بررسی فراوانی انگل بلاستوسیستیس هومینیس با استفاده از PCR
در بیماران اسهالی مراجعه‌کننده به مراکز بهداشتی- درمانی شهرستان خرم‌آباد، استان لرستان
محسن اکبری[1]، ابراهیم بادپروا[2]، فرناز خیراندیش*2
[1] – گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد واحد قم
2- گروه انگل‌شناسی و قارچ‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی لرستان، خرم آباد
*نویسنده مسئول: فرناز خیراندیش، گروه انگل‌شناسی و قارچ‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی لرستان، خرم‌آباد
چکیده:
مقدمه: اسهال یکی از علائم شایع بلاستوسیتوزیس ناشی از انگل زئونوز بلاستوسیستیس هومینیس می‌باشد. علیرغم تأکید بسیاری از مطالعات مبنی بر بالقوه پاتوژن بودن آن، اما بیماریزائی این انگل در بسیاری از جوامع ناشناخته و مورد بحث است. هدف از این مطالعه بررسی فراوانی انگل مذکور در بیماران اسهالی مراجعه کننده به مراکز درمانی شهر خرم‌آباد بود.
مواد و روش‌ها: این مطالعه توصیفی در سال 1393 بر روی یکصد نمونه مدفوع اسهالی از مراجعین به مراکز بهداشتی- درمانی شهر خرم‌آباد انجام گرفت. نمونه‌های جمع‌آوری شده ابتدا به روش مستقیم و سپس به روش PCR با استفاده از پرایمر اختصاصی مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: در آزمایش مستقیم نمونه‌های مدفوع جمع‌آوری شده، انگل روده‌ای بیماریزا مشاهده نگردید. تمامی افراد مورد مطالعه دارای علائم بالینی بودند. دل‌درد بیشترین (54%) و حالت تهوع کمترین (10/5%) علائم بالینی گزارش شده بودند. از صد نمونه مدفوع اسهالی مورد آزمایش به وسیلهPCR، پنج نمونه بودند.
بحث: از آنجا که مطالعه مشابهی تاکنون در ایران انجام نشده و پزشکان معالج هم با وجود مطالعات متعدد مبنی بر بالقوه پاتوژن بودن آن، دارو تجویز نمی‌کنند و آن را نادیده می‌گیرند، چنین مطالعه‌ای ضروری به نظر می‌رسید تا شاید قسمتی از ابهامات در خصوص بیماریزایی این انگل روشن شود. همچنین به دلیل آنکه انگل‌های دیگر مانند ژیاردیا لامبلیا، کریپتوسپوریدیوم و انتامبا هیستولیتکا هم باعث اسهال می‌گردند و در ایجاد این عارضه مشترکند استفاده از روش‌های تشخیصی با حساسیت بالاتر می‌تواند با اطمینان بیشتر نقش انگل بلاستوسیتیس در این عارضه را مشخص نماید.
(5%) از نظر آلودگی به انگل بلاستوسیستیس مثبت بودند.
کلید واژه‌ها: بلاستوسیتیس، اسهال، PCR، خرم‌آباد
مقدمه
باکتری‌ها، قارچ‌ها، ویروس‌ها و انگل‌ها جزو میکروارگانیسم‌های عفونت‌زا در انسان و سایر جاندارانند که قادرند از راه‌های مختلفی ایجاد اسهال نمایند. انگل‌ها نیز که بطرق مختلف مانند محل جایگزینی (خارجی و داخلی)، اشکال مورفولوژیکی (کرم‌ها و تک‌یاخته‌ای‌ها) و بیماریزائی (بیماریزا و غیربیماریزا) تقسیم می‌شوند گروهی از موارد مذکورند (1).
بلاستوسیتیس انگل تک‌یاخته، زئونوز و گوارشی است که در روده بزرگ انسان و مهره‌داران مانند پستانداران، پرندگان، خزندگان، ماهیان و حتی بی‌مهرگان مانند سوسک زندگی می‌کند (4-2).
علیرغم گذشت حدود یکصد سال از کشف آن در نمونه مدفوع انسان، از آنجا که در ابتدا آن را بعنوان یک قارچ مخمر بی‌ضرر می‌پنداشتند تا ده‌ها سال به فراموشی سپرده شد تا اینکه در مطالعاتی که از سال 1967 بر روی آن شروع شد، معلوم گردید که دارای هسته و سیتوپلاسم و سایر ضمائم تک یاخته‌ها می‌باشد. در بررسی‌های روی ژن ssurRNA آن، مشخص شد که در سلسله جدید و جدای از سایر جانداران، بنام استرامنوپیل یا کرومیستا قرار دارد که موجب جاذبیت مطالعات برای متخصصان علم انگل‌شناسی گردید (8-5).
علیرغم مطالعات متعددی که در طول دو دهه اخیر روی بلاستوسیتیس انجام گرفته بجز اشکال مرفولوژیکی که دارای چهار فرم واکوئوله، گرانوله، آمبوئیدی و کیست است، سایر موارد بیولوژیکی آن مانند تکثیر، سیر تکاملی، میزبان‌ها و بیماریزائی آن بخوبی شناخته نشده است، به همین دلیل از آن به عنوان یک انگل مرموز یاد می‌شود (10و9). گرچه بسیاری از مطالعات، انگل بلاستوسیتیس را بالقوه پاتوژن می‌دانند و علائم گوارشی غیراختصاصی مانند اسهال، دل‌درد، نفخ شکم، یبوست و علائم خارج گوارشی مانند آلرژی که بصورت خارش و راش یا قرمزی پوست و درد مفاصل بروز می‌نماید را به آن نسبت می‌دهند، ولی از آنجا که در افراد بدون علامت هم گزارش شده، بیماریزائی آن مورد بحث است (11). امروزه با استفاده از PCR که این انگل را بر اساس شناسایی ژن ssurRNA به چند نوع ساب‌تایپ تقسیم نموده، مشخص شده که ساب‌تایپ شماره 1 در بسیاری از مطالعات به عنوان عامل بیماری معرفی گردیده (12) و این در حالی است که ساب‌تایپ شماره 2 را غیربیماریزا می‌دانند (13) و توانسته‌اند تا حدودی براین ابهامات فائق آیند.
هدف از این مطالعه تعیین درصد آلودگی بیماران اسهالی شهرستان خرم‌آباد به انگل بلاستوسیتیس بود تا نقش انگل را در ایجاد اسهال بعنوان یکی از علائم بارز بلاستوسیتوزیس مشخص نماید و نیز مقدمه‌ای برای مطالعات بعدی گردد.
مواد و روش‌ها
جمع‌آوری نمونه: مطالعه توصیفی حاضر از خرداد تا آبان سال 1393 بر روی یکصد نمونه مدفوع اسهالی پس از تکمیل فرم پرسشنامه از مراجعین به مراکز بهداشتی- درمانی شهرستان خرم‌آباد انجام گرفت. نمونه‌های جمع‌آوری شده به روش مستقیم و مولکولی مورد بررسی قرار گرفتند. از هر نمونه مدفوع 200mg در میکروتیوب‌های 2ml ریخته و تا زمان استخراج DNA در دمای oC20- نگهداری شدند.
استخراج DNA
DNA ژنومی توسط کیت استخراج Accupre R stool DNA Extraction kit (Bioner, south Korea)از نمونه‌های مدفوع طبق دستور‌العمل شرکت سازنده مستقیماً استخراج گردید. DNAهای استخراج شده تا زمان انجام PCR در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
PCR
جفت پرایمرهای اختصاصی به کار گرفته شده در این مطالعه شامل:
bll400Forc [51-GGA ATC CTC TTA GAG GGA CAC TAT ACA T-31]
Bll710 Revc [51-TTA CTA AAA TCC AAA GTG TTC ATC GGA C-31]
بودند (14).
برنامه PCR مورداستفاده عبارت بود از:
5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد،، سپس 30 سیکل شامل دماهای 94، 58 و 72 درجه سانتیگراد، هر یک به مدت یک دقیقه و در پایان 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد،(16و 15).
محصول PCR روی ژل آگارز 1/5 درصد الکتروفورز شده و از طریق دستگاه Gel Document باندها مشاهده گردیدند.
یافته‌ها
اطلاعات 100 بیمار بررسی شده، در جدول 1 گزارش شده است. در آزمایش مستقیم نمونه‌های مدفوع جمع‌آوری شده، انگل روده‌ای بیماریزا مشاهده نگردید. در تمام افراد مورد آزمایش، علائم بالینی وجود داشت و دل‌درد بالاترین (54%) و حالت تهوع کمترین (10/5%) علائم بالینی گزارش شده بودند. از صد نمونه مدفوع اسهالی مورد آزمایش به وسیله PCR، 5 نمونه (5%) از نظر آلودگی به انگل بلاستوسیستیس مثبت بودند. محصول PCR با وزن مولکولی bp310 نشان‌دهنده وجود انگل بلاستوسیستیس هومینیس بود (شکل 1). 5 نمونه مثبت متعلق به 4 زن و 1 مرد بود که آب مصرفی 4 نفر از آنها آب لوله‌کشی و 1 نفر آب چشمه بود. همچنین علائم بالینی افراد مربوطه شامل دل‌درد، دل‌پیچه و نفخ بود.
بحث و نتیجه‌گیری
شیوع انگل بلاستوسیتیس به روش ملکولی در بیماران اسهالی در این مطالعه 5% بود که در مقایسه با سایر مطالعات انجام شده در استان که شیوع را 6/5% (15) و 5% (17) اعلام کرده بودند، دور از انتظار نبود. شیوع گزارش شده در منطقه مورد بررسی در مقایسه با کشورهای در حال توسعه که شیوع بلاستوسیستیس در آنها 50-30 درصد گزارش شده، کمتر می‌باشد، در حالی که با کشورهای توسعه‌‌یافته که شیوع انگل مذکور در آنها 10–0/5 % اعلام گردیده، مشابه است (18).
مطالعات قبلی این کاهش را ناشی از بالا بودن سطح تحصیلات، استفاده از آب چشمه‌ها و تبلیغات بهداشتی از طریق رسانه‌ها اعلام نموده‌اند (19). نتایج حاصل از این مطالعه در مقایسه با بعضی از شهرهای کشور مانند بندرعباس (24/6%)، یزد (15/7%)، تهران (12/8%) و شیراز (25/4%) (23-20) کمتر است و در مقایسه با بعضی دیگر از استان‌ها مانند البرز (0/8%)، خوزستان (2/4%)، زاهدان (2/2%) و قزوین (0/7%) (27-24) که به روش‌های رایج و میکروسکوپی موردبررسی قرار گرفته بودند، نسبتاً بالا بود.
هرچند مطالعه مذکور مانند سایر مطالعات بر روی انگل بلاستوسیستیس یک سویه بود ولی برعکس آنها که بررسی را روی افراد مبتلا به انگل انجام می‌دادند و علائم را به بلاستوسیستیس نسبت می‌دادند، در اینجا روی افراد مبتلا به اسهال به عنوان شاخص‌ترین علائم گوارشی بلاستوسیستوزیس (28) انجام گرفت که گرچه شیوع نسبتاً پایینی را در این جامعه نشان داد ولی در مقایسه با میزان شیوع انگل مذکور به روش مستقیم در استان (17) و به روش مولکولی PCR در شهر خرم‌آباد (15) قابل توجه است و به مطالعات بیشتری نیاز دارد و نادیده گرفتن آن در جامعه پزشکی شرط انصاف نیست.
از آنجا که مطالعه مشابهی تاکنون در ایران انجام نشده و پزشکان معالج هم با وجود مطالعات متعدد مبنی بر بالقوه پاتوژن بودن آن، دارو تجویز نمی‌کنند و آن را نادیده می‌گیرند، چنین مطالعه‌ای ضروری به نظر می‌رسید تا شاید قسمتی از این ابهامات در خصوص بیماریزایی آن روشن شود و از آنجا که انگل‌های دیگر مانند ژیاردیا لامبلیا، کریپتوسپوریدیوم و انتامبا هیستولیتیکا هم باعث اسهال می‌گردند و در ایجاد این عارضه مشترکند استفاده از روش‌های تشخیصی با حساسیت بالاتر می‌تواند با اطمینان بیشتر نقش انگل بلاستوسیتیس در این عارضه را مشخص نماید.
تشکر و قدردانی
از مدیر محترم و همکاران گرامی مرکز تحقیقات داروهای گیاهی رازی دانشگاه علوم پزشکی لرستان که از هیچگونه کمکی دریغ نفرمودند صمیمانه قدردانی می‌گردد.
شکل 1: محصولPCR بر روی ژل آگارز 1/5%
ستون 1 و 5: Marker 100 bp DNA Ladder
ستون 2: کنترل مثبت
ستون 3: ایزوله مثبت از نظر وجود انگل بلاستوسیستیس در نمونه تهیه شده از بیمار (محصول PCR با وزن 310 bp)
ستون 4: کنترل منفی
جدول 1: متغیرهای جمع‌آوری شده از بیماران مورد مطالعه
|
علائم بالینی |
منبع آب مصرفی | محل زندگی |
جنس |
متغیر |
|||||||
| کم اشتهایی | نفخ | تهوع | دل درد | چشمه | چاه | لوله | روستا | شهر | زن | مرد | |
| 15 | 20 | 11 | 54 | 10 | 16 | 74 | 18 | 82 | 51 | 49 |
تعداد |
| 15 | 20 | 11 | 54 | 10 | 16 | 74 | 18 | 82 | 51 | 49 |
درصد |
منابع:
1- Gassama A, Salif Sow P, Fall F, Camara P, Philippe H, GuèyeN’diaye A, et al. Ordinary and opportunistic enteropathogens associated with diarrhea in senegalese adults in relation to human immunodeficiency virus serostatus. Int J Infec Dis. 2001; 5(4): 192–198
2- Jones MS, Whipps CM, Ganac RD, Hudson NR, Boorom K. Association of Blastocystis subtype 3 and 1 with patients from an Oregon community presenting with chronic gastrointestinal illness. Parasitol Res. 2009 Jan;104(2):341-5.
3- Zhang X, Qiao JY, Zhou XJ, Yao FR, Wei ZC. Morphology and reproductive mode of Blastocystis hominis in diarrhea and in vitro. Parasitol Res. 2007 Jun;101(1):43-51.
4- Yan Y1, Su S, Ye J, Lai X, Lai R, Liao H, Chen G, Zhang R, Hou Z, Luo X. Blastocystis sp. subtype 5: a possibly zoonotic genotype. Parasitol Res. 2007 Nov;101(6):1527-32.
5- Windsor JJ, Macfarlane L, Whiteside TM, Chalmers RM, Thomas AL, Joynson DH. Blastocystis hominis: a common yet neglected human parasite. Br J Biomed Sci. 2001;58(2):129-30.
6- Zierdt CH. Blastocystis hominis–past and future. Clin Microbiol Rev. 1991;4:61–69.
7- Cavalier-Smith T. A revised six-kingdom system of life. Biol Rev Camb Philos Soc. 1998 Aug;73(3):203-66.
8- Doyle PW, Helgason MM, Mathias RG, Proctor EM. Epidemiology and pathogenicity of Blastocystis hominis. J Clin Microbiol. 1990;28:116–121
9- Zhang X, Qiao YJ, Zhou JX, Yao RR, Wei CZ. Morphology and reproductive mode of Blastocystis hominis in diarrhea and in vitro. Parasitol Res. 2007;101: 943-951.
10- Tan TC, Suresh K.G . Evidence of plasmotomy in Blastocystis hominis. Parasitol Res. 2007; 101:1521–1525.
11- Tan KSW: New insights on classification, identification, and clinical relevance of Blastocystis spp.Clin Microbiol Rev. 2008, 21:639-665
12- Radrm E, Ahmet G, Gullu E. Ismil Soner K. Identification of Blastoctis hominis isolates from asymptotic and symptomatic patients by PCR. Parasitol Res. 2009; 105: 1589-1592.
13- Doyruman ALF, dagci H, yoshikawa H, yoshikawa h, kurt O, Demirel m.A Possible link between subtype 2 and asymptomatic infections of Blastocystis hominis. Parasitol Res. 2008; 103: 685-689.
14- Stensvold R, Brillowska- Dabrowska A, Nielsen HV, Arendrup mc. Detection of Blastocytis hominis in unpreserved stool specimens by using PCR. J Parasitol. 2006; 92(5): 1081-1087
15- Badparva E, Sadraei J, Foruzandeh M, Kheirandish F. Molecular prevalence of Blastocystis hominis in refferd to Khorramabad city laboratories. Yafte. 2012; 14(4): 107-112.
16- Ebrahim Badparva, Javid Sadraee, Farnaz Kheirandish, Mehdi Frouzandeh. Genetic Diversity of Human Blastocystis Isolates in Khorramabad, Central Iran. Iranian J Parasitol: Vol. 9, No. 1, Jan -Mar 2014, pp.44-49.
17- Badparva E, Pournia Y, Fallahi Sh. Prevalence of Blastocytis hominis in lorestoin province, west of Iran. Asian j of Biological Sciences. 2012; 5(1):57-61.
18- Su FH1, Chu FY, Li CY, Tang HF, Lin YS, Peng YJ, et al. Blastocystis hominis infection in long-term care facilities in Taiwan: prevalence and associated clinical factors. Parasitol Res. 2009 Oct;105(4):1007-13.
19-Badparva E, Kheirandish F, Ebrahimzade F. Prevalence of intestinal Parasites in Lorestan Province, West of Iran. Asian Pac j Trop Dis. 2014; 4(1): 930-934.
20- Bairami Kuzehkanani A, Rezaei S, Babaei Z, Niyyati M, Hashemi SN, Rezaeian M. Enteric Protozoan Parasites in Rural Areas of Bandar- Abbas southern Iran: comparison of past and present Situation. Iranian j Pub Health. 2011; 40(1): 80-85.
21- Ebadi m, Anvarim.H, Rajabioun A, Dehyhani A.A. Parasitic infections in cases Referring to Yazd central laboratory 2002-2004. JSSU, 2008; 15(4): 53-58.
22- Akhlaghi L, Shamsedin J, Meamar AR, Razmjou E, Oormazdi H. Frequency of intestinal Parasites in Tehran. Iranian j Parasitol. 2009; 4(2): 44-47.
23- Neghab M, Moosavi S, Moemenbellah-Frad MD. Prevalence of intestinal parasitic infections among catering Staff of students canteens at Shiraz, Southern Iran. Pakistan J Biol Science. 2006; 9(14): 2699-2703.
24- Nasiri V, Esmailnia k, karimi Gh, Nasiri m, Akhavan O. intestinal Parasitic infections among inhabitants of karaj city, Iran in 2006-2008, Korean j Parasitol 2009; 47(3): 265-268.
25- Molavi GhR, Mirahmadi H, Rezaian M, Bigemkia E, Daryani N, Rokni MB. Prevalence of intestinal parasites in tribal parts of Khuzestan province during 2005-07. Govaresh J. 2007; 12(4): 219-228.
26-Haghighi A, Khorashad AS, Nazemalhosseini-Mojarad B, Kazemi B , Rostami-Nejad M, Rasti S. Frequency of enteric protozoan parasites among patients with gastrointestinal complaints in medical centers of Zahedan, Iran. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2009 May;103(5):452-4.
27- Sadeghi H, Bakht M, Saghafi H, Shahsavari T. Prevalence of intestinal parasites in a population in Eghbalieh city from Qazvin Province, Iran . J Parasit Dis. 2013
28- Tan KS. New insights on classification, Identification and clinical relevance of Blastocystis SPP.Clin Microbial Rev. 2008; 21(4): 639-665.
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام