آزمایش (کووت) قرار داده و سپس نور به آشکارساز رسیده و از آنجا به خروجی دستگاه می‌رسد که نمایانگر مقدار انرژی رسیده به آشکارساز است. در این روش با استفاده از خواص جذب انرژی ماده می‌توان غلظت مواد تشکیل‌دهنده آن را به دست آورد.

در مراحل گسترده‌تر، نمونه‌هایی که از بیماران گرفته می‌شود   به دلیل اینکه این نمونه‌ها هیچ‌گونه خاصیت جذب انتخابی انرژی را ندارند، بنابراین می‌بایست که یک عامل خارجی به نمونه اضافه شود و پس از آن، نمونه، مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد.

 

قسمت‌های مختلف یا اجزای داخلی یک دستگاه اسپکتروفتومتر عبارتند از:

  1. منبع انرژی الکتریکی: در اسپکتروفتومتر برای ایجاد نور، احتیاج به یک منبع انرژی الکتریکی ثابت است. این منبع می‌تواند باطری خشک و یا مرطوب و یا جریان الکتریکی متناوب– AC باشد.

 

  1. منبع نوری Light Source: در اکثر اسپکتروفتومترها منبع انرژی نورانی برای تولید نور مرئی،‌ لامپ تنگستن، برای تولید نور ماورا بنفش، لامپ دوتریوم و برای تولید نور با طیف مرئی و ماوراء بنفش لامپ هالوژنه به‌کار می‌رود. تفاوت میان انواع لامپ‌های مورد استفاده بیشتر مربوط به گستره طیف طول‌موج تولیدی و عمر مفید آنها می‌باشد، به‌عنوان مثال لامپ هالوژنه در مقایسه با لامپ تنگستن علاوه بر تولید طیف طول‌موج نور ماوراء بنفش و نور مرئی از طول عمر خیلی بیشتری نسبت به لامپ تنگستن برخوردار می‌باشد.

 

  1. عدسی و شکاف: نور، قبل از آنکه به منوکروماتور برخورد کند از عدسی‌ها و شکافی عبور می‌کند که نقش فیلتر داشته و وظیفه عدسی‌ها تعیین مسیر عبور نور می‌باشد. به‌جای عدسی‌ها از آیینه‌هایی که به شکل نیم‌دایره یا محدب ساخته شده‌اند نیز می‌توان استفاده نمود. در هر دستگاه اسپکتروفتومتری دو شکاف یا شیار وجود دارد؛ یکی را شکاف ورودی و دیگری را شکاف خروجی می‌نامند. وظیفه این شیارها کنترل میزان نور عبوری می‌باشد. شیارها نقش مهمی در جدا کردن نور دلخواه با طول‌موج مشخص دارند، به همین جهت اندازه آنها بسیار مهم است. در بیشتر دستگاه‌ها پیچی برای تنظیم این شکاف‌ها موجود است که توسط آن اندازه این شکاف‌ها را برحسب نیاز می‌توان تغییر داد. هرچه طول این شکاف‌ها بیشتر باشد، پهنای نور عبوری بیشتر بوده و دامنه طول‌موج آن نیز زیاد می‌باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که موردنیاز نیستند عبور خواهند کرد.

 

  1. منوکروماتور: اشعه نورانی پس از عبور از عدسی‌ها و شکاف،‌ به وسیله‌ای که می‌تواند نور پلی‌کروم را به منوکروم تبدیل کند، وارد می‌شود که نوری با طول‌موج مشخص و انتخابی بوجود می‌آورد. برای تجزیه نور از فیلتر، منشور و یا گریتینگ استفاده می‌کنند. هرچه شکاف‌های گریتینگ باریک‌تر باشد طول‌موج‌های دقیق‌تری تولید می‌شود. زاویه برخورد نور با منشور یا گریتینگ، طول‌موج نور را مشخص می‌کند. فیلترها علاوه بر اینکه می‌توانند یک طول‌موج را جداسازی کنند، به‌عنوان حذف‌کننده نورهای ناخواسته در سیستم‌های دارای گریتینگ نیز استفاده می‌شوند. جنس فیلترها معمولاً از شیشه رنگی است.

 

  1. منشور و گریتینگ: منشور،‌ یک شیشه با لبه‌های تیز و به شکل هرم می‌باشد که ممکن است از جنس شیشه، کوارتز، سدیم کلراید و یا سایر موادی که نور را عبور می‌دهـــــــند، باشد. گریتینگ- Grating وسیله‌ای‌ است که به‌صورت یک صفحه دارای شیارهای کوچک می‌باشد که هرکدام مانند یک منشور عمل می‌کنند. نور در اثر برخورد با این شیارها به طیفی از طول‌موج‌ها تجزیه می‌شود. در سیستم گریتینگ نور منعکس می‌شود ولی در منشور نور عبور می‌کند. در منشور شدت نور خروجی کمتر از گریتینگ می‌باشد. در اسپکتروفتومترهای مرئی منشور شیشه‌ای بیشتر بکار می‌رود. از منشور کوارتز برای ناحیه UV و از منشور سدیم کلراید یا پتاسیم برمید برای ناحیه IR یا مادون قرمز استفاده می‌شود. گریتینگ دارای پهنای باند مساوی در ناحیه UV و IR می‌باشد. این وسیله، یک صفحه شیشه‌ای صاف پوشیده شده با بخار آلیاژ مس و آلومینیوم می‌باشد که همان‌طور که گفته شد، هر شیار آن مانند یک منشور عمل می‌کند و هر شیار یک طیف رنگی ایجاد می‌کند.

 

  1. ظرف محتوی نمونه- Cuvett: کووت معمولاً از جنس شیشه کوارتز یا پلاستیک است و برای اندازه‌گیری شدت رنگ محلول‌ها و بلانک بکار می‌رود. کووت‌های شیشه‌ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی بکار می‌روند و در ناحیه ماوراء بنفش از کووت کوارتز استفاده می‌شود. دو نوع کووت وجود دارد؛ کووت‌های مکعبی و گرد. کووت‌های مکعبی دارای سطح مقطع مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و کوارتز (برای نور ماوراء بنفش) می‌باشند. کووت‌های مکعب، گران هستند و کارکردن و تمیز نگه داشتن آنها دقت بسیار لازم دارد. کووت‌های گرد دارای سطح مقطع گرد بوده و بیشتر برای کارهای روزمره آزمایشگاهی استفاده می‌شوند.

 

  1. نورسنج: نور پس از عبور از عدسی‌ها و شکاف و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می‌رود. وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می‌تاباند مقداری از آن به‌وسیله محلولی که درون لوله وجود دارد، جذب‌شده و بقیه آن به نورسنج می‌رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به الکتریکی قادر است مقدار جذب نور توسط محلول و یا درصد ترانس‌میتانس (میزان نور عبوری-T) آن را اندازه‌گیری نماید. نورسنج‌ها دارای انواع فتوشیمیایی، فتوالکتریکی و حرارتی می‌باشند. در ناحیه مرئی و ماوراءبنفش از نورسنج‌های فتوالکتریکی مانند فتوتیوب، فتومولتی‌پلایر تیوب و فتودیود استفاده می‌شود.

 

  1. الکتریک‌سنج (آشکارساز): وظیفه این قسمت، اندازه‌گیری جریان الکتریکی نورسنج می‌باشد. این وسیله در دو نوع عقربه‌ای و دیجیتالی وجود دارد.

 

نگهداری اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومترها دستگاه‌های بسیار تخصصی و گران‌قیمتی هستند. درستی کارکرد آنها تا حد زیاد به روش راه‌اندازی و استفاده بستگی دارد، همچنین دستگاه به شرایط محیط کار و کیفیت برق مورد استفاده وابسته است. نگهداری معمول برای این دستگاه‌ها متفاوت است و اقداماتی نظیر نظافت دقیق اجزا تا انجام روش‌های اجرایی تخصصی توسط مهندسین یا تکنیسین‌ها را شامل می‌شود. انجام دستورالعمل سازنده و استفاده صحیح، مدت فعالیت دستگاه را افزایش می‌دهد. در مدل‌های جدید، سازندگان، سیستم خودکار برای کالیبراسیون را در دستگاه‌ها طراحی کرده‌اند. در ادامه توصیه‌های مربوط به نگهداری عمومی گروه وسیعی از اسپکتروفتومترها ارائه شده است. نگهداری تخصصی این دستگاه‌ها برای هر مدل خاص تنها بر اساس توصیه‌های سازنده می‌تواند انجام گیرد. روش نگهداری اسپکتروفتومتر و تواتر کنترل‌های لازم به‌طور تقریبی به شرح زیر است:

 

ارزیابی محیط نصب دستگاه (سالانه)

محیطی که دستگاه در آنجا نصب شده است، باید بررسی شده و به لحاظ الکتریکی مورد ارزیابی قرار گیرد تا سلامت کاربر تضمین شود. این بررسی شامل ارزیابی وضعیت الکتریکی و ارزیابی فضای اختصاص داده شده به دستگاه در هنگام نصب می‌شود.

 

  • ارزیابی نحوه نصب الکتریکی

این اقدام جهت ایجاد اطمینان از موارد زیر باید انجام گیرد:

  1. یک خروجی یا پریز با سیم زمین موجود باشد.
  2. پریز باید در شرایط خوب بوده و طول سیم اتصال آن بیشتر از یک و نیم متر تا دستگاه نباشد.
  3. ولتاژ باید مناسب بوده و بنا به توصیه سازنده نباید بیشتر از ۵ درصد نوسان داشته باشد.

این موارد باید توسط یک تکنسین و یا مهندس برق کنترل شوند.

 

  • محل نصب و راه‌اندازی
  1. مطمئن شوید دستگاهی مانند سانتریفوژ که ارتعاش ایجاد می‌کند، در نزدیک دستگاه اسپکتروفتومتر قرار نگرفته است.
  2. دمای مناسب اتاق برای عملکرد این دستگاه‌ها بین ۱۰ تا ۴۰ درجه سانتی‌گراد است. رطوبت زیاد، گرد و خاک و یا حرارت بالا برای کارکرد صحیح دستگاه مناسب نیست.
  3. از راه‌اندازی و نصب دستگاه در محلی که نور مستقیم خورشید وجود دارد، بپرهیزید.
  4. دستگاه را در محلی که میدان‌های مغناطیسی و یا تشعشع قوی الکترومغناطیسی وجود دارد، نصب نکنید.
  5. در محل نصب نباید بخار و مواد خورنده وجود داشته باشند.

 

ارزیابی فیزیکی دستگاه (هر شش ماه)

نمای ظاهری اسپکتروفتومترها باید برای اطمینان از سالم بودن اجزا با توجه به توصیه‌های سازنده ارزیابی شود. مهم‌ترین این ارزیابی‌ها شامل موارد زیر است:

  1. از مناسب بودن میزی که دستگاه روی آن قرارگرفته است، مطمئن شوید.
  2. ساختار کلی دستگاه را کنترل نمایید. از محکم ‌‌بودن دکمه‌ها، سوئیچ‌های کنترل، دریچه‌های مکانیکی و برچسب شناسایی صحیح آنها اطمینان حاصل نمایید.
  3. از تمیز بودن لوازم جانبی، تَرَک ‌نداشتن و عملکرد مناسب و خوب آنها مطمئن شوید.
  4. از تنظیمات مکانیکی اجزا مانند (پیچ، مهره و غیره) و شرایط مناسب آنها اطمینان حاصل نمایید.
  5. از سلامت سیم‌های اتصال الکتریکی و عدم وجود شکاف و سوراخ در آنها مطمئن شوید. از اتصال خوب، عدم گسیختگی و شکاف در رابطه‌ای الکتریکی اطمینان حاصل نمایید.
  6. مطمئن شوید که سطوح عایق‌کاری کابل‌های برق نشانه‌های فرسودگی و مستهلک بودن را ندارند.
  7. اطمینان حاصل کنید که گرد و خاک، خوردگی، آلودگی و استهلاک در مسیر اتصال کابل‌های دستگاه وجود ندارد.
  8. اجزای الکتریکی خارجی دستگاه را از نظر وجود گرمای بیش از حد کنترل کنید.

 

نگهداری عمومی

  • نظافت مواد پاشیده شده

در صورت نشت مواد به محفظه نگهداری نمونه، لازم است مراحل زیر برای تمیز کردن، انجام داده شود:

  1. دستگاه را خاموش کنید و کابل برق را از پریز بکشید.
  2. از سرنگ برای تمیز کردن محفظه استفاده نمایید و تا حد امکان محلول را از محفظه خارج نمایید.
  3. محفظه نگهداری نمونه را با پارچه نرم کتان خشک کنید.
  4. قسمت خارجی دستگاه را با پارچه نرم و آغشته به آب تمیز نمایید. این نظافت شامل صفحه نمایش، صفحه کلید و کنترل‌ها است.

 

  • نظافت کووت‌های کوارتز

مراحل زیر برای نگهداری کووت‌های کوارتز در شرایط مناسب توصیه شده است:

  1. کووت‌ها را با محلول قلیایی رقیق‌شده مانند محلول NaOH 0/1 مولار و یک اسید رقیق مانند محلول HCl 0/1 مولار شستشو دهید.
  2. با آب مقطر چند بار کووت‌ها را شستشو دهید. همیشه از کووت‌های تمیز برای اندازه‌گیری میزان جذب استفاده کنید.
  3. اگر نمونه‌هایی که استفاده می‌کنید در کووت رسوب ایجاد می‌کنند، مراحل تمیز کردن آنها را با دقت بیشتری انجام دهید. بعضی سازندگان استفاده از شوینده‌های خاص را برای این منظور پیشنهاد می‌کنند.

 

  • تعویض باتری

در مدل‌های مختلفی از اسپکتروفتومتر برای ذخیره اطلاعاتی مانند تاریخ و زمان آزمایش از باتری استفاده می‌شود. مراحل تعویض باتری نیز مانند تجهیزات دیگر بوده و عبارت است از:

  1. علامت (شارژ کم باتری) روی صفحه نمایش را کنترل کنید.
  2. اسپکتروفتومتر را خاموش کنید.
  3. کابل اتصال به منبع تغذیه الکتریکی را قطع کنید.
  4. باتری‌های کهنه را از محفظه باتری درآورید.
  5. محل اتصال برق را تمیز کنید.
  6. باتری‌های جدید که دارای مشخصات یکسان با باتری اصلی هستند را جایگزین کنید.
  7. در محفظه را ببندید.
  8. دستگاه را دوباره به منبع تغذیه الکتریکی (پریز) وصل کنید.
  9. تاریخ و زمان را دوباره تنظیم نمایید.

 

  • تعویض لامپ دستگاه

لامپ یک جزء مصرفی با طول عمر محدود است و باید زمان تعویض آن را از قبل پیش‌بینی کرد. دلایلی مانند سوختن، رسوب فلز روی سطح داخلی لامپ و تبخیر سبب می‌شود نور ساطع‌شده از لامپ با ویژگی‌های ذکرشده دستگاه مطابقت نداشته باشد. مراحل تعویض لامپ بسته به مدل‌های مختلف دستگاه متفاوت است و باید به توصیه‌های سازنده توجه شود. مراحلی که در تمام مدل‌ها برای این کار مشترک است عبارت است از:

  1. از وجود نقص و یا سوختن لامپ اطمینان حاصل نمایید. در دستگاه‌های مدل جدید، در صفحه نمایش یک علامت یا کد خطا ظاهر می‌شود که نشان‌دهنده سوختن لامپ است. در مدل‌های قدیم، نوری از لامپ ساطع نمی‌شود.
  2. اسپکتروفتومتر را خاموش‌کنید.
  3. کابل اتصال به منبع تغذیه الکتریکی را قطع کنید.
  4. پیچ بالای محفظه لامپ را بازکنید.
  5. پیچی که لامپ را ثابت و محکم نگه می‌دارد را باز کنید.
  6. پیچ‌هایی که سیم برق را به لامپ متصل می‌کند را باز کنید (در بعضی مدل‌ها، این کار ممکن است، لازم نباشد؛ چون کابل برق مستقیم به انتهای لامپ متصل می‌شود).
  7. لامپ جدید با ویژگی‌های لامپ اصلی را جایگزین کنید. از دستکش برای تعویض لامپ استفاده کنید تا اثرانگشت روی سطح لامپ باقی نماند.
  8. کابل برق را دوباره به لامپ متصل نمایید.
  9. پیچ‌هایی که لامپ را جای خود نگه می‌دارد را ببندید.
  10. پیچ‌هایی که در محفظه لامپ را محکم می‌کند را ببندید.
  11. دستگاه را دوباره به منبع تغذیه الکتریکی وصل نمایید.
  12. کلید را روشن کنید و مراحل کالیبراسیون توصیه‌شده توسط سازنده را دوباره انجام دهید.

 

اقدامات پیشگیرانه

این اقدامات باید با توصیه‌های سازنده در مورد نحوه نگهداری معمول و تواتر آن مطابقت داشته باشد. مجموعه‌ای از مراحل رایج که در آزمایشگاه قابل اجرا است عبارتند از:

  1. سطوح خارجی اسپکتروفتومتر شامل کنترل‌ها و صفحه نمایش را تمیز کنید. این کار با استفاده از یک پارچه تمیز و نرم که به آب مقطر آغشته است، انجام می‌شود.
  2. کابل برق را بازبینی و تمیز کنید.
  3. از سالم و تمیز بودن لامپ اطمینان حاصل کنید، در غیر این صورت، لامپ را (با توجه به مشخصات لامپ اولیه) تعویض کنید. در اسپکتروفتومترهای مدل‌های جدیدتر، وضعیت و کارکرد لامپ به‌صورت خودکار به‌وسیله نرم‌افزاری که عملکرد و شرایط دستگاه را کنترل می‌کند، مشخص می‌شود. استفاده از این نرم‌افزار، تعیین زمان تعویض لامپ را آسان می‌کند. پس از تعویض لامپ، تنظیمات بعدی توصیه‌شده توسط سازنده را انجام دهید.
  4. شرایط فیوز محافظ را کنترل کنید. قبل از باز کردن محفظه فیوز مطمئن شوید که اسپکتروفتومتر خاموش و اتصالات فیوز تمیز است. اگر لازم است، فیوز را با یک فیوز جدید که مطابق توصیه‌های سازنده است، جایگزین سازید.
  5. دستگاه را در وضعیت فعال قرار دهید.
  6. کلید روشن را فعال و ۵ دقیقه زمان برای گرم شدن دستگاه درنظر بگیرید.
  7. جریان برق را در موقعیت‌های روشن و خاموش کلید بررسی نمایید.
  8. پانل جلو در دستگاه را با توجه به توصیه‌های سازنده کالیبر ‌کنید.
  9. دقت و حساسیت دستگاه را تعیین نمایید.
  10. آزمایش خطی بودن را (براساس قانون بیر) انجام دهید.
  11. اسپکتروفتومتر را به وضعیت اولیه برگردانید.

 

روش استفاده مناسب از اسپکتروفتومتر

  1. اسپکتروفتومتر را در هر نوبت استفاده کالیبر نمایید.
  2. در طول زمان اندازه‌گیری محفظه نمونه را بسته نگهدارید.
  3. از استفاده مجدد کووت‌های یکبار مصرف خودداری کنید.
  4. در طول‌موج پایین‌تر از ۳۱۰ نانومتر فقط از کووت‌های کوارتز استفاده کنید.
  5. اگر از حلال‌های آلی استفاده می‌کنید، از کووت‌های پلاستیکی استفاده نکنید
  6. برای تهیه محلول‌های استاندارد از لوازم شیشه‌ای از جنس سیلیکات بور و با کیفیت بالا استفاده کنید. در صورت امکان، از ظرف‌های شیشه‌ای دارای ترکیبات اکسید سدیم خودداری کنید، چون این ترکیب درنتیجه تماس طولانی با محلول استاندارد جذب محلول شده و نتایج نادرست ایجاد می‌کند.
  7. با احتیاط کووت‌های شیشه‌ای را پس از استفاده تمیز نمایید و از کووت‌هایی که روی سطوح خارجی آنها خراشیدگی دارد، استفاده نکنید.
  8. از معرف‌های با کیفیت مطلوب استفاده کنید. محلول‌های با کیفیت پایین، حتی در غلظت‌های بسیار کم آلودگی ایجاد می‌کنند. آب یا محلول‌هایی که برای رقیق‌سازی استفاده می‌شود، باید عاری از ناخالصی باشند.

 

فتومتر

اساس کار فتومتر همانند اسپکتروفتومتر است. در فتومتر، منوکروماتور فیلترهای شیشه‌ای هستند که بخش اعظم نور را جذب کرده و فقط طول‌موج‌های محدود موردنظر را عبور می‌دهند. فتومترهای پیشرفته دارای شش فیلتر رنگی ثابت بوده و قابلیت افزایش دو فیلتر دیگر را نیز دارند. فیلترهای نصب شده معمولاً دارای طول‌موج‌های ۳۴۰، ۴۰۵، ۴۹۲، ۵۲۰، ۵۴۶، ۵۷۸ و ۶۲۳ نانومتر می‌باشند.

فتومترهای نسل جدید تقریباً نیمه اتوماتیک هستند؛ به این معنی که دارای انکوباتور ۳۷ درجه با قابلیت برنامه‌ریزی جهت خوانش جذب نوری در زمان‌های متفاوت می‌باشند. قسمتی از واکنش آزمایش‌های آنزیمی که نیاز به خوانش متوالی در زمان‌های معین و در دمای ۳۷ درجه دارند در داخل دستگاه انجام می‌گیرد. بسیاری از فتومترها علاوه بر نمایشگرهای دیجیتالی، چاپگر نیز دارند.

 

عوامل ایجاد خطا در سیستم‌های فتومتری

مهم‌ترین عوامل ایجاد خطا در سیستم‌های فتومتری عبارتند از:

  1. کیفیت نامناسب منبع نوری: به علت کارکرد بیش از میزان ساعت استاندارد و یا کثیف شدن جداره بیرونی لامپ
  2. کیفیت نامناسب منوکروماتور: بیشتر به علت کثیفی فیلترها و گریتینگ توسط گردوغبار محیط ایجاد می‌شود.
  3. اشکال در آشکارساز: به دلیل کثیفی و یا ضعیف شدن گیرنده‌های نوری آشکارساز این اشکال بوجود می‌آید.

 

کنترل کیفی اسپکتروفتومتر و فتومتر

مهم‌ترین مواردی که در اسپکتروفتومترها و فتومترها مورد ارزیابی قرار می‌گیرند عبارتند از:

صحت فتومتریک، صحت طول‌موج، خطی بودن، رانش فتومتری و نورهای ناخواسته

در ادامه به بررسی این موارد و موارد بیشتر می‌پردازیم.

 

  1. صحت فتومتری

منظور از صحت فتومتری این است که آیا حداکثر جذب نوری به مقدار مشخص در طول‌موج خاص صورت می‌گیرد یا خیر. انجام این کار برای آزمایشگاه‌هایی که از استاندارد استفاده نمی‌کنند برای اطمینان از درستی جذب نوری دستگاه ضروری است. صحت فتومتری به عواملی چون توانایی لامپ در ارائه حداکثر تابش، پهنای طیف نور و نوع کیفیت منوکروماتور وابسته است. برای بررسی صحت فتومتری سه روش متداول وجود دارد:

  • استفاده از فیلترهای شیشه‌ای استاندارد با دانسیته خنثی و فیلتر شیشه‌ای دیدیمیوم

اولین نوع این شیشه‌ها شیشه‌های استاندارد با دانسیته خنثی می‌باشند که برای کنترل صحت فتومتری در طیف نور مرئی و برای کنترل درازمدت و به ‌شرط کالیبراسیون متداول، بسیار مناسب می‌باشند. این فیلترها با تغییر طول‌موج در گستره نور مرئی همواره میزان جذب ثابتی را نشان می‌دهند.

دومین نوع از فیلترهای شیشه‌ای استاندارد، فیلتر دیدیمیوم است که علاوه بر کنترل صحت فتومتر برای کنترل صحت طول‌موج نیز استفاده می‌شود. از این فیلتر در طول‌موج‌های ۲۷۰، ۲۸۰، ۳۰۰، ۳۲۰ و ۳۴۰ برای کنترل صحت فتومتری استفاده می‌شود.

 

  • استفاده از محلول‌های استاندارد

از جمله محلول‌های مورد استفاده می‌توان، دی کرومات پتاسیم، سولفات آمونیوم کبالت و نیترات پتاسیم را نام برد. ایراد این محلول‌ها در این است که به سبب تغییر جذبشان با زمان، دما و PH برای کنترل درازمدت مناسب نمی‌باشد. از محلول دی‌کرومات پتاسیم برای بررسی صحت فتومتری در طیف نور ماوراء بنفش و هم برای طیف نور مرئی استفاده می‌شود. در ادامه به بررسی صحت فتومتری با استفاده از محلول دی‌کرومات پتاسیم در طیف نور ماوراء بنفش و نور مرئی پرداخته خواهد شد.

 

  • استفاده از محلول‌های تجاری آماده

محلول‌هایی مانند Preciset BM که در طول‌موج ۴۰۵ نانومتر مورد استفاده قرار می‌گیرند.

 

بررسی صحت فتومتری با استفاده از محلول دی‌کرومات پتاسیم در طیف نور ماوراء بنفش:

برای این کار می‌توان از محلول ۰/۰۰۶درصد دی‌کرومات پتاسیم در اسید پرکلریک ۰٫۰۰۱N و یا محلول ۵۰ mg/Lit دی‌کرومات پتاسیم در اسید سولفوریک ۰٫۰۱N استفاده کرد. محلول ۰/۰۰۶ درصد دی‌کرومات پتاسیم دارای دو پیک جذبی در طول‌موج‌های ۲۵۷ و ۳۵۰ نانومتر بوده و جذب نوری برای محلول ۵۰ mg/Lit دی‌کرومات پتاسیم در طول‌موج ۳۵۰ نانومتر در محدوده ۰٫۰۰۵ ± ۰٫۵۳۶ می‌باشد (شکل ۷).

 اسپکتروفتومتری

شکل ۷. دو پیک جذبی محلول ۰/۰۰۶ درصد دی‌کرومات پتاسیم در طول‌موج‌های ۲۵۷ و ۳۵۰

 

لازم به ذکر است که این روش برای بررسی صحت فتومتری، فتومترهایی که طول‌موج ۳۵۰ نانومتر ندارند امکان‌پذیر نیست.

 

بررسی صحت فتومتری با استفاده از محلول دی‌کرومات پتاسیم در طیف نور مرئی:

بررسی صحت فتومتری در طیف نور مرئی نیز می‌بایست انجام شود. به این منظور از محلول ۰/۰۶ درصد  دی‌کرومات پتاسیم در اسید پرکلریک ۰٫۰۰۱N استفاده می‌شود. طیف جذبی این محلول در طول‌موج ۴۳۰ نانومتر همان‌گونه که در شکل نشان داده شده است دارای جذب ثابتی برابر با ۱A می‌باشد (شکل ۸).

 اسپکتروفتومتری

شکل ۸. محلول دی‌کرومات پتاسیم ۰٫۰۶ درصد و نمودار طیف جذبی نور مرئی

 

  1. صحت طول‌موج

این روش برای کنترل اینکه طول‌موج جداشده توسط سیستم منوکروماتور صحیح است یا خیر، به کار می‌رود.

برای اطمینان از صحت طول‌موج جداشده روش‌هایی متداول است که در ادامه به برخی از آنها می‌پردازیم:

 

  • راه چشمی:

می‌دانیم که هر طول‌موج نور دارای رنگ خاصی است. برای کنترل، طول‌موج اسپکتروفتومتر را بر روی طول‌موج موردنظر تنظیم کرده و رنگ نور را با قرار دادن یک مقوای سفید در جلوی شیار خروجی مشاهده می‌کنیم. مثلاً در ۵۹۰ نانومتر، رنگ باید زرد باشد.

 

  • جایگزینی منبع نور:

صحیح‌ترین راه برای بررسی صحت طول‌موج، جایگزینی منبع نوری معمولی اسپکتروفتومتری با منبع نوری دیگر است که دارای ماکزیمم تابش نوری در طول‌موج‌های مشخص می‌باشد؛ مثلاً لامپ جیوه دارای تابش قوی در طول‌موج‌های ۵۴۶، ۴۳۶، ۴۰۵، ۳۶۵ و ۳۱۳ می‌باشد.

 

  • استفاده از فیلترهای شیشه‌ای از قبیل Holmium oxide و didymium (دیدیمیوم):

این فیلترها دارای پیک‌های جذبی بسیار مشخصی در طول‌موج‌های خاصی می‌باشند. دستگاه را روشن کرده و طول‌موج را برای ۵۳۰ نانومتر تنظیم کنید. فیلتر دیدیمیوم را در محفظه کووت قرار دهید. T یا عبور را بین ۵۰ تا ۶۰ درصد تنظیم کنید. طول‌موج را بر روی ۵۲۰ نانومتر قرار دهید و به‌آرامی طول‌موج را زیاد کنید (به سمت ۵۴۰ نانومتر) و کمترین درصد T را مشاهده کرده و طول‌موج را یادداشت کنید. حداقل درصد T باید در طول‌موج ۱±۵۳۰ نانومتر بدست آید. اگر این‌چنین نشد، باید طول‌موج تنظیم شود و دوباره مراحل فوق تکرار شود تا حداقل درصدT  در ۵۳۰ نانومتر قرار گیرد. فیلتر didymium  در ۵۳۰ و ۵۸۵ نانومتر حداقل درصد عبور نور را دارد.

 

  • استفاده از محلول‌های رنگی:

روش دیگر برای کنترل کیفی صحت طول‌موج استفاده از محلول‌های رنگی می باشد که در طول‌موج‌های مشخص دارای ماکزیمم جذب هستند، به‌عنوان مثال می‌توان محلول‌های رنگی زیر را نام برد: محلول دی‌کرومات پتاسیم، محلول پارانیتروفنل، محلول سولفات آمونیوم کبالت و محلول سیان‌مت‌هموگلوبین. راحت‌ترین و قابل دسترس‌ترین روش برای اسپکتروفتومترهایی که با نور مرئی کار می‌کنند، استفاده از محلول سیان‌مت‌هموگلوبین بوده که دارای حداکثر جذب نوری در طول‌موج ۵۴۰ نانومتر است. روش کار به این صورت است که ابتدا دستگاه را با محلول درابکین (به‌عنوان بلانک) صفر کرده و سپس جذب نوری نمونه در ‌طول‌موج ۵۳۰، ۵۳۵، ۵۴۰، ۵۴۵ و ۵۵۰ نانومتر قرائت می‌گردد. لازم به ذکر است پس از هر تغییر طول‌موج، باید جذب نوری دستگاه با محلول بلانک صفر گردد. براساس طول‌موج و میزان جذب، منحنی مربوطه رسم می‌گردد. درصورتی‌که دستگاه دارای صحت طول‌موج باشد، حداکثر جذب نوری را در ۵۴۰ نانومتر نشان می‌دهد. هر سه تا شش ماه یک بار و یا پس از هر تغییر و تعمیری بر روی دستگاه، می‌بایست کنترل صحت طول‌موج انجام شود.

 

  1. خطی بودن

هدف از این آزمون تعیین محدوده‌ای است که در آن ارتباط خطی بین نور جذب‌شده و خوانش فتومتر وجود دارد. با این آزمایش درواقع میزان عدم صحت جذب نوری در هر رقت بررسی می‌شود. برای این ارزیابی از محلول‌های مختلفی که تا حد امکان پایدار باشند می‌توان استفاده نمود. به دلیل تأثیر متغیرهایی از قبیل خطای رقت، کاهش پایداری، تغییرات PH و تأثیرات دما در محلول‌ها، باید در استفاده از این روش عوامل یادشده تحت کنترل قرار گیرند.

بررسی و ارزیابی خطی بودن دستگاه اسپکتروفتومتر با استفاده از رقت‌های مختلف محلول‌هایی نظیر دی‌کرومات پتاسیم در طول‌موج ۳۵۰ نانومتر، محلول سیان‌مت‌هموگلوبین در طول‌موج ۵۴۰ نانومتر، محلول پارانیتروفنل در طول‌موج ۴۰۵ نانومتر، محلول سولفات مس در طول‌موج ۶۵۰ نانومتر، محلول سولفات آمونیوم کبالت در طول‌موج ۵۱۲ نانومتر و محلول سولفات نیکل در طول‌موج ۵۵۰ نانومتر انجام می‌شود. محلول‌های مورد استفاده برای کنترل خطی بودن، باید دارای رنگ پایدار بوده و در محدوده جذب ۲ تا ۱ خطی باشند. محلول دی‌کرومات پتاسیم بسیار پایدار است و رنگ آن تا چند ماه پایدار می‌ماند. پودر دی‌کرومات را در Oven، ۱۱۰ درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت خشک کرده و۱۰۰mg  آن را با اسید سولفوریک ۰٫۰۱N به حجم یک لیتر می‌رسانیم، این محلول به‌صورت استوک در شیشه تیره نگهداری می‌شود. از این محلول استوک، رقت‌های زیر را تهیه کرده و جذب نوری خوانده‌شده را با جذب نوری مورد انتظار بر روی نمودار رسم می‌کنیم. طول‌موج موردنظر ۳۵۰ نانومتر می‌باشد.

 

در جدول بالا، اگر نمودار جذب نوری مورد را برحسب جذب نوری بدست آمده رسم کنیم، نمودار بدست آمده خطی خواهد بود و شیب خط، یک است. در شکل ۹ با استفاده از نرم‌افزار متلب (MATLAB) این نمودار رسم شده است و همان‌طور که قابل مشاهده است، نمودار، خطی و شیب خط یک است.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۹. نمودار جذب نوری مورد انتظار (Jazbe Morede Entezar) برحسب جذب نوری

بدست آمده (Jazbe Bedast Amade)

 

آزمایش خطی بودن را باید بعد از هر بار تعمیر دستگاه و یا در فواصل زمانی معین انجام داد.

 

  1. کنترل تعویض لامپ

لامپ‌ها به‌طور آرام و پیوسته در معرض فرسودگی قرار دارند، در نتیجه باید در فواصل زمانی مرتب آنها را کنترل و بررسی کرد. درصورتی‌که ناپایداری میزان جذب به علت خرابی لامپ باشد باید آن را تعویض کرد. بعد از نصب لامپ جدید باید سیستم نوری دستگاه تنظیم شود تا حداکثر میزان نور، پس از عبور از کووت به فتوسل برسد. کنترل تعویض لامپ به دور روش قابل اجراست:

 

روش اول: استفاده از آب مقطر

  • یک کووت پر از آب مقطر در دستگاه قرار دهید و طول‌موج مناسب را انتخاب کنید (۵۵۰ نانومتر)
  • عقربه گالوانومتر در وسط صفحه تنظیم شود (T = 50%, A=0.3)
  • لامپ و دیگر اجزای سیستم نوری به‌نوبت، کمی تغییر داده شوند و اثر آنها بر روی T یا A بررسی شود.
  • محلی که حداکثر T بدست آید بهترین موقعیت هر یک از اجزای سیستم نوری می‌باشد.
  • در صورت نیاز، تغییرات جزئی در موقعیت لامپ ایجاد کنید تا حداکثر میزان عبور نور بدست آید.

 

روش دوم:

در بعضی از اسپکتروفتومترها امکان قرار دادن یک صفحه سفید در برابر فتوسل وجود دارد که تصویر واضحی از فیلامنت لامپ بر روی آن مشاهده می‌شود. اگر این تصویر محو باشد یا عمودی نباشد تغییراتی در وضعیت لامپ داده شود تا بهترین و واضح‌ترین تصویر بدست آید.

 

  1. آزمایش رانش فتومتری

یکی از منابع اصلی خطا در اسپکتروفتومتری وجود رانش فتومتری (عدم پایداری مقدار جذب قرائت‌شده) نسبت به زمان یا Drift می‌باشد. این رانش ممکن است به دلیل فرسودگی شدید منبع نور باشد. بهتر است پس از خواندن هر ۵ تا ۱۰ تست، رانش را کنترل کرده و دستگاه را مجدداً صفر کنید. صفر را با کووت خالی یا کووت محتوی آب مقطر یا محلول بلانک تنظیم کنید.

اگر اسپکتروفتومتر به مدت زیادی روشن باشد دستگاه گرم شده و عملکرد اولیه آن از دست می‌رود و drift ایجاد می‌شود. اسپکتروفتومتری خوب است که drift نداشته باشد.

 

روش کنترل:

  • در موقع انجام تست‌های مختلف (مثلاً قند خون) به فاصله هر ۱۰ تا ۲۰ بار خواندن تست‌ها، بلانک را می‌گذاریم که نباید تغییر کرده باشد. در صورت وجود drift باید در فواصل کوتاه، دستگاه را صفر کنیم یا مقدار بالا یا پایین رفته را از عدد خوانده شده تست‌ها کم یا زیاد کنیم.
  • طول‌موج مناسبی را انتخاب کنید (۵۵۰ نانومتر). دستگاه را روشن کرده و کووت محتوی آب مقطر را در دستگاه قرار دهید و درصد عبور را ۵۰ درصد تنظیم کنید، زمان را یادداشت کنید. پس از ۳۰ دقیقه دوباره درصد عبور را چک کنید.

 

  1. نورهای ناخواسته

نورهای ناخواسته نورهایی هستند که غیر از نور عبور داده شده از منوکروماتور، به نمونه تابیده شده و موجب بروز خطا می‌شوند. برای بررسی این موضوع از محلول‌هایی که نور را به‌طور کامل جذب می‌کنند مانند استن یا نیتریت سدیم، یدید سدیم و کلرید پتاسیم در طول‌موج‌های خاص استفاده می‌شود. در این حالت می‌بایست ترانس‌میتانس صفر درصد (جذب بی‌نهایت و غیرقابل خوانش) باشد زیرا نور از محلول عبور نکرده و به دتکتور نمی‌رسد.

 

  1. کدورت محلول‌ها

برای اندازه‌گیری فتومتری، معرف‌ها و محلول‌های حاصل باید شفاف باشد. در صورت کدورت، واکنش باید تکرار شود. در این مواقع، آزمایش را با رقیق کردن نمونه تکرار کنید و یا به‌صورت sample blank عمل کرده و جذب نوری بلانک نمونه را از سایر لوله‌ها کم کنید.

 

 

فتومترهای شعله‌ای یا Flame Photometer

دستگاه‌های فتومترشعله‌ای سه اختلاف عمده با وسایلی که تاکنون شرح داده شده است (اسپکترفتومترها) دارند که این تفاوت‌ها به‌صورت زیر می‌باشند:

  1. در فتومترهای شعله‌ای منبع انرژی و نگهدارنده نمونه، در لوله آزمایش قرار دارد.
  2. اساس و مبنای اصلی اندازه‌گیری در فتومترهای شعله‌ای اندازه‌گیری نشر نور به‌وسیله نمونه است و نه جذب نور (یک نوع فتومتر شعله‌ای بر اساس جذب اتمی نیز شرح داده خواهد شد)
  3. در روش‌های فتومتر شعله‌ای، فقط غلظت فلزات خالص را می‌توان اندازه‌گیری کرد.

اساس کار دستگاه‌های فتومتر شعله‌ای نشر اتمی بدین شکل است که وقتی یک اتم از حالت تحریکی به حالت زمینه خود بازمی‌گردد، یک فوتون با طول‌موج مخصوص به خود گسیل می‌کند. منبع انرژی موردنیاز برای بردن اتم‌ها به حالت تحریکی، همان فوتون می‌باشد. اندازه طول‌موج پرتو نشری حاصل از نمونه در یک طول‌موج، بستگی به غلظت اتم‌های نمونه دارد، اما دستگاه‌های فتومتر شعله‌ای جذب اتمی، واکنش عکس حالت فوق را دارند، یعنی یک منبع انرژی با طول‌موج مخصوص، انرژی حاصل جهت تحریک اتم‌ها را برای آنالیز نمونه تهیه کرده و نمونه انرژی حاصل از شعله را جذب می‌کند تا به حالت تحریکی برود. اتم‌هایی که در شعله با طول‌موج‌های مخصوص، جذب انتخابی می‌شوند، اتم‌ها را به حالت تحریکی می‌برند. درجه قدرت جذب نمونه در یک طول‌موج، متناسب با غلظت اتم‌های آن نمونه است.

 

فتومتر شعله‌ای نشر اتمی (Emission Atomic)

با استفاده از منابع انرژی معمولی، تنها حدود یک درصد از اتم‌های نمونه مورد بررسی، به حالت تحریکی برده می‌شوند و طول‌موجی که از این طریق حاصل می‌شود فقط مربوط به اثر یک درصد از اتم‌هاست. این عوامل باعث می‌شود که از عناصر خاصی جهت فتومتر شعله‌ای نشر اتمی استفاده شود. به همین علت، این روش برای محاسبه غلظت عناصر فلزی یونی مثل: +K+، Na و +Li مورد استفاده قرار می‌گیرد. البته به بیشتر دستگاه‌های مدرن، ضمائم الکتریکی بیشتری اضافه شده تا بتوان غلظت عناصری مثل +Ca2 را نیز به دست آورد. شمای کلی دستگاه‌های فتومتر شعله‌ای در شکل ۱۰ نشان داده شده است.

در روش‌های فتومتر شعله‌ای، نمونه در یک محلول، ترکیب شده و سپس توسط قسمت Nebulizer به پودر تبدیل می‌شود و بعداً به شعله تزریق می‌گردد. از گاز طبیعی یا پروپان همراه با ترکیبی از هوای فشرده برای این منظور استفاده می‌شود. پس از اینکه نمونه به پودر تبدیل شد، ذرات درشت آن، ته‌نشین می‌شوند و ذرات ریز آن به شعله می‌رسند. در شعله تعدادی از اتم‌ها به حالت تحریکی رفته و سپس نشر می‌کنند و یک طول‌موج اختصاصی بر اساس مقدار برانگیختگی اتم‌ها حاصل می‌شود. انرژی نشری توسط یک سیستم نوری ساده (عدسی و فیلتر) کانونی شده و به آشکارساز می‌رسد. برای جبران تغییرات در آهنگ جذب نمونه و تولید پودر از نمونه و همچنین خواص اختصاصی شعله، در بیشتر فتومترهای شعله‌ای از استانداردهای داخلی استفاده می‌شود.

معمولاً از لیتیم-  Li+ به‌عنوان استاندارد داخلی استفاده می‌کنند، زیرا که از تغییرات شدت و میزان شعله جلوگیری می‌شود. بدین ترتیب مقداری از لیتیم که در نمونه بیولوژیکی وجود ندارد، به نمونه اضافه می‌شود و سیستم، نوری با طول‌موج ۷۶۰ نانومتر حاصل می‌کند که این نور چون طول‌موج بلندی دارد، به‌خوبی از نور حاصل از پتاسیم و سدیم قابل تشخیص است.

نحوه استفاده از سیستم استاندارد داخلی بدین صورت است که نمک +Li به‌آهستگی و تحت شرایط کنترل شده، به نمونه اضافه می‌شود و یک کانال نوری جهت اندازه‌گیری نور حاصله از +Li استفاده می‌شود که به‌اتفاق غلظت شناخته شده +Li برای محاسبه غلظت +K+، Na بکار برده می‌شود. کاربرد استاندارد داخلی و بافر، امکان خوانش مستقیم غلظت‌های سدیم و پتاسیم و نیز امکان رقیق کردن آسان سرم، از ویژگی‌هایی هستند که فتومتر شعله‌ای را به دستگاه مناسبی برای سنجش الکترولیت‌ها مخصوصاً سدیم و پتاسیم در آزمایشگاه بالینی تبدیل می‌کند.

مشکلاتی که در هنگام استفاده از +Li به‌عنوان استاندارد داخلی پیش می‌آید، عبارتند از اینکه اگر تغییرات ایجاد شده توسط دستگاه کوچک باشد، کارآیی آن خوب است ولی اگر تغییرات داخلی دستگاه زیاد باشد از آن نمی‌توان استفاده کرد. چون از +Li برای درمان بیماران روانی استفاده می‌شود، بنابراین برای کنترل مقدار آن در سرم بیماران لازم است که مقدار آن را در سرم خون بیماران اندازه‌گیری کرد و مسلم است که آن را نمی‌توان با سیستمی که +Li به‌عنوان استاندارد داخلی آن است، سنجش نمود و به‌ناچار دستگاه‌های فتومتر شعله‌ای جدیدی ساخته شده‌اند که مجهز به فیلتر مخصوص هستند و لیتیم سرم را با استفاده از پتاسیم به‌عنوان استاندارد داخلی، اندازه‌گیری می‌کنند.

 

فتومتر شعله‌ای جذب اتمی (Absorption Atomic)

در فتومتر شعله‌ای، منبع نوری که استفاده می‌شود فقط یک درصد اتم‌ها را به حالت تحریکی می‌برد و ۹۹ درصد اتم‌ها در حالت زمینه‌شان باقی می‌مانند. پس در عناصر فلزی، الکترون‌هایی که بر اساس حرارت تهییج نشده‌اند، در حالت زمینه قرار دارند و قادرند انرژی نورانی الکترون‌های برانگیخته شده را جذب کرده و خود به مدارهای بالاتر بروند و حتی از خود، فوتون گسیل نمایند. اساس کار این نوع اسپکتروفتومتر بر مبنای پدیده بالا، بنا شده است، بطوریکه نور لامپ مخصوص به فلزی که در شعله قرار گرفته است، تابیده شده و مقدار انرژی که به‌وسیله فلز موردنظر جذب می‌شود، اندازه‌گیری می‌گردد.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۱۰. شمای یک فتومتر شعله‌ای از نوع: ۱) نشر اتمی و ۲) جذب اتمی

عمدتاً از دستگاه‌های فتومتر شعله‌ای جذب اتمی برای محاسبه دقیق غلظت عناصر فلزی مثل مس، روی، آهن، سرب، منیزیم، سدیم پتاسیم، کادمیوم، کرومیوم، جیوه، لیتیم، نیکل، بیسموت، کبالت، منگنز و تعدادی دیگر از عناصر در مایعات بیولوژیک استفاده می‌شود. اساس کار این روش مبتنی بر جذب انرژی با طول‌موج‌های مشخص، توسط اتم‌های نمونه در شعله می‌باشد.

برای تهیه انرژی با طول‌موج‌های اختصاصی از یک منبع نورانی استفاده می‌شود که این منبع نورانی، طول‌موج‌های مشخص را برای تحریک اتم‌های نمونه مهیا می‌سازد. این منبع انرژی یک لامپ خلأ کاتدی است. معمولاً این لامپ‌ها به‌وسیله یک پوشش از عناصر فلزی که اندازه‌گیری غلظت آنها موردنظر است، پوشیده شده‌اند. یعنی برای هر فلز خاص، یک نوع لامپ مجزا مورد استفاده قرار می‌گیرد، اما خواص اختصاصی چند فلز مشخص این امکان را می‌دهد که از دو یا سه لامپ در دستگاه‌ها استفاده شود. در این لامپ‌ها، کاتد تحت شرایط اتمسفری، با یک گاز خنثی قرار می‌گیرد و هنگامی که کاتد گرم می‌شود، اتم‌های کاتد سطح آن را ترک کرده و این اتم‌ها در اثر برخورد با الکترون‌ها و یون‌ها تحریک می‌شوند و در هنگام بازگشت آنها به حالت زمینه‌شان، طول‌موج‌های مشخص و اختصاصی آزاد می‌نمایند که مستقیماً به شعله رسیده و نمونه را تحت تأثیر قرار می‌دهد.

ازآنجایی‌که نمونه مورد آزمایش، تحت تأثیر دو نوع انرژی حاصل از لامپ و حاصل از شعله قرار می‌گیرد، بنابراین می‌بایست این دو نوع انرژی از یکدیگر تمایز یابند. برای تمایز این دو از یک دیسک چرخان یا پره چرخان استفاده می‌شود تا اینکه بین این دو نوع انرژی و واکنش آنها با اتم‌های نمونه مورد بررسی و رسیدن آنها به آشکارساز، تمایز وجود داشته باشد. این دیسک چرخان، بین منبع انرژی نورانی و شعله قرار دارد؛ یعنی هنگامی که پره چرخان جلوی نور را می‌گیرد، اتم‌های نمونه فقط توسط شعله تحریک می‌شوند و در حالتی که پره چرخان جلوی نور لامپ نمی‌باشد، انرژی نورانی باعث تحریک اتم‌های نمونه می‌شود.

 

فلورومتری Fluorometry

از دیگر روش‌های طیف‌سنجی، استفاده از خاصیت فلورسانس است که در برخی مواد وجود دارد. این خاصیت در بعضی از کریستال‌ها وجود دارد که اگر آنها انرژی جذب نمایند، این انرژی را به‌صورت نور مرئی، گسیل می‌نمایند. مبنای فیزیکی این روش براساس خاصیت تعدادی از مولکول‌هاست که در یک طیف اختصاصی، نور نشر می‌نمایند. این طیف نشری ضرورتاً پس از جذب انرژی توسط نمونه و به حالت تحریکی رسیدن آن انجام می‌شود و مقدار برانگیختگی این مولکول‌ها بستگی به دامنه و طول‌موج منبع نورانی، تغییرات منبع انرژی الکتریکی، طول‌موج انتخابی و مدارهای آشکارسازی که در فلورومتری استفاده شده و خیلی حساس هستند، دارد.

از لامپ‌های دایره‌ای جیوه‌ای برای تهیه انرژی نورانی تحریکی در محدوده طول‌موج‌های ۳۶۵ و ۴۰۵ و ۴۳۶ و ۴۵۶ نانومتر استفاده می‌گردد. در شکل ۱۱ شماتیک یک نوع دستگاه فلورومتری نشان داده شده است.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۱۱. شمای یک دستگاه فلورومتری که برای اندازه‌گیری غلظت موادی که خاصیت فلورسانس دارند، بکار برده می‌شود

 

در این روش، از لوله افزاینده نوری به‌عنوان آشکارساز استفاده می‌شود. از مزایای این روش بر روش‌های متداول اسپکتروفتومتری، حساسیت بسیار بالای این روش است، چرا که در روش‌های اسپکتروفتومتری اختلاف جذب محلول که غلظت آن صفر است یعنی تمامی نور از آن عبور می‌نماید و ماده مجهول و نمونه‌ای که برای اندازه‌گیری بکار می‌رود، مشخص نیست. در این روش، اندازه‌گیری مستقیم فلورسانس نمونه، برای محاسبه غلظت ماده مجهول استفاده می‌گردد.

از دیگر مزایای این روش، اختصاصی بودن آن است، چرا که فقط تعداد اندکی از مواد، خاصیت فلورسانس دارند. از عمده معایب روش‌های فلورومتری، حساسیت آنها به pH و دمای نمونه را می‌توان نام برد. به‌طور کلی باید متذکر شد که خاصیت فلورسانس به pH حساس است و این حساسیت به pH به‌عنوان یکی از معایب کلی این روش محسوب می‌گردد.

 

اسپکتروسکوپی مادون قرمز

نور مادون قرمز به آن بخش از طیف الکترومغناطیس که بین امواج مرئی و مایکروویو قرار دارد، گفته می‌شود که به سه ناحیه نزدیک، میانی و دور تقسیم می‌شود. قسمت مفید و عملی این بخش در طیف‌سنجی مادون قرمز، ناحیه میانی آن است که طول‌موجی در حدود ۲۵۰۰ – ۸۰۰ نانومتر دارد.  طیف‌سنجی مادون قرمز روشی برای شناسایی مولکول‌ها و بخصوص گروه عاملی مولکول‌هاست. هر ماده‌ای، طیف مادون ‌قرمز مخصوص به خود را دارد و همانند اثرانگشت، مختص خود مولکول می‌باشد. انرژی امواج مادون‌ قرمز در حدی نیست که بتواند باعث برانگیختگی الکترون‌ها شود و آنها را به ترازهای بالاتر ببرد، بلکه فقط باعث ایجاد ارتعاش پیوندهای کووالانسی اتم‌ها و مولکول‌ها می‌شود. جذب تابش مادون قرمز همانند هر فرآیند جذب دیگر، یک فرآیند کوانتائی است؛ بدین صورت که فقط فرکانس‌های مشخصی از تابش مادون قرمز توسط مولکول جذب می‌گردد. به‌طور کلی وقتی پرتو مادون قرمز به نمونه‌ای می‌تابد، امکان دو نوع ارتعاش در اتم‌های نمونه وجود دارد؛ یک نوع ارتعاش از نوع کششی است که در این نوع، فاصله بین اتم‌ها کم و زیاد می‌شود و نوع دیگر ارتعاش خَمِشی است که این نوع ارتعاش باعث تغییر زاویه بین پیوندها می‌شود (شکل ۱۲) در فرآیند جذب، فرکانس‌هایی از مادون قرمز که با فرکانس‌های ارتعاشی طبیعی مولکول موردنظر تطبیق کند، جذب خواهد شد و انرژی جذب‌شده برای افزایش دامنه حرکت پیوندهای موجود در مولکول بکار گرفته می‌شود. در طیف مادون قرمز، فقط آن دسته از ارتعاشات که زاییده تغییر هماهنگ در دی پل ممان مولکولی است، دیده می‌شوند. یعنی تا تغییر در ممان مغناطیسی مشاهده نشود، طیف مادون قرمز ملاحظه نخواهد شد. در طیف‌سنجی مادون قرمز، انرژی جذب‌شده توسط ماده بیشتر به‌صورت گرما ظاهر می‌شود.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۱۲. انواع ارتعاش‌های مولکول‌ها در اثر تابش مادون قرمز

 

در این ناحیه، انرژی امواج ۱ تا ۱۰ کیلوکالری بر مول است که برای تحریک الکترون‌ها کافی نیست و فقط صرف مرتعش شدن پیوندها می‌شود که به آن طیف ارتعاشی (Vibrational) می‌گویند که از منابع تولید آن می‌توان خروجی یک منوکرومات با شدت زیاد که طیف وسیعی از طول‌موج‌ها را شامل می‌شود را نام برد.

باید توجه داشت که تمامی پیوندهای موجود در مولکول قادر به جذب انرژی مادون قرمز نیستند، حتی اگر فرکانس پرتو کاملاً با فرکانس ارتعاش طبیعی مولکول تطبیق کند. فقط آن پیوندهایی که دارای گشتاور دوقطبی هستند، قادر به جذب انرژی مادون قرمز خواهند بود؛ مثلاً پیوندهای متقارن موجود در H2 و Cl2 مادون قرمز را جذب نمی‌کنند. یک پیوند باید از خود خصلت الکتریکی بروز دهد تا انتقال انرژی از پرتو به مولکول صورت گیرد. اکثر پیوندهایی که چنین خصلتی را دارند، پیوندهای موجود در آلکن‌ها وآلکین‌های متقارن هستند.

 

طیف‌سنجی تفکیکی مادون قرمز

قسمت‌های مختلف یک دستگاه طیف‌سنجی تفکیکی مادون قرمز به شرح زیر است (شکل ۱۳):

شکاف جهت ورود نور: هر چقدر شکاف ورود نور باریک‌تر باشد، طیف حاصل‌شده نیز مجزاتر خواهد بود و اجزای نمونه، بهتر قابل تشخیص است.

عدسی یا کلیماتور: از عدسی برای کانونی کردن نور فرودی به نمونه استفاده می‌شود و کلیماتور نیز پرتوها را به‌صورت موازی درآورده تا به‌صورت یکنواخت به‌تمامی نمونه برخورد نمایند.

عامل پخش‌کننده (منشور یا توریپراش): این قسمت، نور حاصله از نمونه را به طول‌موج‌های مختلف آن مجزا می‌نماید.

عدسی یا آینه ثانویه: این بخش برای کانونی کردن یا جمع‌آوری نور ایجاد شده از واکنش نور اولیه با نمونه بکار می‌رود.

عدسی چشمی و یا فتومتر: اگر به قسمت‌های اشاره شده قبلی یک عدسی چشمی اضافه شود به آن اسپکتروسکوپ گویند و اگر به آنها فتومتر اضافه گردد به آن اسپکتروفتومتر گویند. برای انجام آزمایش، ابتدا پرتو مادون قرمز توسط یک آینه به دو پرتو تقسیم می‌شود؛ یکی از این پرتوها از نمونه و دیگری از یک مرجع که حلالی است که نمونه در آن حل شده، عبور داده می‌شود. علت استفاده از مرجع این است که با استفاده از نور عبوری از هر دو، بتوان درصد نور عبوری از نمونه را به‌دست آورد. پس از عبور مادون قرمز از هر دو، بار دیگر با استفاده از دو آینه، آنها به سمت آشکارسازها هدایت می‌شوند تا در آنجا میزان پرتو عبوری از هر دو را تعیین و سپس طیف نمونه توسط ثبات ترسیم شود.

 اسپکتروفتومتری

شکل ۱۳. دیاگرام یک دستگاه طیف‌سنجی تفکیکی مادون قرمز

 

برخی از منابع:

  • کتاب راهنمای نگهداشت تجهیزات آزمایشگاهی، ویرایش دوم، سازمان بهداشت جهانی، مترجمان: خانم مهری علی‌اصغرپور، مهناز صارمی
  • کتاب تجهیزات آزمایشگاهی، اصول فنی و نگهداری و روش‌های کنترل کیفی، سیدبهزاد سیدعلیخانی
  • کتاب PAS تکنیک‌های عملی آزمایشگاهی تشخیصی، جلد ششم، کنترل کیفی مواد و تجهیزات آزمایشگاهی، جدیدترین مرجع مقادیر آزمایشگاهی، دکتر امیر سیدعلی مهبد، سیدرضا موسوی
  • کتاب مقدمات آشنایی و اصول کلی آزمایشگاه تشخیص طبی، رضا انصاری، سعید طهماسبی
  • کتاب اصول فیزیکی دستگاه‌های آزمایشگاهی، دکتر داریوش شهبازی گهرویی
  • Maintenance Manual for Laboratory Equipment, 2nd Edition, World Health Organization (book)
  • Webster John G. Encyclopedia of Medical Divices and Instrumentation. 2nd ed., John Wiley & Sons Inc.,
  • Bronzino Joseph D. The Biomedical Engineering Handbook. 2nd ed.,

اسپکتروفتومتری

فلیم فتومتر Flame Photometer

آزمایش پوست با چراغ وود

بیولومینسانس

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • اسپکتروفتومتری
  • تجهیزات آزمایشگاهی
  • مهندس احسان درخشان نیا

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *