مروری بر آزمایش میکروبیولوژیکی مدفوع

رضا بهلولی خیاوی- کارشناس ارشد میکروب‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشگین شهر

مقدمه

مدفوع یک ماده مهم بدن است که باید برای وجود میکروارگانیسم‌های عامل بیماری مورد بررسی قرار گیرد.

تعریف واژه‌ها:

اسهال (Diarrhoea): به افزایش دفعات اجابت مزاج، آبکی شدن مدفوع و ازدیاد حرکات روده تا بیش از 3 بار در روز اطلاق می‌شود.
اسهال خونی (Dysentery): به حضور خون و چرک در مدفوع اسهالی گفته می‌شود که اغلب با کرامپ‌های شکمی و زورپیچ همراه است.
گاستروآنتریت (Gastroenteritis): به التهاب غشاء مخاطی معده و روده گفته می‌شود که منجر به اسهال همراه با استفراغ می‌شود.

بررسی مدفوع از نظر باکتری‌ها:

عوامل باکتریایی ایجادکننده اسهال عبارتند از:

1- باکتری‌های گرم مثبت شامل:

Staphylococcus aureus
Clostridium perfringens
Clostridium difficle
Bacillus cereus

2- باکتری‌های گرم منفی شامل:

ویبریوها
Vibrio cholera
Vibrio parahemolyticus
Other halophlic vibrios
Escherichia coli (ETEC, EPEC)
Salmonella

S.enteritidis (i)

S.typhimurium(ii)

Shigella spp
Campylobacter jejuni
Yersinia enterocolitica

مروری بر پاتوژن‌های باکتریایی

Staphylococcus aureus

استافیلوکوکوس اورئوس 6 نوع آنتروتوکسین تولید می‌کند که از A تا F تیپ‌بندی می‌شوند. تیپ A در شیوع مسمومیت غذایی ناشی از این باکتری مشاهده می‌شود. مسمومیت غذایی حاد ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس از طریق وارد شدن توکسین از قبل تولیدشده در مواد غذایی آلوده‌شده به بدن فرد اتفاق می‌افتد. دوره نهفته آن 2 الی 6 ساعت و همراه با تهوع و استفراغ شدید بوده و بعضی اوقات با اسهال نیز همراه است.

Bacillus cereus

یک باسیل گرم مثبت هوازی اسپوردار است. 2 نوع توکسین تولید می‌کند، یکی از آنها شبیه توکسین LT مربوط به اشریشیا کولی و دیگری شبیه آنتروتوکسین استافیلوکوکوس اورئوس است. این باکتری دو نوع تظاهرات بالینی ایجاد می‌کند یکی با اسهال و دردهای شکمی همراه بوده و دوره نهفتگی آن 6 تا 15 ساعت است که علائم آن شبیه گاستروآنتریت ناشی از اشریشیا کولی بوده و با تهوع و استفراغ همراه است و علائم نوع دیگر آن با داشتن دوره نهفته 1 تا 4 ساعت شبیه مسمومیت غذایی ناشی از استافیلوکوکوس اورئوس است. مسمومیت غذایی ناشی از وارد شدن توکسین از قبل تولیدشده در مواد غذایی آلوده‌شده به بدن فرد معمولاً در برنج یا سایر غلات مشاهده می‌شود که پس از پخته شدن در دمای بالا نگهداری می‌شوند.

Clostridium perfringens

این ارگانیسم به‌طور وسیعی در خاک پراکنده شده و در مدفوع انسان‌ها و حیوانات وجود دارد. گاستروانتریت ناشی از این باکتری از طریق ورود مواد غذایی آلوده‌شده مثل محصولات ماکیان و گوشت ایجاد شده و با اسهال و کرامپ‌های شکمی همراه است. بیشتر موارد بیماری به‌وسیله سویه‌های تیپ A ایجاد می‌شود که یک آنتروتوکسین ایجاد می‌کنند. دوره نهفتگی آن 6 الی 12 ساعت می‌باشد.

Clostridium difficle

این باکتری عامل اسهال و کولیت با غشاء کاذب ناشی از مصرف آنتی‌بیوتیک‌هایی مثل کلیندامایسین، لینکومایسین، آمپی‌سیلین و سفالوسپورین‌ها از راه دهان است. درنتیجه سرکوب میکروفلور نرمال روده توسط این آنتی‌بیوتیک‌ها، کلوستریدیم دیفیسیل با رشد بیش از حد خود باعث ایجاد بیماری‌های فوق خواهد شد.

Vibrio cholera

هم بیوتیپ کلاسیک و هم بیوتیپ التور آن باعث ایجاد بیماری وبا می‌شوند. دهیدراتاسیون شدید، اسهال و درد شکمی که از علائم بیماری وبا می‌باشند در نتیجه ترشح اگزوتوکسین توسط باکتری ایجاد می‌شوند که کلراتوکسین نامیده شده است. این توکسین cAMP را فعال می‌کند که منجر به ترشح مایعات و الکترولیت‌ها به خارج سلول شده و اسهال آبکی ایجاد می‌کند. در موارد شدید، مدفوع قوام آب برنجی (بدون مواد دفعی) پیدا می‌کند که این وضعیت اورژانسی بوده و نیازمند درمان جهت جایگزینی مایعات برای جلوگیری از کلاپس عروقی و مرگ می‌باشد. ویبریو پاراهمولیتیکوس باعث ایجاد اسهال غیرتهاجمی شده و مسئول ایجاد قسمت عظیمی از مسمومیت‌های ناشی از غذا در اکثر نقاط دنیا مثل آسیا، اروپا، افریقا و آمریکا می‌باشد. مواد غذایی که باعث این نوع مسمومیت می‌شوند شامل غذاهای دریایی خام (ماهی و صدف) می‌باشد. مکانیسم ایجاد اسهال توسط این باکتری به‌خوبی شناخته نشده است. این باکتری یک آنتروتوکسین حساس به حرارت شبیه اشریشیا کولی تولید می‌کند.

E.coli

سویه‌های اشریشیاکولی که در بیماری‌های اسهالی مورد شناسایی قرار می‌گیرند اشریشیا کولی آنتروتوکسی‌ژنیک (ETEC) و آنتروپاتوژنیک (EPEC) می‌باشند. سویه ETEC یک آنتروتوکسین حساس به حرارت و یک آنتروتوکسین مقاوم به حرارت تولید می‌کند که منجر به اسهال نیمه حاد در کشورهای در حال توسعه می‌شود. این سویه عامل اصلی اسهال مسافرتی است. سویه‌های EPEC عامل اسهال نوزادان می‌باشند که توکسین تولید نکرده و به مخاط روده هم آسیب نمی‌زنند. مکانیسم واقعی فعالیت آنها هنوز ناشناخته است. این سویه‌ها به سلول‌های مخاطی روده کوچک اتصال یافته و تکثیر پیدا می‌کنند.

گونه‌های Shigella

شیگلا دیسانتری، شیگلا فلکسنری و شیگلا بویدی‌ای اسهال خونی ایجاد می‌کنند. اسهال خونی ایجادشده توسط گونه‌های شیگلا به‌عنوان شیگلوزیس نامیده می‌شود. گونه‌های شیگلا عامل ایجاد 50 درصد از موارد اسهال خونی در کودکان و بزرگسالان در کشورهای در حال توسعه می‌باشند، بخصوص شیگلا دیسانتری تیپ 1 خیلی ویرولانت بوده و باعث ایجاد اسهال خونی اپیدمیک و آندمیک می‌شود، این سویه خیلی عفونی بوده به آنتی‌بیوتیک‌های معمولی مقاوم می‌باشد.

Salmonellae

گاستروآنتریت ناشی از گونه‌های سالمونلا تب و اسهال با دوره کمون 12 الی 36 ساعت بوده که خودمحدودشونده می‌باشد. عامل بخش بزرگی از شیوع‌ها سالمونلا تیفی‌موریوم و سالمونلا آنتریتیدیس می‌باشند. عفونت انسانی معمولاً از طریق مصرف فراورده‌های حیوانی ایجاد می‌شود. این عفونت منجر به مسمومیت غذایی سالمونلایی شده و بعضی اوقات به سپتی‌سمی منجر می‌شود.

Campylobacter jejuni

عامل شایع آنتریت در کشورهای پیشرفته است. این باکتری معمولاً درمیکروفلور روده بسیاری از حیوانات بخصوص در ماکیان یافت می‌شود که منشأ بسیاری از عفونت‌ها در انسان می‌باشند. شواهدی از اسهال ایجادشده با منشأ شیر و آب آشامیدنی نیز در دست می‌باشد. این بیماری بعضی اوقات با استفراغ و اسهال موکوئیدی خونی همراه است.

Yersinia enterocolitica

این باکتری به‌عنوان یک عامل مهم اسهال شناخته شده است. منابع عفونت، پرندگان و حیوانات می‌باشند. شیوع‌های با منشأ غذایی همچنین گزارش شده است. علامت بارز آن در خردسالان اسهال شدید آبکی است. در نوجوانان و بزرگسالان درد شکمی و تب نیز وجود دارد.

بررسی مدفوع از نظر انگل‌ها

1- Protozoa

Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
انگل‌های کوکسیدیایی روده‌ای

Cryptosporidium parvum
Cyclospora
Isospora

Balantidium Coli

2- کرم‌ها

Nematodes

Ascaris lumbricoides
Trichuris trichuria
Hookworm(کرم قلابدار)

Ancylostoma duodenale
Nectar Americans

Strongyloides stercoralis

Cestodes (کرم‌های نواری)

Taenia spp

T. saginata
T.solium

Hymenolepsis nana
Enterobius vermicularis

مروری بر پاتوژن‌های انگلی

Entamoeba histolytica

این انگل در بسیاری از مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری آندمیک است. ا ز طریق مدفوعی- دهانی منتقل می‌شود. کیست‌های 4 هسته‌ای نمایانگر مرحله عفونی در انسان می‌باشند. Entamoeba histolytica اسهال خونی آمیبی ایجاد می‌کند که از ویژگی‌های آن ایجاد زخم‌های قمقمه‌ای شکل بزرگ است. این انگل ممکن است آبسه‌های آمیبی کبدی ایجاد کند که در نهایت ریه‌ها را نیز گرفتار می‌کند.
Giardia lamblia

عفونت با ژیاردیا لامبلیا ممکن است به اسهال آبکی ناگهانی، مدفوع بدبو و استئاتوره منجر شود. در مناطق آندمیک خردسالان بخصوص آنهایی که دچار سوءتغذیه می‌باشند بیشتر از بزرگسالان دچار عفونت با این انگل می‌شوند. این تک‌یاخته در بیماران با ضعف سیستم ایمنی بخصوص در مبتلایان به AIDS بیماری شدیدتری ایجاد می‌کند.

انگل‌های کوکسیدیایی روده‌ای

کریپتوسپوریدیم پارووم، ایزوسپورا بلی و سیکلوسپورا به‌عنوان عوامل مهم ایجاد اسهال آبکی در افراد با ضعف سیستم ایمنی بخصوص در مبتلایان به AIDS شناخته شده‌اند.

Balantidium coli

یک انگل غیرمعمول است که در انسان‌ها یافت می‌شود. این انگل معمولاً خوک‌ها را آلوده می‌کند و گسترش جهانی دارد. این تک‌یاخته باعث اسهال خونی می‌شود که انتقال آن از طریق ورود کیست‌های عفونی موجود در غذا، آب و یا دست‌های آلوده به مدفوع خوک صورت می‌گیرد.

Ascaris lumbricoides

این کرم گسترش جهانی داشته و انتقال آن از طریق آلودگی مدفوعی محیط صورت می‌گیرد. یک فرد وقتی به آسکاریس مبتلا می‌شود که تخم‌های عفونی آن از طریق مواد غذایی آلوده به بدن راه یابد یا فرد با دست‌های آلوده به تخم کرم، مواد غذایی مصرف کند.

Trichuris trichiura
در مناطق گرم و مرطوب شایع است. عفونت ناشی از Trichuris trichiuraبا ورود تخم‌های عفونی آن از طریق مواد غذایی آلوده یا خوردن مواد غذایی با انگشت‌های آلوده به تخم‌های کرم صورت می‌پذیرد. این کرم در کودکان باعث اسهال مزمن همراه با ایجاد زخم در روده شده که در نتیجه مدفوع خونی و موکوئیدی می‌شود.
Hookworm (کرم‌های قلاب‌دار)

عفونت ناشی از این کرم توسط آنکیلوستوما دئودنال و نکاتور آمریکانوس صورت می‌گیرد که آنکیلوستوما به‌عنوان گونه اصلی در ایجاد عفونت شناخته شده است. عفونت از طریق آلودگی خاک با مدفوع صورت می‌گیرد و موقعی روی می‌دهد که لاروهای فیلاریفرم به پوست نفوذ می‌کنند. کرم قلابدار در روده مستقر شده و شروع به مکیدن خون می‌کند و درنتیجه منجر به کم‌خونی فقر‌آهن و از دست دادن مزمن خون می‌شود.

Strongyloides stercoralis

در کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری بومی است. عفونت موقعی روی می‌دهد که لاروهای فیلاریفرم به پوست نفوذ می‌کنند. در بیماران با ایمنی طبیعی، عفونت آن بدون علامت است یا علائم خفیفی ایجاد می‌کند، ولی در میزبان‌های با ضعف سیستم ایمنی یک عفونت تهدیدکننده زندگی بالقوه ایجاد می‌کند که hyperinfection syndrome نامیده شده است.

گونه‌های Taenia

دو گونه تنیا ساژیناتا و تنیا سولیوم به‌عنوان عامل عفونت در انسان شناخته شده‌اند. عفونت‌های ناشی از گونه‌های تنیا معمولاً از طریق خوردن گوشت خام گاو (در مورد تنیا ساژیناتا) یا گوشت نیم‌پز خوک یا گراز وحشی (در مورد تنیا سولیوم) انتقال می‌یابد. تنیا سولیوم به‌اندازه تنیا ساژیناتا گسترش جهانی ندارد ولی باعث ایجاد یک بیماری بنام neurocysticercosis می‌شود که با صرع و سایر اختلالات عصبی همراه می‌باشد.

Hymenolepsis nana

انتقال آن از طریق ورود تخم‌های آن از طریق دست‌های آلوده با مدفوع عفونی صورت می‌گیرد. این تخم‌های دفع شده از طریق مدفوع، عفونی می‌باشند. اتواینفکشن داخلی از مشکلات شایع ناشی از آلودگی با هیمنولپیس نانا می‌باشد.

Enterobius vermicularis (Oxyur)

توزیع جهانی دارد. کودکان بیشتر از بزرگسالان توسط این کرم آلوده می‌شوند. انتقال آن از طریق ورود تخم‌های عفونی صورت می‌گیرد. تخم‌های کرم در ساعاتی از شب در پوست اطراف مقعد جمع می‌شوند. اتواینفکشن در کودکان شایع می‌باشد زیرا تخم‌ها باعث خارش شدید و در نتیجه خراش در نواحی عفونت یافته نشیمنگاه می‌شوند.

بررسی مدفوع از نظر ویروس‌ها

ویروس‌های عامل ایجاد اسهال شامل Rota virus، virus Norwalk، Adenovirus، Astrovirus،Calcivirus ،Coronavirus می‌باشند.

روتاویروس (Rotavirus)

این ویروس به‌عنوان عامل شایع ایجاد اسهال در نوزادان و بچه‌های خردسال تلقی نمی‌شود. اوج شیوع این بیماری در سنین 6 ماهگی تا 2 سالگی است. این نوع از عفونت از طریق مدفوعی- دهانی است. دوره نهفتگی آن 2 تا 4 روز است. استفراغ یک علامت اصلی اولیه است که معمولاً قبل از اسهال اتفاق می‌افتد. مدفوع آبکی بوده که معمولاً با تب خفیف و علائم تنفسی همراه می‌باشد.

ویروس‌های دیگری نیز وجود دارند که می‌توانند باعث اسهال و استفراغ در نوزادان و خردسالان شوند.

بررسی آزمایشگاهی مدفوع

1- تهیه نمونه‌های مدفوعی

نمونه برای بررسی میکروبیولوژیکی باید در مرحله حاد بیماری اسهالی تهیه شود.

از بیمار بخواهید که نمونه مدفوع خود را در ظرف مناسب تمیز، خشک و بدون مواد ضدعفونی‌کننده با دهانه عریض یا فنجان پلاستیکی دارای درپوش پیچ‌دار محکم جمع‌آوری کند.
20 تا 40 گرم از مدفوع با قوام نرمال یا به‌اندازه 5 تا قاشق سوپخوری از اسهال آبکی برای یک بررسی معمولی کافی خواهد بود.
مصرف تعدادی از داروها توسط بیمار قبل از جمع‌آوری نمونه مدفوع ممکن است در تشخیص میکروارگانیسم‌ها اختلال ایجاد نماید، این داروها شامل تتراسایکلین‌ها، سولفونامیدها، عوامل ضد تک‌یاخته‌ای، ضد یبوست‌ها، آنتی‌اسیدها، روغن کرچک، هیدروکسید منیزیم، سولفات باریوم، ترکیبات بیسموت کائولن، املاح هیپرتونیک و غیره می‌باشند که نباید در 1 تا 2 هفته قبل از بررسی نمونه مدفوع مصرف شوند.
تمام نمونه‌ها باید به‌طور کامل با مشخصات بیمار مثل نام، سن، جنسیت و اطلاعات مربوط به جمع‌آوری نمونه برچسب زده شوند.

توجه:

نمونه‌ها را در دمای بالا قرار ندهید بلکه سعی کنید آنها را درجای سرد قرار دهید.
از خشک شدن نمونه‌ها جلوگیری کنید.
از آلودگی نمونه‌ها با ادرار یا اجسام آلوده جلوگیری نمایید.
بررسی‌های چندگانه مدفوع باید بر اساس محتمل بودن وجود آن نوع عفونت صورت گیرد.
نمونه‌های مدفوع نباید از تشتک‌های نامناسب دارای مواد ضدعفونی‌کننده جمع‌آوری شوند.

2- سوآب‌های رکتال

فقط موقعی تهیه می‌شود که امکان تهیه نمونه مدفوع وجود نداشته باشد و نمونه باید با استفاده از یک سوآب پنبه‌ای تهیه شود. سوآب باید بمدت 10 ثانیه در داخل رکتوم قرار داده شود، باید مراقب بود که از آلودگی نمونه با باکتری‌های پوست اطراف مقعد پرهیز شود.

3- روش نوارچسب

این روش برای تشخیص تخم‌های اکسیور کاربرد دارد. این تخم‌ها می‌توانند از طریق چسبیدن به یک نوار اسکاچ یا نوارچسب شفاف به دور نشیمنگاه جمع‌آوری شوند. بعد از جمع‌آوری تخم‌ها، نوار باید به‌صورت طولی در روی یک لام میکروسکوپی چسبانده شده و مورد بررسی قرار گیرد.

انتقال نمونه

نمونه باید در عرض 30 دقیقه از زمان دفع مدفوع به آزمایشگاه رسیده باشد، زیرا ارگانیسم‌های متحرک به‌عنوان مثال ویبریوها و تروفوزوئیت‌های آنتاموبا هیستولیتیکا حساس به حرارت بوده و از بین می‌روند یا بعد از سپری شدن زمان مذکور غیرقابل تشخیص خواهند بود.

محیط‌های کشت انتقالی مثل Cary-Blair می‌تواند برای انتقال Salmonella، Shigella و Yersinia مورد استفاده واقع شود.

وقتی که مشکوک به بیماری وبا باشیم باید حدود 1 میلی‌لیتر از نمونه را داخل لوله حاوی 10 میلی‌لیتر محیط کشت آب پپتونه قلیایی قرار دهیم که به‌عنوان محیط کشت غنی‌کننده عمل کرده و همان کارایی محیط‌های انتقالی را دارا می‌باشد.

در مورد وجود کرم‌ها یا قطعات کرم نواری در نمونه باید به یک ظرف حاوی سالین فیزیولوژیک انتقال داده شده و برای تشخیص به آزمایشگاه ارسال شود.

بررسی ماکروسکوپیک نمونه مدفوع

نکات مهمی که باید مورد توجه قرار گیرند عبارتند از:

قوام نمونه: نرمال یا بی‌شکل (نرم)، شل یا آبکی. کیست‌ها اکثراً در نمونه‌های با قوام نرمال یافت می‌شوند، در حالیکه تروفوزوئیت‌ها معمولاً به تعداد فراوان در مدفوع آبکی یافت شده‌اند.
وجود خون، مخاط یا چرک
وجود کرم‌هایی مثل اکسیور، آسکاریس و قطعات کرم‌های نواری مانند گونه‌های تنیا
رنگ مدفوع (سفید، زرد، قهوه‌ای یا سیاه)
مدفوع طبیعی دارای رنگ قهوه‌ای و دارای قوام نرمال است. مدفوع نوزاد به رنگ زرد- سبز و دارای قوام نیمه‌شل است.

بررسی میکروسکوپی نمونه مدفوع

روش متیلن بلو

تکه کوچکی از نمونه مدفوع یا سواب رکتال همراه با یک تکه کوچک از مخاط را در یک قطره از محلول 05/0 درصد آبی متیلن در روی یک لام تمیز قرار دهید و آن را از نظر وجود سلول‌های التهابی به‌صورت زیر مورد بررسی قرار دهید:

تجمع سلول‌های چرکی بیشتر از 50 عدد در یک میدان میکروسکوپی با قدرت بالا همراه با ماکروفاژها و اریتروسیت‌ها می‌توانند نشانگر شیگلوز باشند.
وجود تعداد کمتری از سلول‌های چرکی مثلاً زیر 20 عدد در میدان میکروسکوپی با قدرت بالا در سالمونلوزیس و عفونت‌های ناشی از اشریشیا کولی مهاجم دیده می‌شود.
وجود لکوسیت به تعداد کم مثلاً زیر 5 عدد در میدان میکروسکوپی با قدرت بالا نشانگر وجود ویبریوکلرا،EPEC و ETEC و ویروس‌های عامل اسهال می‌باشد.

لام مرطوب

ساده‌ترین راه بررسی یک سوسپانسیون باکتریایی برای دیدن باکتری‌های متحرک تهیه یک لام مرطوب است. یک قطره از سوسپانسیون را در روی یک لام تمیز قرار دهید روی آن را با لامل پوشانده و حرکت باکتری‌ها را در زیر میکروسکوپ با استفاده از عدسی‌های 10× و 40× بررسی کنید. از بسته شدن دریچه دیافراگم کندانسور برای ایجاد یک تمایز بهتر اطمینان حاصل نمایید.

تهیه قطره معلق

یک قطره از سوسپانسیون را روی یک لامل قرار داده و آن را برگردانده و روی یک لام توگود قرار داده و ارگانیسم‌های متحرک را بررسی می‌کنیم.

جدول 1- انواع حرکت در میکروارگانیسم‌ها

میکروارگانیسم	نوع حرکت
E.coli	بطئی
Salmonella spp	متحرک به‌صورت فعال
Vibro cholera	حرکت پرشی سریع
Campylobacter spp	لغزشی
Giardia lamblia	افتادن برگ
Entamoeba histolytica	متحرک به‌صورت فعال با پای کاذب

اسمیر فوشین قلیایی

لایه نازکی از نمونه را روی یک لام تهیه کرده و آن را با فوشین قلیایی رنگ‌آمیزی کرده و آن را زیر میکروسکوپ با عدسی روغنی بررسی کنید. این روش یک روش حساس برای تشخیص اولیه احتمالی گونه‌های کامپیلوباکتر می‌باشد. کامپیلوباکتر به شکل باکتری کوچک، نازک و مارپیچی و یا به شکل S دیده می‌شود.

کشت نمونه

MacConkey’s Agar

یک محیط کشت غیرانتخابی مفید برای کشت‌های معمولی بوده و یکی از مزایای آن ایجاد کلنی‌های دارای رنگ صورتی در مورد باکتری‌های لاکتوز مثبت و کلنی‌های بیرنگ در مورد باکتری‌های لاکتوز منفی است، نیز رشد اکثر باکتری‌های گرم مثبت و خزندگی پروتئوس را که ممکن است در کشت‌های مخلوط مشکلاتی ایجاد کنند مهار می‌کند. سالمونلا، شیگلا و ویبریو به علت عدم تخمیر لاکتوز کلنی‌های بیرنگ روی این محیط ایجاد می‌کنند. اشریشیا کولی و سایر باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز کلنی‌های صورتی رنگ روی این محیط ایجاد می‌کنند.

Xylose lysine deoxycholate (XLD) agar

این محیط کشت انتخابی برای جداسازی سالمونلا و بخصوص شیگلا از نمونه‌های مدفوع پیشنهاد شده است. شیگلا کلنی‌های صورتی قرمز ایجاد می‌کند زیرا قادر به تخمیر گزیلوز و لاکتوز نیست. سالمونلا به علت تولید سولفید هیدروژن کلنی‌های صورتی قرمز با مرکز سیاه ایجاد می‌کند.

Thiosulphate citrate bile salt sucrose (TCBS) agar

یک محیط بسیار مناسب، عالی و انتخابی برای جداسازی اولیه ویبریو کلرا می‌باشد. غنی‌سازی قبلی باکتری در آب پپتونه قلیایی توصیه شده است، مگر اینکه نمونه حاوی تعداد زیادی از باکتری‌های ویبریو در مرحله حاد بیماری باشد. در روی این محیط ویبریوکلرا به علت تخمیر لاکتوز کلنی‌های بزرگ زردرنگ ایجاد می‌کند.

Sorbitol MacConkey’s agar

این محیط به‌جای لاکتوز حاوی سوربیتول می‌باشد. E.coli 0157 به علت عدم تخمیر سوربیتول کلنی‌های بیرنگ روی این محیط ایجاد می‌کند. اکثر سویه‌های اشریشیا کولی و سایر آنتروباکتریاسه‌ها سوربیتول را تخمیر کرده و کلنی‌های صورتی رنگ ایجاد می‌کنند، از اینرو این محیط برای غربالگریE.coli 0157 بکار می‌رود.

جدول 2- تست‌های بیوشیمیایی برای تشخیص باکتری‌ها

SH2	اوره آز	سیترات	VP	MR	اندل	ایجاد اسید	ایجاد گاز	حرکت	باکتری
_	_	_	_	+	+	+	+	+	Escherichia
+	_	+	_	+	_	+	_	+	Salmonella spp
_	_	_	_	+	D	+	_	_	Shigella spp
_	_		_	_	+	+	_	+	Vibrio

تست آگلوتیناسیون روی لام

جداسازی سالمونلا و ویبریو می‌تواند از طریق آگلوتیناسیون روی لام انجام گیرد. یک کلنی رشد کرده روی محیط در 2 قطره جداگانه از سالین روی لام حل شده و به‌صورت شیرابه درمی‌آید. یک شیرابه به‌عنوان کنترل جهت نشان دادن عدم اتوآگلوتیناسیون سویه عمل می‌کند. در مورد سالمونلا، آنتی‌سرم “O” به یک قطره از شیرابه باکتریایی روی لام اضافه می‌شود. آگلوتیناسیون فوری نشانگر وجود گروه سالمونلا است. به‌طور مشابه در مورد ویبریو کلرا آنتی‌سرم O سروگروه I مورد بررسی قرار می‌گیرد و در صورت وجود آگلوتیناسیون سروتیپ بندی با آنتی‌سرم‌های اینابا و اگاوا نیز انجام خواهد شد.

جدول 3- تست آگلوتیناسیون روی لام

Salmonella spp	‘o’ antiserum	‘H’antiserum
S. typhimurium	4-B	i
S..enteritidis	9-D	d

بررسی مدفوع از نظر انگل‌ها

1- لام مرطوب با سرم فیزیولوژی: برای تشخیص کرم‌ها، تخم‌های رنگ‌آمیزی شده با صفرا، لاروها، تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های تک‌یاخته‌های بیماری‌زا مورد استفاده واقع می‌شود، در ضمن وجود اریتروسیت‌ها و لکوسیت‌ها را هم نشان می‌دهد.

2- لام مرطوب با ید: برای رنگ‌آمیزی گلیکوژن و هسته‌های کیست‌ها بکار می‌رود. یک کیست در یک لام مرطوب دارای محلول ید بهتر تشخیص داده می‌شود ولی حرکت تروفوزوئیت‌ها در محلول ید متوقف می‌شود.

مراحل انجام بررسی

یک قطره سرم فیزیولوژی را در قسمت چپ یک لام و یک قطره محلول ید را در قسمت راست لام قرار دهید.
با یک اپلیکاتور قسمت کوچکی از نمونه را بردارید و آن را با سرم فیزیولوژیکی و محلول ید مخلوط کنید.
روی هر دو گسترش لامل گذاشته و زیر میکروسکوپ بررسی نمایید. تخم‌ها، کیست‌ها، تروفوزوییت‌ها و کرم‌های بالغ بر طبق خصوصیات ویژه خود مورد شناسایی قرار خواهند گرفت.

روش‌های تغلیظ نمونه مدفوع

اگر تعداد انگل‌ها در نمونه کم باشد در بررسی لام مرطوب ممکن است نتوانیم آنها را تشخیص دهیم، لذا تغلیظ نمونه لازم می‌باشد. تخم‌ها، کیست‌ها و لاروها بعد از مرحله تغلیظ قابل تشخیص خواهند بود درحالی‌که تروفوزوئیت‌ها در طی عمل تغلیظ تخریب می‌شوند.

روش تغلیظ به دو صورت زیر قابل انجام است:

1- روش‌های رسوب‌سازی: در اینجا تخم‌ها و کیست‌ها در ته لوله قرار می‌گیرند.

2- روش‌های شناورسازی: در اینجا تخم‌ها و کیست‌ها به علت شیب وزن مخصوص در سطح لوله قرار می‌گیرند.

عیب اصلی روش رسوب‌سازی آن است که بررسی رسوب اغلب در نتیجه باقی ماندن مواد مدفوعی مشکل بوده که ممکن است مانع مشاهده انگل‌ها شود.

عیب عمده روش شناورسازی آن است که همه تخم‌ها یا کیست‌ها در سطح شناور نمی‌مانند.

دو روش تغلیظ مورد استفاده روتین تکنیک فرمل– اتر و محلول نمک اشباع است.

تکنیک رسوب‌سازی با استفاده از فرمل- اتر

مراحل انجام روش

نصف یک قاشق سوپ‌خوری از مدفوع را در 10 میلی‌لیتر آب در یک ظرف اضافه کرده و کاملاً” مخلوط می‌کنیم.
دو لایه گاز را در یک قیف قرار داده و محتویات ظرف را صاف کرده و به یک لوله سانتریفیوژ 15 میلی‌لیتری منتقل می‌کنیم.
لوله را به مدت 2 دقیقه در 500g سانتریفیوژ می‌کنیم.
قسمت رویی را دور ریخته و رسوب را دوباره در 10 میلی‌لیتر از سرم فیزیولوژی مخلوط می‌کنیم. لوله را به مدت 2 دقیقه در 500g سانتریفیوژ کرده و قسمت رویی را دور می‌ریزیم.
رسوب را در 7 میلی‌لیتر فرمالدئید 10 درصد (از افزودن یک قسمت از فرمالین 40 درصد به 3 قسمت از سرم فیزیولوژی حاصل می‌شود) به حالت سوسپانسیون درمی‌آوریم.
3 میلی‌لیتر اتر یا اتیل استات به سوسپانسیون اضافه می‌کنیم.
لوله را با درپوش بسته و بشدت تکان می‌دهیم تا مخلوط شود. درپوش را برداشته و لوله را به مدت 2 دقیقه در 500g سانتریفیوژ می‌کنیم.
لوله را در حالت ایستاده قرار می‌دهیم. چهار لایه در لوله قابل مشاهده است؛ لایه بالایی از اتر تشکیل شده است، لایه دوم یک طبقه از مواد زائد، سومین لایه، یک لایه شفاف و حاوی فرمالین و لایه چهارم حاوی رسوب می‌باشد.
طبقه حاوی مواد زائد را از قسمت خارج لوله به کمک یک میله شیشه‌ای جدا کنید و مایع را دور بریزید. فقط مقدار کمی از لایه فرمالین برای به حالت سوسپانسیون در آوردن رسوب باقی می‌ماند.
با یک پیپت رسوب را برداشته و در یک قطره محلول ید حل کرده و در زیر میکروسکوپ بررسی می‌کنیم.

تکنیک شناورسازی با نمک اشباع‌شده

1 میلی‌لیتر از مدفوع را دریک ظرف دارای انتهای مسطح و قطر کمتر از 5/1 اینچ و دارای گنجایش 15 الی 20 میلی‌لیتر قرار دهید.
چند قطره از محلول نمکی اشباع‌شده با وزن مخصوص 2/1 اضافه کرده و تکان دهید تا کاملاً مخلوط شوند.
محلول نمک بیشتری اضافه کنید تا تقریباً پر شود و به‌طور مداوم محلول را تکان دهید.
هر نوع جسم زائد را که در بالا شناور می‌ماند بردارید.
ظرف را در روی یک سطح ترازشده قرار دهید. پر کردن نهایی را با استفاده از یک قطره‌چکان ادامه دهید.
یک لام شیشه‌ای 2 در 3 اینچ به‌دقت در قسمت بالای ظرف قرار داده شود طوری که مرکز آن در تماس با مایع قرار گیرد.
اسمیر تهیه‌شده برای جلوگیری از ریختن نمونه به‌آرامی وارونه شده و بعد از گذاشتن یک لامل روی آن در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می‌گیرد.

روش‌های رنگ‌آمیزی

رنگ‌آمیزی اسید فاست تغییریافته با استفاده از اسیدسولفوریک 1 درصد به‌عنوان رنگبر یک روش ساده و مؤثر برای تشخیص انگل‌های کوکسیدیایی در نمونه مدفوع می‌باشد.

در لام‌های مرطوب تهیه‌شده رنگ‌آمیزی نشده، ااکیست‌های کریپتوسپوریدیم پارووم به‌سختی قابل تمایز از مخمرها و سایر ساختارهای کروی کوچک موجود در مدفوع می‌باشد.

ااکیست کریپتوسپوریدیم پارووم

کوچک، حلقوی تخم‌مرغی شکل و اجسام رنگ‌آمیزی شده قرمز صورتی با اندازه 4 الی 6 میکرومتر می‌باشد.

ااکیست اایزوسپورا بلی

تخم‌مرغی شکل با اندازه قطر 20 تا 22 میکرومترو به‌صورت زیگوت گرانوله دیده می‌شود. بعضی اوقات ااکیست ممکن است دوتا اسپوروکیست داشته باشد که هرکدام 4 تا اسپوروزوئیت دارند.


ااکیست قرمز صورتی ایزوسپورا بلی که یک زیگوت رنگ‌ شده با رنگ‌آمیزی اسید فاست تغییریافته	رنگ‌آمیزی اسید فاست تغییریافته ااکیست کریپتوسپوریدیم پارووم	ااکیست ایزوسپورا بلی. دو اسپوروکیست با 4 اسپروزوئیت

خصوصیات مرفولوژیکی (تخم، جنین، کیست) انگل‌های شایع

تروفوزوئیت آنتاموبا هیستولیتیکا

اندازه 12 تا 60 میکرومتر، بدون تقارن، دارای حرکت مستقیم هدف‌دار، دارای یک هسته منفرد کروی، کاریوزوم مرکزی منفرد داشته و یک کروماتین نازک که به‌طور یکنواخت پخش شده است.

کیست آنتاموبا هیستولیتیکا

کروی و با اندازه 10 تا 20 میکرومتر، کیست بالغ دارای چهار هسته بوده و کاریوزم آن مسطح و مرکزی و دارای کروماتین باریک می‌باشد. تعدادی از کیست‌ها ممکن است باندهای کروماتوئیدی داشته باشند. کیست مرحله عفونی انگل می‌باشد..


تروفوزوئیت آنتاموبا هیستولیتیکا	کیست آنتاموبا هیستولیتیکا

تروفوزوئیت ژیاردیا لامبلیا

اندازه آن 21-9 در 15-5 میکرومتر بوده و به شکل گلابی و با انتهاهای ستونی باریک است. به‌صورت فعال همانند برگ‌ریزان متحرک می‌باشد. این تک‌یاخته دارای دو هسته مرکزی و سیتوپلاسم گرانولار منظم و یکنواخت می‌باشد.

کیست ژیاردیا لامبلیا

تخم‌مرغی شکل، بطول 12-8 میکرومتر و به عرض 10-7 میکرومتر بوده و هسته آن دارای کاریوزوم است که به‌طور نامتقارن قرارگرفته‌اند. یک فضای شفاف بین دیواره سلولی و سیتوپلاسم وجود دارد. چهار جسم میانی در کیست وجود دارد.


کیست ژیاردیا لامبلیا	تروفوزوئیت ژیاردیا لامبلیا

تخم‌های بارور کرم‌های حلقوی

اندازه 60 در 45 میکرومتر، حلقوی یا تخم‌مرغی شکل با یک پوسته ضخیم، پوشیده شده با یک پوشش آلبومینی ضخیم، سلول داخلی دارای مراحل متنوعی از دگردیسی و به رنگ قهوه‌ای است.

تخم پوست‌اندازی شده کرم‌های حلقوی

پوشش آلبومینی از بین رفته است. سایر خصوصیات همانند مرحله تخم بارور می‌باشد.

تخم‌های نابارور کرم‌های حلقوی

اندازه 40 در 90 میکرومتر، دراز و اغلب دارای پوسته نازک و جسم داخلی آن توده‌ای از اجسام کروی کوچک می‌باشد.


تخم پوست‌اندازی شده کرم‌های حلقوی	تخم بارور کرم‌های حلقوی	تخم‌های نابارور کرم‌های حلقوی

تخم کرم قلابدار

تخم‌مرغی و بیضی شکل با اندازه 60 در 40 میکرون، پوسته دارای دیواره نازک، صاف و بیرنگ است. پوست‌اندازی داخلی آن در مرحله 4 تا 8 سلولی کامل می‌شود که به دور از پوسته بیرون کشیده شده و یک فضای خالی بجا می‌گذارند.

تخم کرم حلقوی (آنتروبیوس ورمیکولاریس)

دارای یک تخم planoconvex، طویل و بدون تقارن که اندازه آن 55 در 26 میکرون است. پوسته آن صاف و نازک است. لاروهای کاملاًً رسیده در داخل تخم دیده می‌شود.


تخم کرم حلقوی (آنتروبیوس ورمیکولاریس)	تخم کرم قلابدار

تخم کرم شلاقی (تریکوسفال)

طویل و بشکه‌ای شکل، اندازه آن 54 در 22 میکرون، پوسته آن زرد مایل به قهوه‌ای می‌باشد.


تخم تنیا	تخم تریکوسفال

تخم کرم نواری (گونه‌های تنیا)

کروی، با اندازه 31 تا 43 میکرومتر، دارای یک پوسته ضخیم با خطوط شعاعی نوک‌تیز می‌باشد. آنکوسفر جنینی دارای 3 جفت قلاب در داخل پوسته است که تشخیص‌دهنده جنس است. شناسایی گونه‌ها بر اساس مرفولوژی امکان‌پذیر نیست.

Reference:

Santosh A Kotgire: Microbiological Stool Examination: Overview. Journal of Clinical and Diagnostic Research,6(3):503-509,2012.

دعوت همگانی برای ریشه‌کنی سالک جلدی و احشایی

بررسی فراوانی انگل بلاستوسیستیس هومینیس با استفاده از PCR

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برای دانلود باید وارد سایت شوید.

خواندن تمام مطلب