مروری بر آزمایش
cell free fetal DNA
NIPT(Non Invasive Prenatal Testing) &
جهت تشخیص اختلالات کروموزومی (21، 18 و 13)
غلام‌رضا هدایتی کارشناس نظارت و ارزیابی آزمایشگاه‌ها، مدیریت امور آزمایشگاه‌های معاونت درمان دانشگاه علوم پزشکي مشهد
در سال 1997 دانشمندان به وجود DNA جنین در خون زنان باردار پی بردند. این کشف مهم که با ردیابی قسمت‌هایی از کروموزوم Y جنین در سرم مادر صورت گرفت، مبنایی برای ظهــور روش‌های غیرتهاجمی تشخیص آنوپلوئیدی‌ها در دوران بارداری شد. اصـول این روش بر پایه اندازه‌گیری DNA آزاد در پلاسمای مادر (Cell Free Fetal DNA) است که از سلول‌های جفت آزاد می‌شوند. صاحب‌نظران، این کشف را انقلابی در روش‌های تشخیصی دوران بارداری دانسته و پیش‌بینی می‌کنند که در آینده نزدیک تست‌های مبتنی بر آن، به‌صورت کامل جایگزین روش‌های سنتی رایج غربالگری گردد.
اختلالات و جهش‌های ژنتیکی از جمله خطرناک‌ترین مواردی هستند که سلامت نوزاد انسان را تهدید می‌کنند. اختلالات ژنتیکی در اثر عوامل مختلفی ممکن است بروز کنند که از جمله می‌توان به مصرف دخانیات، الکل، ازدواج فامیلی و … اشاره کرد. غربالگری با این روش را می‌توان بهترین روش برای جلوگیری از بروز این اختلالات دانست. تست غربالگری NIPT (آزمایش خون غیرتهاجمی پیش از تولد) بسیار دقیق‌تر از روش‌های غربالگری موجود بوده و برخلاف روش‌های تهاجمی مانند نمونه‌گیری از جفت و یا مایع آمنیوتیک هیچگونه خطر سقط جنین را به همراه نخواهد داشت. این تست یکی از جدیدترین روش‌های بررسی سلامت جنین است و برای زنانی که در سن بالا باردار می‌شوند، ضروری است. در آزمایش خون غیرتهاجمی پیش از تولد، خون مادر برای یافتن DNA آزاد جنین بررسی می‌شود. از آن جایی که بخش‌هایی از DNA جنین وارد گردش خون مادر می‌شود، این تست برای شناسایی برخی اختلالات ژنتیکی در جنین به کار می‌رود. نتیجه این آزمایش جنبه تشخیصی نداشته و فقط احتمال بروز اختلالات ژنتیکی را به ما نشان می‌دهد تا در صورت نیاز آزمایش‌های تأییدی دیگر انجام شود. آزمایش غیرتهاجمی بارداری فقط با نمونه‌گیری از خون مادر انجام می‌شود و در نتیجه، خطر سقط جنین مربوط به روند تهاجمی از بین می‌رود.
غالباً غربالگری تریزومی 21 (سندرم داون)، تریزومی 18، تریزومی 13 و آنوپلوئیدی‌های کروموزوم‌های جنسی با استفاده از DNA آزاد جنینی در جریان خون مادر قابل انجام است. با انجام این آزمایش، 99- 98٪ جنین‌های مبتلابه سندرم داون، در همان دوران حاملگی، شناسایی می‌شوند. قابل ذکر است که تست‌های تشخیصی با استاندارد طلایی، روش‌های تهاجمی (مثل آمنیوسنتز یا نمونه‌گیری از پرزهای کوریون) برای تعیین کاریوتایپ جنین هستند و در افرادی که تست NIPT آنها مثبت باشد، نیز توصیه می‌گردد. البته طبق توصیه انجمن طب مادر و جنین در دسامبر 2012، باید به این نکته توجه داشت که این تست به دلیل نتایج کاذب رؤیت شده، تنها به‌عنوان تست غربالگری در نظر گرفته می‌شود و تست تشخیصی نبوده و جایگزین آمنیوسنتز نیست.
سندرم X شکننده، دیستروفی عضلانی دوشن، هموفیلی و آنمی داسی شکل در جنین از طریق این تست قابل شناسایی است. این تست برای زنان در معرض خطر مانند زنان با سابقه داشتن فرزند معلول یا اختلال ژنتیکی و یافته‌های غیرطبیعی اولتراسوند (افزایش NT)، نتایج غیرطبیعی تست غربالگری سرم، سابقه وجود حاملگی آنوپلوئیدی در خانواده از جمله مواردی است که فرد را برای انجام آزمایش کاندید می‌نماید. باید توجه داشت این آزمایش در بارداری‌های دوقلویی و در موارد اهدای تخمک انجام نمی‌شود.
در روش NIPT، به دلیل بررسی محتوای ژنتیک جنین می‌توان به جنسیت جنین، منفی یا مثبت بودن گروه خونی (Rh) او نیز پی برد. برخی محققین معتقدند این آزمایش علاوه بر بررسی وضعیت جنین، نوعی تست برای بررسی سلامت مادر نیز محسوب می‌شود؛ به‌عنوان مثال در یکی از موارد، طی آنالیز DNA یافت شده در خون مادر ابتدا گمان می‌رفت که جنین دچار نوعی اختلال کروموزومی شده، ولی در جریان آزمایش‌های بیشتر مشخص شد که جنین کاملاً سالم بوده و این تغییرات سلولی نشان‌دهنده درجات اولیه سرطان در مادر بوده است، این آزمایش می‌تواند سرطان را در مراحل اولیه و حتی قبل از بروز علائم تشخیص دهد، البته هنوز از این آزمایش برای غربالگری خود مادر استفاده نمی‌شود.
*راهنما و استانداردهای تکنیک NIPT
(با استفاده از تکنیک Cell free Fetal DNA)
پزشک درخواست‌کننده NIPT بایستی متخصص زنان- زایمان، مشاور ژنتیک و یا متخصص ژنتیک پزشکی باشد. این آزمایش زودتراز آزمایش‌های دیگر در بارداری انجام می‌شود و سن مادر نیز محدودیت ندارد. در مقابل، نمونه‌برداری از پرزهای کوریونی (CVS) بین هفته 10 تا 15، تست چهارگانه بین هفته 15 تا 22 و آمنیوسنتز بین هفته 15 تا 20 انجام می‌شود. تشخیص جنسیت جنین با استفاده از این روش قبل از تشخیص با اولتراسوند قابل انجام است. مادر باردار مراجعه‌کننده باید قبل از انجام تست NIPT، حداقل یک بار سونوگرافی انجام داده باشد که در آن سن بارداری و وضعیت تک قلویی جنین ذکر شده و یک کپی از آن در هنگام پذیرش به آزمایشگاه را تحویل دهد.
* موارد درخواست تست NIPT (با استفاده از Cell free Fetal DNA)
اول، سابقه تولد نوزاد مبتلا به تریزومی‌های 13(سندرم پاتو)، 18(سندرم ادوارد) و 21 (سندرم داون)
دوم، مشاهده حداقل یک یافته مثبت سونوگرافیک به نفع آنومالی‌های شایع مثل تریزومی‌های 13، 18 و 21. در چنین مواردی به منظور کاهش نگرانی مادر باردار، کاهش سقط غیرقانونی و یا سقط ناشی از آمنیوسنتز غیرضروری، تست NIPT قابل انجام است؛
و سوم، نتایج مثبت غربالگری سه ماهه اول و دوم، احتمال خونریزی مادر (برای مثال تهدید به سقط)، مثبت بودن عفونت ویروسی مادر، مادر با RH منفی، حاملگی با استفاده از روش‌های کمک باروری اندیکاسیون دارد.
*گذری بر مرحله پیش از انجام آزمایش:
الف- تکمیل کردن فرم‌های مربوطه لازم
ب- نمونه‌گیری
یک برگ فرم اطلاعات بیمار که به دقت تمام موارد ثبت شده و در صورت امکان یک کپی از آخرین نتیجۀ سونوگرافی و جواب تست دابل مارکر، تریپل مارکر یا کواد مارکر ضمیمه فرم گردد. همچنین دو برگ فرم رضایت‌نامه یکی به زبان فارسی و دیگری به انگلیسی که هر دو برگ توسط بیمار (مادر) می‌بایست امضا شده و ضمیمه گردد. این آزمایش با کد شناسه 810328 از تعرفه آزمایش‌های ژنتیک مورد پذیرش قرار می‌گیرد. آزمایشگاه گیرنده نمونه (یا انتقال‌دهنده نمونه به آزمایشگاه ژنتیک منتخب در کشور) بایستی دارای مسئول فنی ژنتیک با سیستم مدیریت کیفیت بر اساس استاندارد
INSO- ISO 15189 باشد. آزمایش نیاز به ناشتا بودن ندارد، نمونه‌گیری خون برای انجام آزمایش، درست مانند انجام یک آزمایش خون ساده است. دو لوله با برچسب مشخصات که به هر لوله حدود 10-8 میلی‌لیتر خون افزوده و با سر و ته کردن (10 بار) خون با ضد انعقاد داخل لوله مخلوط می‌شود و مثل شرایط اولیه بسته‌بندی می‌گردد. این لوله‌ها باید در دمای اتاق نگهداری و حداکثر در مدت 48 ساعت به آزمایشگاه ارسال شوند. نمونه‌گیری از خون تام و رعایت کلیه دستورالعمل‌های مرتبط جهت حفظ کیفیت نمونه و نمونه‌گیری صحیح، نقش بسزایی در پایداری سهم DNA جنینی دارند، به‌طوری که لیز شدن تعداد کمی از سلول‌های سفید خونی، نمونه را رقیق می‌کند. برای حل این مشکل باید نمونه خون را در لوله‌های استاندارد حاوی EDTA جمع‌آوری نمود و توصیه می‌شود که حداکثر تا 96 ساعت مراحل جداسازی پلاسما انجام گردد. پلاسمای حاصل در فریزر °C80- پایدار است، در صورت استفاده از لوله‌های Streck tube می‌بایست پس از نمونه‌گیری، 10-8 بار آرام نمونه سر و ته شود. این لوله‌ها تا یک هفته در دمای اتاق قابل نگهداری هستند و نباید در یخچال یا فریزر قرار گیرند.
*گذری بر مراحل انجام آزمایش:
به دلیل حساسیت تست، توصیه به تنظیم فشار هوا و ایجاد فضاهای مجزا جهت جلوگیری از آلودگی می‌شود. (فضاهای جداسازی پلاسما، استخراج DNA، …) و عدم استفاده مشترک از ابزارها و پوشش‌ها نیز توصیه می گردد. البته باید مقداری نمونه پلاسمای جداشده از تمامی نمونه‌ها پس از انجام آزمایش، همچنین نمونه DNA استخراج‌شده نیز برای مدت حداقل یک سال پس از تولد نوزاد در فریزر منهای 80 درجه نگهداری شود. همچنین به منظور کنترل کیفی خارجی، هر 3 ماه با ارسال حداقل یک نمونه و آنالیز آن توسط آزمایشگاه مرجع یا همکار مستقل پیشنهاد شده و توصیه می‌شود نمونه‌گیری کشت میکروبی از محیط آزمایشگاه به منظور جلوگیری از آلودگی DNA، هر 2 ماه یک بار صورت گیرد. نحوه انجام تست نمونه‌گیری خون برای انجام آزمایش درست مانند انجام یک آزمایش خون ساده است. نمونه‌ای از خون مادر توسط یک سرنگ استریل گرفته شده و در آزمایشگاه برای یافتن DNA آزاد جنین (cf DNA) بررسی می‌شود. زمانی که نتیجه آزمایش خون آماده شد، با در نظر گرفتن جواب این آزمایش و بررسی سونوگرافی و تست سلامت جنین که در سه ماهه اول انجام شده، می‌توان تشخیص داد که آیا انجام آزمایش‌های بیشتر نیاز است یا خیر. مواردی که موجب بروز خطا در تست غربالگری می‌شوند، عوامل متعددی هستند که ممکن است جواب تست را تغییر دهند و موجب شوند تا اختلال موردنظر نشان داده نشود.
دقت آزمایش NIPT، نتیجه منفی کاذب کمتری نسبت به سایر آزمایش‌هایی که میزان هورمون‌ها و پروتئین‌های موجود در خون مادر را اندازه‌گیری می‌کنند، از جمله تست سلامت جنین در سه ماهه اول و نیز آزمایش چهارگانه دارد. همچنین دقت آزمایش برای تشخیص سندرم داون (تریزومی 21) 99 درصد است؛ این بدین معناست که با این آزمایش می‌توان 99 درصد از موارد سندرم داون را تشخیص داد؛ یعنی میزان منفی کاذب آن کمتر از 1 درصد است. خانم‌های حامله‌ای که سن بالاتر از 35 سال دارند، زنانی که سابقه پارگی کیسه آب دارند، همچنین زنان که دارای جنین طلایی (جنینی که بعد از چندین سال ناباروری، والدین با سن بالا و یا حاصل از حاملگی IVF تشکیل شده‌اند) هستند، همچنین وجود یک تست غربالگری مثبت که نشان‌دهنده افزایش ریسک اختلالات کروموزومی است مانند تست‌های غربالگری سه ماهه اول، دوم، اینتگریتد و یا سکوننشیال، سابقه قبلی جنین و یا فرزند مبتلا به تریزومی‌های شایع که سبب افزایش ریسک تریزومی 13 و 21 در جنین می‌شود، همچنین زنانی که از نمونه‌گیری تست‌های تشخیصی مثل آمنیوسنتز و یا CVS ترس دارند، از کسانی هستند که انجام این تست برای آنها ضرورت دارد. انجام تست غربالگری می‌تواند از بروز بسیاری از اختلالات شما را آگاه کند و با تشخیص به‌موقع قادر خواهید بود تا به درمان اختلالات بپردازید. این تست در هفته دهم بارداری انجام می‌شود و به پزشک کمک می‌کند تا مناسب‌ترین اقدام در بهترین زمان را داشته باشد. این تست جهت تمامی موارد حاملگی از جمله دوقلو‌ها، حاملگی تخمک اهدایی و لقاح خارج از رحم و IVF و IUI در دسترس است. در مقایسه با روش‌های موجود، این تست دقیق‌تر و دارای موارد مثبت کاذب بسیار پایین‌تر است. این موضوع نیاز به تست‌های تهاجمی مانند آمنیوسنتز با ریسک سقط را کاهش می‌دهد. تست NIPT غیرتهاجمی بوده و بنابراین هیچ خطری برای مادر یا جنین به همراه ندارد. مشاوره با متخصصین مرتبط قبل از انجام تست بسیار ضروری بوده تا مطمئن شوید چه مواردی در این غربالگری بررسی می‌شوند.
*گذری بر مرحله پس از انجام آزمایش و تفسیر بالینی:
درصد DNA جنینی، حساسیت و اختصاصیت روش، همچنین روش انجام آزمایش باید در برگه جواب ذکر شود. آزمایشگاه باید تست‌های تأییدی و یا کاریوتایپ را بر روی نمونه مایع آمنیوتیک و یا CVS داشته و یا با آزمایشگاه‌های واجد شرایط قرارداد بسته باشد. همچنین آزمایشگاه انجام‌دهنده تست باید دارای مسئول فنی با تخصص ژنتیک پزشکی و انسانی باشد و جواب‌ها توسط ایشان تأیید و امضاء شود و نیز آزمایشگاه باید کلیه اطلاعات و محاسبات و تفسیر و نتیجه را برای حداقل 2 سال حفظ نماید.
برداشتی از:
– استانداردهای آزمایش غیرتهاجمی دوران بارداری از نظر ناهنجاری‌های کروموزومی (NIPT ) با استفاده از DNA آزاد جنینی در خون مادر (Cell free Fetal DNA) در آزمایشگاه تشخیص ژنتیک/ معاونت بهداشت– آزمایشگاه مرجع سلامت /1398
– بررسی عملکرد تست غربالگری غیرتهاجمی (NIPT) برای تشخیص آنوپلوییدی در زنان باردار پرخطر Narjes Hassan Haivadi-/Saideh Ziae – Fatemeh Torabi دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرگان/ 1395
Prenatal Screening Tests; cffDNA
تست غیرتهاجمی تشخیص سندرم داون و تریزومی‌های 18 و 13 Non Invasive Fetal Trisomy (NIFTY)
تست غیرتهاجمی تشخیص پیش از تولد
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام