روش‌های عملی در Real-Time PCR قسمت ۴

روش‌های عملی در Time PCR – Real

روش‌های عملی در  Real-Time PCR

قسمت ۴

نویسندگان:

شهرام شجاع (دانشجوی کارشناسی ارشد)

دکتر رضا میرنژاد (باکتریولوژیست- استادیار دانشگاه)

 

در سه قسمت گذشته تعاریف، کلیات، متدهای گوناگون، اصطــــــــــــلاحات متداول و روش‌های عملی در Real-Time PCR  ارائه گردید، در این مبحث سعی شده تا به صورت کاملاً عملی انجام تست و تفسیر نتایج و همچنین نکاتی در مورد تنظیم  Baseline و Threshold Line  آورده شود.

 

راه‌اندازی یک پلیت به روش Absolute Quantitation در دستگاه ABI7500

  • ابتدا از منوی start بر روی نرم افزار برنامه کلیک کنید تا پنجره Quick start document باز گردد. (شکل ۱)

شکل ۱: باز کردن منوی Start

  • سپس در همین پنجره بر روی باکس Create New Document کلیک کرده تا پنــــجره New Document Wizard باز شود.
  • سپس در پنجره New Document Wizard از قسمت Assay نـــــــــــــــــــوع آزمون (Absolute Quantitation) را انتخاب کنید. در قسمت Comment می‌توانید هرگونه یاداشتی که داشته باشید را مرقوم نمائید.
  • در قسمت Plate Name برای آزمون خود یک نام انتخاب و سپس Next را کلیک کنید. (شکل۲)

شکل ۲: انتخاب نام و نوع آزمون

  • در پنجره New Document Wizard جدیدی که باز می‌شود، در قسـمت باکس Reference dye رنگ مرجع مورد استفاده در آزمون خود را انتخاب کنید. بر روی Detector مورد نظرتان را های‌لایت کرده و کلمه Add را کلیک کنید تا Detector مورد نظرتان برای آزمون انتخاب گردد. چنانچه Detector مورد نظر وجود ندارد برای ایجاد Detector جدید به قسمت بعد رفته و در پایان این مرحله کلمه Next را کلیک نمایید. (شکل ۳)

شکل ۳: نحوه انتخاب Detector

  • در پنجره New Document Wizard جدیدی که باز می‌شود برای هر چاهک آزمون نوع Detector و وظیفه آن را می‌توان انتخاب کرد.

برای این منظور چاهک و یا چاهک‌های مورد نظر را با ctrl-click انتخاب ‌کنید (۶a). سپس نام Detector‌ها برای چاهک‌های انتخاب شده را انتخاب نموده (۶b)، سپس از گزینه Task نوع نمونه (Unknown یا  standardیا NTC) انتخاب می‌شود (۶c). در باکس Quantity غلظت نمونه استاندارد را وارد و در پایان کلمه Finish را کلیک کنید. (شکل ۴)

 

شکل ۴: انتخاب وظیفه هر کدام از چاهک‌ها وتعیین غلظت استانداردها

  • سپس در پنجره جدیدی که باز می‌شود کلمه Setup را انتخاب کرده و بر روی کلمه plate کلیک کنید تا پنجره آن باز شود. چاهک و یا چاهک‌های مورد نـظرتان را انتخاب نموده و بـا Right click بر روی دکمه موس گزینه well Inspector را انتخاب کرده و کلیک نمایید. سپس در باکس sample name نام نمونه را انتخاب کنید. در قسمت Detector تیک آن را بزنید و در قسمت باکس reference day نام رنگ مرجع بکار رفته در آزمون را انتخاب کنید و در پایان بر روی Close کلیک نمائید.
  • در پایان برای بکار انداختن سیکل‌های حرارتی بر روی Instrument کلیک کرده و در این صفحه بر حسب اینکه آزمون شماOne step RT- PCR یاTwo step  باشد سیکل‌های حرارت را در قسمت مربوطه تنظیم کرده و سپس در قسمت Sample Volume حجم واکنش و در قسمت Data Collection مشخص کنید که فلورسانس تابشی در کدام Stage@ step جمع‌آوری گردد. در پایان کلید Start را بزنید که دستگاه ضمن درخواست Save برنامه به کار می‌افتد. (شکل ۵)

شکل  ۵: انتخاب سیکل‌های حرارتی

 

بـــــــــرای مشاهده لحظه به لحظه پیشرفت واکنش قسمت Result را کلیک کرده و سپس Plot amplification را کلیک کنید و بر روی صفحه مانیتور لحظه به لحظه پیشرفت واکنش را مشاهده کنید. معمولاً بر اساس اینکه تعداد کپی اولیه موجود در نمونه چقدر باشد می‌توان منحنی تکثیری نمونه را مشاهده کرد. هرچه تعداد کپی اولیه عامل مورد نظر در نمونه بیشتر باشد در نتیجه Ct کاهش یافته و منحنی زودتر رؤیت می‌گردد. (شکل ۶)

شکل ۶: مشاهده قسمت‌های مختلف آزمایش از روی صفحه مانیتور

 

آنالیز داده‌ها و گزارش جواب‌ها:

بطور کلی هر نمونه مثبت باید دارای منحنی تکثیر (Amplification plot) با ویژگی و تعاریف زیر باشد: (شکل ۷)

 

شکل ۷: منحنی تکثیر (Amplification plot)

شکل ۸: فازهای مختلف منحنی تکثیر

هر منحنی باید دارای سه فازBaseline ، Exponential وplateau  باشد، در غیر این صورت جواب قابل قبول نیست (شکل ۸).

برای آنالیز داده‌ها طبق نمودار شماره ۱ عمل می‌گردد.

نمودار شماره ۱: نحوه آنالیز داده‌ها

 

.تنظیم Baseline:

همانگونه که ذکر شد تنظیم Baseline و  Thresholdدر کسب یک نتیجه درست و همچنین تفسیر صحیح نتایج بسیار مهم می‌باشد، برای این منظور به (شکل ۹) دقت کنید.

در شکل مقابل baseline به خوبی تنظیم شده و بلافاصله چند سیکل بعد از Baseline  منحنی‌های تکثیری شروع شده است.
در شکل مقابل baseline خیلی پائین انتخاب شده است که در این حالت باید End cycle را افزایش داد.
در شکل مقابل Baseline خیلی بالا انتخاب شده که در این حالت باید End cycle را کاهش داد. 

شکل ۹: نحوه تنظیم Baseline

 

 تنظیم Threshold Line   

روش تنظیم Threshold Line  در شکل شماره ۱۰ نشان داده شده است:

Threshold Line  به خوبی تنظیم شده است
Threshold Line  بالا کشیده شود.
Threshold Line  پائین کشیده شود.

 شکل ۱۰: نحوه تنظیم Threshold Line  

 

 

 

سایر پارامترها که باید ملاحظه گردد:

  • قسمت Component Tab، کنترل کنید اگر نمودار رنگ‌های فلورسانس مورد در آزمون به شکل شماره ۱۱ باشد، طبیعی است.

شکل ۱۱: نمودار رنگ‌های فلورسانس مورد در آزمون

 

در موارد غیر طبیعی ممکن است  FAM creepو ROX drop اتفاق بیفتد. (شکل ۱۲)

شکل ۱۲

 

  • Rn vs. Cycle (Linear) View

تشخیص تکثیرهای واقعی باید به شکل ۱۳ باشـــــــــــــــــــــــــــــــــــــد که با مشاهده Rn vs. Cycle (Linear) View مشخص می‌گردد و هرگونه نمودار تکثیری که مغایرت با آن داشته باشد باید غیر طبیعی در نظر گرفته شود.

شکل ۱۳: منحنی تکثیری که به خوبی تکثیر در آن اتفاق افتاده است

 

  • Rn vs. Cycle (Linear) View

با تنظیم این پنجره Outlier مشخص می‌شود و نشان می‌دهد در کدام چاهک نمونه ما فاقد تکثیر واقعی بوده است. (شکل ۱۴)

شکل ۱۴: منحنی تکثیری که به خوبی تکثیر در آن اتفاق نیفتاده است

 

و در پایان بعد از کنترل و تنظیم موارد بالا باید منحنی استاندارد به فرم طبیعی زیر بدست آید (شکل ۱۵).

شکل ۱۵: منحنی استاندارد

 

یعنی اینکه نمونه‌ها و استـــــانداردها روی یک خط قرار گرفته باشند و Slop یا شیب منحنی باید ۳٫۳ – تا ۳٫۶ – باشد و بهترین شیب ۳٫۳۲- است و R آزمون بالای ۰٫۹۸ باشد.

همچنین در یک آزمون نرمال بایستی نمونه‌های استاندارد که یک لگاریتم اختلاف غلظت دارند اختلاف Ct آنها ۳٫۳ باشد.

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • Real-time PCR
  • دکتر رضا میرنژاد
  • شهرام شجاع

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *