تازه‌هایی از باسیل‌ گرم منفی غیرتخمیرکننده (سودوموناس‌ها)

تازه‌هایی از باسیل‌ گرم منفی غیرتخمیرکننده (سودوموناس‌ها)

دكتر رضا ميرنژاد (استاد تمام دانشگاه)

سودوموناس‌ها:

سودوموناس‌ها پاتوژن‌های فرصت‌طلبی هستند که در محیط‌های مختلفی یافت می‌شوند. سودوموناس‌ها احتیاجات غذایی ساده‌ای داشته و طیف وسیعی از دما را تحمل می‌کنند. آنها به علت دارا بودن تطبیق‌پذیری تغذیه‌ای، تقریباً در همه جا هستند،‌ با این حال استثناهایی نیز وجود دارد، سودوموناس‌ها در pH اسیدی و در محیط یافت نمی‌شوند، در حقیقت سودوموناس اسیدوفیلیک و ترموفیلیک وجود ندارند، با این حال اخیراً یک گونه گرمادوست به نام سودوموناس گرمادوست گزارش شده است. این باکتری‌ها در سراسر محیط بیمارستانی، در محیط‌های مرطوب همچون مواد غذایی، ظرفشویی، تجهیزات درمان تنفسی، دیالیز و حتی محلول‌های ضدعفونی‌کننده موجودند. سودوموناس‌ها در برخی از زیستگاه‌های غیرمعمول مانند لوازم آرایشی، استخرهای شنا، لوله‌های آب گرم و درون کفش‌های کتانی یافت می‌شوند. لازم به ذکر است که حضور این باکتری در داخل کفش‌های کتانی منجر به زخم‌های باز آلوده با سودوموناس آئروژینوزا می‌گردد. این باکتری‌ها اغلب به تعداد کمی در فلور طبیعی روده و بر سطح پوست انسان قرار دارند، اما در افراد بستری در بیمارستان با طول مدت بستری شدن، این احتمال افزایش می‌یابد.

این باکتری‌ها باسيل‌های گرم منفي، مستقيم يا كمي خميده، هوازی مطلق، اكثراً متحرك توسط فلاژل قطبي منو و مولتي‌تريش، بدون اسپور، عده‌اي كپسول‌دار، اكسيداز و كاتالاز مثبت هستند. متابولیسم آنها تنفسی بوده و هرگز تخمیری نیستند، لذا گلوكز و عده‌اي از قندها را از راه اكسيداتيو مصرف مي‌نمايند. این باکتری‌ها هوازی و از نظر منبع انرژی و کربن کموارگانوتروف هستند، بین 4 تا 43 درجه سلسیوس رشد می‌کنند، بعضی پيگمان‌هاي مختلف محلول و غيرمحلول در آب توليد مي‌كنند. باکتری‌های سودوموناس باکتری‌های خاکزی هستند که در خاک سبب ترشح سیدروفور 2 شده و جذب آهن و برخی دیگر از عناصر ریزمغذی نظیر روی را امکان‌پذیر می‌سازند.

سودوموناس‌ها به‌وسیله Walter migula در سال 1894 تا 1900 به‌عنوان یک جنس از باکتری‌های گرم منفی، میله‌ای شکل، قطبی و دارای تاژک تعیین شدند که pseudes به معنای کاذب (false) و monas به معنای تک‌واحد است که می‌تواند معنی واحد کاذب (False unit) را بدهد. تا سال 1984 بیش از 100 گونه در جنس سودوموناس قرار گرفته‌اند که بسیاری از آنها پاتوژن‌های گیاهی هستند. در سال 1973 پالرونی و همکارانش جنس سودوموناس را بر اساس همولوژی  rRNA به پنج گروه تقسیم کردند، ولی امروزه فقط گروه I شامل جنس سودوموناس است که دارای گونه‌های فلورسنت مانند سودوموناس آئروژینوزا، سودوموناس پوتیدا، سودوموناس فلورسنس و همچنین گونه‌های غیر فلورسنت مثل سودوموناس اشتوزری و سودوموناس آلکالی‌ژنز است (جدول 1).

وجه تمایزسودوموناس‌های فلورسنت از سایر سودوموناس‌ها، تولید پیگمان‌هایی است که در برابر نور با طول موج کوتاه فرابنفش (254 نانومتر) به‌ویژه در شرایط کمبود آهن خاصیت فلورسانس دارند. به این پیگمان‌های با خاصیت فلورسنت و محلول در آب سیدروفور و اختصاصاً در مورد سودوموناس‌ها پیووردین یا سودوباکتین گفته می‌شود. از مهم‌ترین گونه‌های فلورسنت می‌توان به سودوموناس فلورسنس، سودوموناس پوتیدا، سودوموناس آئروژینوزا و همچنین پاتوژن‌های گیاهی نظیر سودوموناس سایرنژائه و سودوموناس سیچوری اشاره نمود. برای افتراق گونه‌های فلورسنت پاتوژن‌های گیاهی از سایر فلورسنت‌ها، از آزمون آرژینین دی‌هیدرولاز استفاده می‌شود که پاتوژن‌های گیاهی آرژینین دی‌هیدرولاز منفی هستند. آزمون‌های ذوب ژلاتین، استفاده از قند ترهالوز و رشد در دماهای 41 و 4 درجه سلسیوس از مهم‌ترین شاخص‌های تفکیک گونه‌های سودوموناس فلورسنس، سودوموناس آئروژینوزا و سودوموناس پوتیدا است.

گروه II امروزه شامل جنس بورخولدریا است.

گروه III قبلاً شامل کماموناس اسیدوورانس بوده ولی امروزه در جنس دلفیتا طبقه‌بندی می‌شود.

گروه IV شامل Brevundimonas است.

گروه V شامل Stenotrophomonas است.

یکی از نکات جالب در مورد هیبریداسیون /DNA rRNA، شباهت بعضی گونه‌های سودوموناس به اشریشیا کلی است.

جدول 1: طبقه‌بندی خانواده سودوموناس بر اساس همولوژیrRNA 16S

Species		rRNA homology group
Pseudomonas aeruginosa (oxidase+) Pseudomonas fluorescens (oxidase+) Pseudomonas putida (oxidase+) Pseudomonas alcaligenes (oxidase+) Pseudomonas pseudoalcaligenes (oxidase+) Pseudomonas stutzeri (oxidase+)	Fluorescent King’s B agar Non-fluorescent	I Pseudomonas
Burkholderia cepacia (oxidase+) Burkholderia pseudomallei (oxidase+) Burkholderia mallei (oxidase+) Ralstonia pickettii (oxidase+) Burkholderia gladioli (oxidase-)		II Burkholderia
Delftia acidovorans (oxidase+)		III Delftia
Brevundimonas diminuta (oxidase+) Brevundimonas vesicularis (oxidase+)		IV Brevundimonas
Stenotrophomonas maltophilia (oxidase-)		V Stenotrophomonas

 سودوموناس آئروژینوزا (P.aeroginosa):

سودوموناس آئروژینوزا یک باسیل هوازی گرم منفی، اكسيداز مثبت و متحرك است كه 0/5تا 0/8 ميكرومتر پهنا و 1/5تا 3/0 ميكرومتر طول دارد. این باسیل‌ها به‌صورت تک‌تک، جفت و گاه به‌صورت زنجیره‌های کوتاه مشاهده می‌شوند و فاقد اسپور هستند. اغلب سلول‌ها یک فلاژل قطبی دارند، اما گاهی ممکن است ۲ یا ۳ فلاژل داشته باشند. بجز مواقعي كه در حضور نيترات رشد مي‌كند و آن را به نيتريت احيا مي‌نمايد، در ساير موارد هوازي اجباري است. سودوموناس قادر به تخمير کربوهیدرات‌ها نيست، اما از لحاظ تغذيه انعطاف‌پذير است و قادر به متابوليزه بيش از 80 ماده آلي بوده و حتي بر روي ساده‌ترين محیط‌های كشت نيز قابل رشد است. اين خصوصيات متابوليكی، نقش سودوموناس را در طبيعت نمايان مي‌سازد. این باكتري در آب و خاك يافت شده و در تجزيه مواد آلي نقش دارد. اغلب ارگانیسم‌هایی که از نمونه‌های بالینی جدا شده‌اند حاوی پیلی هستند. سودوموناس آئروژینوزا از نظر آزمون سیمون سیترات و آرژینین دهیدرولاز، مثبت و از نظر لیزین دکربوکسیلاز و اورنیتین دکربوکسیلاز، منفی است و در محيط كشت كليگلرآيرون آگار توليد H₂S نمي‌نمايد. سودوموناس آئروژینوزا دارای کلنی‌های گرد، درشت، خزنده، صاف و نامنظم است که به علت تولید پیگمان سبز در محیط کشت، آن را به رنگ سبز درمی‌آورد. بعضی سویه‌ها رنگ فلورسنت فلورسئین را تولید می‌کنند. به‌طور معمول محيط کشت‌های سودوموناس آئروژینوزا به دلیل توليد تری متیل آمین دارای خاصیت بوی معطر میوه‌ای و یا شبیه انگور است. هنگامی که نمونه‌های بالینی بر روی پلیت‌های آگار خوندار رشد می‌کنند، غالباً بتا همولیتیک هستند.

سودوموناس غیرتخمیرکننده و هوازی بوده و اکسیژن به‌عنوان گیرنده‌ی نهایی الکترون در آنها است. این باکتری‌ها از مصرف کربوهیدرات‌ها بدون تولید گاز، اسید ایجاد می‌نمایند. اگرچه این باکتری‌ها به‌عنوان هوازی اجباری تعریف می‌شوند، اما برخی از گونه‌های موجود در این جنس می‌توانند با استفاده از سیترات یا آرژینین به‌عنوان پذیرنده فرعی الکترون به‌صورت بی‌هوازی رشد کنند. همه گونه‌های موجود در این جنس کاتالاز مثبت بوده و واکنش‌های متیل‌رد، اندول و ووگس-پرسکوئر در آنها منفی است. از خصوصیات تغذیه‌ای و توانایی سودوموناس‌ها در استفاده از مواد آلی گوناگون می‌توان در طبقه‌بندی و تفکیک گونه‌های آن بهره گرفت؛ به‌عنوان مثال سودوموناس آئروژینوزا قادر است از گرانیول و استامید به‌عنوان تنها منبع کربن استفاده کرده و رشد نماید، در حالی که تعداد کمی از سایر گونه‌های موجود در این جنس توانایی انجام این کار را دارند.

بیماری:

عوامل بیماریزای متنوعی چون توکسین‌ها، آنزیم‌ها، فلاژل، پیلی، لیپوپلی‌ساکارید، آلژینات و پروتئازها در چسبیدن این باکتری به سلول‌های میزبان و بیماری‌زایی آن نقش دارند. در بین این عوامل اگزوتوکسین A و اگزوآنزیم S مهم هستند.

اگزوتوكسين A باكترى سودوموناس آئروژينوزا، محصول خارج سلولى است كه تقریباً در 65 درصد از سودوموناس آئروژينوزای جدا شده از بيماران توليد می‌شود. ژن اگزوتوكسين A باكترى سودوموناس آئروژينوزا به‌صورت ثابت روى كروموزوم باكترى قرار دارد. اکثر سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا، توکسینی به نام اگزوتوکسین A (ETA) را تولید می‌کنند که این توکسین بسیار شبیه توکسین دیفتری است. هر دوی این توکسین‌ها سبب ADP-ریبوزیله شدن مولکول Elongation factor 2 می‌شوند که این امر سبب غیرفعال شدن EF-2 و در نتیجه سبب مهار پروتئین‌سازی و در نهایت باعث مرگ سلولی می‌شود .اگزوتوکسین A یکی از مهم‌ترین فاکتورهای ویرولانس تولیدشده است؛ آنزیمی که از طریق غیرفعال کردن فاکتور  طویل‌کننده ۲ (EF-2)  باعث توقف سنتز پروتئین و در نهایت مرگ سلول می‌شود. اگزوتوکسین A از طریق تجزیه نیکوتین آمید دی‌نوکلئوتید (NAD) به ADP-ریبوزیلات EF2 عمل می‌کند. اگزوتوکسین A  دارای سه قسمت است؛ بخش I به گیرنده‌های سلولی میزبان متصل می‌شود و اندوسیتوز را پی‌ریزی می‌کند. بخش II موجب انتقال توکسین به درون سیتوپلاسم سلول می‌شود و بخش III، ADP-ریبوزیل فاکتور طویل‌کننده ۲ را کاتالیز می‌کند.

اگزوآنزیم S (EXOS) پروتئین‌های سلولی میزبان غیر از EF-2، ADP- ریبوزیله می‌کند. در میان پروتئین‌های هدف این آنزیم می‌توان به ویمنتین و چندین پروتئین دیگر که به GTP متصل می‌گردند، اشاره کرد. به دلیل اینکه پروتئین‌های متصل‌شونده به GTP در حرکت لیزوزوم‌ها نقش دارند، اگزوآنزیم‌ها ممکن است سودوموناس آئروژینوزا را از کشته شدن توسط لوکوسیت‌های پلی‌مرفونوکلئر و ماکروفاژها محافظت کنند. به نظر می‌رسد که اگزوآنزیم S عامل مهمی برای گسترش عفونت‌های سودوموناس آئروژینوزا در بیمارانی باشد که دچار سوختگی شده‌اند.

کسب آهن یک مرحله اساسی در ایجاد عفونت توسط باکتری‌ها است. سودوموناس آئروژینوزا با تولید دو نوع سیدروفور این عمل را انجام می‌دهد: پیوچلین و پیووردین.

پیوچلین با وزن مولکولی 325 دالتون، حلالیتش در آب بسیار کم است و احتمالاً در سنتز اگزوتوکسین A نقش دارد. همچنین سبب تولید یون هیدروکسیل شده که باعث آسیب بافتی می‌شود و به‌عنوان القاگر تولید اینترلوکین 8 نیز عمل می‌کند. پیووردین با وزن مولکولی 1500 دالتون، حلالیت بالایی در آب دارد و توسط تکنیک isoelectric focusing سه نوع مختلف از این پیگمان فلورسنت شناخته شده است.

سودوموناس آئروژینوزا یکی از عوامل اصلی ایجادکننده عفونت‌های بیمارستانی است و در افرادی که دچار ضعف سیستم ایمنی هستند سبب بیماری‌هایی مانند عفونت گوش میانی (Swimmers ear)، پوستی (به‌خصوص افراد دچار سوختگی)، باکتریمی، عفونت مغز استخوان و مفاصل، مننژیت و آبسه‌های مغزی، کراتیت، انتروکولیت، تب شانگهای (مشابه حصبه)، اندوکاردیت، پنومونی و عفونت مجاری ادراری می‌گردد.

انسان در اثر تماس طولانی مدت با آب آلوده به سودوموناس آئروژینوزا ممکن است دچار عفونت‌های پوستی شدیدی مانند فولیکولیت شود. فولیکولیت ناشی از این باکتری با راش‌های ماکوپاپولار یا وزیکولوپوستولار از سایر فولیکولیت‌ها بازشناخته می‌شود که معمولاً خودمحدودشونده است و در موارد کمی نیاز به درمان آنتی‌بیوتیکی است. سودوموناس آئروژینوزا به‌عنوان عامل اوتیت خارجی نیز مطرح است و در افراد دیابتی به دلیل عدم پاسخ به درمان آنتی‌بیوتیکی، نوع بدخیم این بیماری را شاهد هستیم. این باکتری همچنین عامل سببی بسیاری از عفونت‌های چشمی مانند کراتیت و اولسراسیون قرنیه است. سایر عفونت‌های چشمی ناشی از این باکتری عبارتند از: التهاب ملتحمه چشم، اندوفتالمی و سلولیت اوربیتال. گزارش‌هایی مبنی بر سپتی‌سمی پس از عفونت‌های چشمی موجود است که در نتیجه آن در افراد ضعیف از نظر ایمنی، پنومونی و اکتیما گانگرنوزوم اتفاق افتاده است.

معمولاً سودوموناس آئروژینوزا به‌ندرت عامل پنومونی اکتسابی از جامعه است ولی دستگاه تنفسی تحتانی افراد بستری‌شده در بیمارستان‌ها (مخصوصاً در افرادی که به‌تازگی تراکئوستومی انجام داده‌اند.) را کلونیزه می‌کند. معمولاً در بیمارانی که از نظر سیستم ایمنی مشکلی ندارند، این بیماری گذرا بوده و نیازی به درمان آنتی‌بیوتیکی نیست. امروزه شاهد بیماری‌های تنفسی ناشی از سودوموناس آئروژینوزا در بیماران مبتلا به ایدز هستیم.

یکی از شایع‌ترین باکتری‌های جداشده از افراد مبتلا به بیماری ژنتیکی سیستیک فیبروزیس، سودوموناس آئروژینوزا است که بیماران این باکتری را از منابع مختلف از محیط کسب کرده‌اند. بیشتر ایزوله‌های جداشده از این افراد اگزوتروف هستند و نیاز مبرمی به اسید آمینه متیونین و سایر اسیدهای آمینه مثل لوسین و آرژینین از خود نشان می‌دهند.

زیستگاه و نحوه انتقال:

سودوموناس‌ها پاتوژن‌های فرصت‌طلبی هستند که در محیط‌های مختلفی یافت می‌شوند. سودوموناس‌ها احتیاجات غذایی ساده‌ای داشته و طیف وسیعی از دما را تحمل می‌کنند. رویداد فصلی خاصی برای بیماری وجود ندارد. کلونیزاسیون گذرا در مجرای تنفسی و معده-روده‌ای بیماران بستری به‌ویژه آنهایی که با آنتی‌بیوتیک‌های وسیع‌الطیف درمان می‌شوند و یا در معرض ابزار کمک تنفسی قرار دارند یا به مدت طولانی در بیمارستان بستری هستند، وجود دارد. سودوموناس آئروژینوزا در آب، خاک و سبزی‌ها یافت می‌شود. این باکتری به روی پوست و درون دستگاه گوارشی و گلوی 3% از کل جمعیت حمل می‌شود، اما درجه ناقلیت بین کارمندان بیمارستان ممکن است تا 20% هم افزایش یابد. عموماً عفونت‌ها در نقاطی از بدن شکل می‌گیرد که رطوبت فراوان وجود دارد که شامل حفره دهانی- نای، پوست سوخته، گوش خارجی و زخم‌های جلدی است. تحقیقات اپیدمیولوژی نشان داده است که سودوموناس آئروژینوزا، 10% از عفونت‌های بیمارستانی و 11% از نمونه‌های خون را به خود اختصاص می‌دهد، اما فقط 4% از اپیدمی‌های بیمارستانی را موجب شده است. به علت اهمیت وجود این باکتری در آب، مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران آزمونی را بنام کیفیت آب- شناسایی و شمارش سودوموناس آئروژینوزا به روش صاف کردن غشایی- تعیین کرده است که این استاندارد انواع مختلف آب، آب معدنی و آب استخرهای شنا را شامل می‌شود.

همانطورکه در بالا اشاره شد، این باکتری علاقه به پايداري در فضاي بيمارستان را دارد، زيرا در برابر بسياري از ضدعفونی‌کننده‌ها و آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم است. انتقال آن بوسيلة پزشكان و پرستاران (دست‌ها و..) وسايل تنفسي و غيره صورت می‌گیرد و به همین دلیل از عوامل خطرساز براي بيماران بستري است. اين باكتري به علت داشتن مقاومت به بسياري از داروها و مواد ضدعفونی‌کننده، در مواد مصرفي (الكل، بتادين رقيق و …) که براي ضدعفوني نمودن بيماران استفاده می‌شود رشد نموده و با استفاده از آنها سبب آلودگي و عفونت مي‌گردد. این باکتری در آب مقطر و آب معمولی زنده می‌ماند و تکثیر می‌یابد. سودوموناس ائروژينوزا متنوع‌ترین باکتری مطرح در پزشکی از نظر منبع انرژی و کربن است.

تشخیص آزمایشگاهی:

خون، مدفوع، ادرار، CSF، خلط، ترشحات گوش میانی، چشم و ضایعات پوستی نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه هستند. برای تشخیص سودوموناس ائروژينوزا از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

رنگ‌آمیزی گرم:

به‌صورت باسیل‌های گرم منفی مستقیم يا کمی خمیده است و برخلاف آن اسینتوباکتر معمولاً خیلی کوتاه و اغلب کوکوئیدی است و نیز موراکسلا که کوتاه و غالباً جفت‌جفت یا به شکل زنجیره کوتاه است.

کشت:

به‌طورکلی باکتری سودوموناس آئروژینوزا از جمله باکتری‌هایی است که به‌راحتی بر روی اکثر محیط‌های کشت رشد می‌کند و نیازمندی غذایی خاصی ندارد. برای کشت و جداسازی این باکتری از سایر باکتری‌ها، از محیط‌های انتخابی مانند محیط آگار حاوی ستریماید، محیط آگار حاوی ایرگاسان و محیط آگار حاوی کلرواکسیلنول یا دتول استفاده می‌شود. در محیط آگار حاوی ستریماید ممکن است عوامل ضد میکروبی نظیر نالیدیکسیک اسید یا نیتروفورانتوئین نیز اضافه شود. با این حال باید این نکته را در نظر داشت که برخی از ایزوله‌های جداشده از بیماران مبتلابه سیستیک فیبروزیس به‌شدت به این ترکیبات حساس بوده، لذا بر روی چنین محیط‌هایی رشد نخواهند کرد.

همچنین سودوموناس‌ها بر روی اکثر محیط‌های آزمایشگاهی مثل بلادآگار و محیط‌های کشت افتراقی که برای رشد انتروباکتریاسه بکار می‌رود (مانند مکانکی) رشد می‌کنند. روی محیط SS در حدود 88% موارد رشد دارند. در محیط TSI فرم قلیا/ قلیا (ALK /ALK) ایجاد کرده و روی سطح شیب‌دار آن کلنی‌هایی با جلای فلزی مشاهده می‌شود. کشت، آزمایش اختصاصی برای تشخیص عفونت‌های سودوموناس آئرژینوزا است.

نکته مهم: کشت این باکتری به علت تولید تری متیل آمین دارای بوی مخصوص و مطبوع شبیه گل یاس یا انگور کپک‌زده[1]، عسل، شكوفه زردآلو و ذرت مکزیکی است.

انواع کلنی:

سودوموناس آئروژينوزا بر روي محيط نوترینت آگار (NA) پس از 24 ساعت در شرايط هوازي در °c37، شش تیپ (6-1) كلني ایجاد می‌کند که تیپ‌های 1 و 5 دارای اهمیت بیشتری هستند.

Type I: کلنی بزرگ، كمي محدب، درشت، خشن و تخم‌مرغي، با حاشيه مضرس با ظاهری شیشه صیقلی[2] داشته که بيشتر از بقیه قابل مشاهده است (شکل 1).

Type V: كلني موكوئيد و توليدكنندة آلژينات، برجسته و به رنگ‌های مختلف است. این کلنی‌ها معمولاً از خلط افراد مبتلا به فیبروزیس سیستیک جدا می‌شود (شکل 2).

نکته: کلنی‌های تیپیک سودوموناس آئرژینوزا بر روی محیط بلادآگار بزرگ (5-3 میلی‌متر)، تخت با حاشیه پر مانند و مضرس، سطح صاف و با همولیز بتا است. نمونه‌هایی که از منابع طبیعی بدست می‌آیند دارای کلنی‌های کوچک هستند.

شکل (1): کلنی سودوموناس آئرژینوزا روی محیط بلاد آگار

شکل (2): کلنی موکوئیدی سودوموناس آئروژینوزا روی محیط مکانکی آگار

پیگمان:

بسیاری از سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا تولید پیگمان می‌کنند که فقط بعضی از آنها محلول در آب هستند ولی تعداد دیگر غیرمحلول هستند. بعضی از این پیگمان‌ها مثل پیوسیانین ارزش تشخیصی دارند ولی به‌طور کلی این روش زیاد قابل اطمینان نیست زیرا تولید پیگمان‌ها بستگی به ترکیب محیط و شرایط محیطی باکتری دارد.

به‌طور کلی دو نوع پیگمان در سودوموناس آئروژینوزا وجود دارد:

پیگمان های فلورسنت: این نوع پیگمان‌ها محلول در آب، با قابلیت انتشار سریع در محیط کشت، غیرمحلول در کلروفرم و دارای خاصیت فلورسنس در زیر نور UV هستند، مثال معروف این گروه پیووردین است که خاصیت سیدروفوری نیز دارد. نه‌تنها در سودوموناس آئروژینوزا، بلکه در بسیاری از گونه‌های دیگر سودوموناس نیز تولید می‌شوند. محیط کشت اختصاصی برای این نوع پیگمان، محیط KingB است. راه دیگر برای القای تولید این نوع پیگمان، افزودن 10% سفیده تخم‌مرغ به محیط کشت است.

ساختمان پیووردین شامل 3 قسمت است: 1. کروموفور 2. زنجیره پپتیدی 3. زنجیره جانبی. گاهی در ساختمان پیووردین اسیدآمینه نوع D وجود دارد که آن را در برابر پروتئازها مقاوم می‌کند.

پیگمان های فنازینی: مثال معروف این گروه، پیوسیانین است که محیط کشت اختصاصی برای آن KingA نام دارد. مثال‌های دیگر این گروه عبارتند از: پیوروبرین، پیوملانین، کلرورافین و فنازین آلفا کربوکسیلات که در بین این پیگمان‌ها فقط پیوسیانین ارزش تشخیصی دارد، به‌علاوه پیوسیانین سبب تولید واسطه‌های نیتروژن فعال شده و سبب آزادی الاستاز نوتروفیل‌ها می‌شود و با کاهش آدنوزین منوفسفات درونی، سبب آسیب به مژک‌های تنفسی می‌گردد.

تولید پیگمانت بر روی محیط‌های بی‌رنگ مثل مولرهینتون به‌خوبی مشخص می‌شود (شکل 3). وجود پیگمان پیوسیانین (آبی رنگ) مختص سودوموناس آئرژینوزا است، البته پیگمان‌های دیگر هم ممکن است توسط این باسیل تولید شود که رنگ آبی را پوشانده و رنگ زرد، سبز، قرمز و یا قهوه‌ای ایجاد نماید، لذا اگرچه مشاهده پیگمان پیوسیانین تشخیص سودوموناس آئرژینوزا را تأئید می‌کند، ولی ندیدن آن دلیل بر رد تشخیص نیست.

شکل (3): کلنی سودوموناس آئرژینوزا روی محیط مولرهینتون

به رنگ سبز مایل به آبی توجه شود

كشت در محيط حركت:

كشت باکتری‌های غيرتخميري در فاصله mm 4 در سطح محيط و مشاهده واكنش پس از 6-4 ساعت (تيرگي و كدورت در سطح محيط) صورت می‌گیرد و با انكوباسيون طولاني واكنش ناپديد می‌شود. قرار دادن در حرارت  25 درجه سانتیگراد به مدت 48- 24 ساعت سبب كند شدن تقسيم و افزايش مشاهده حركت مي‌شود.

محيط Motility B medium حاوي 2،3، 5 تری فنیل تترازوليوم کلراید (TTC) است که مناسب براي مشاهده حركت است. چون سودوموناس‌ها هوازی هستند، روی محیط‌های حرکت در سطح رشد می‌كنند و نمی‌توان روی آن محیط‌ها حرکت آنها را مشخص کرد، لذا از محیط فوق استفاده می‌شود که باکتری متحرک تترازولیوم را احیا کرده و حلقه قرمز رنگ را بوجود می‌آورد (شکل 4). همه سودوموناس‌ها متحركند و رشد باكتري به‌صورت حلقه‌اي در اطراف لوله هم قابل مشاهده است.

شکل (4): تست حرکت در محیط حرکت B

حرکت در لوله سمت چپ مثبت و راست منفی است

 نکات مهم:

– وجود پپتون، یون‌های منيزيم و سولفات در محیط‌های کشت، استفاده از محیط‌های حاوی ژلاتین و شیر و همچنين قرار دادن محیط کشت در دماي 30-25  درجه سانتیگراد، سبب افزايش توليد پيگمان مي‌گردند. لازم به ذکر است که افزایش یون فسفات سبب افزایش تولید پیگمان فلورسین و کاهش تولید پیوسیانین می‌گردد.

– برای جدا کردن این باکتری‌ها از مواد آلوده، از ترکیبات چهار ظرفیتی آمونیم و ساولن و یا از محیط حاوی 3 صدم درصد ستریماید (Citrimide) استفاده می‌نمایند.

– حداقل ابزار تشخیصی برای سودوموناس آئرژینوزا:

مشاهده کلنی تیپیک بتاهمولیتیک + تست اکسیداز مثبت

 تشخیص سودوموناس آئروژینوزاهای بدون پیگمان‌ها:

10% از سویه‌های سودوموناس آئروژینوزاها در جداسازی اولیه پیگمان تولید نمی‌کنند. در این موارد رشد در 42 درجه سلسیوس و در ساب‌کالچرهای مختلف و عدم رشد در 4 درجه سلسیوس و توانایی احیای نیترات به گاز نیتروژن می‌تواند مؤید تشخیص سودوموناس آئرژینوزا باشد.

بررسی خصوصیات بیوشیمیایی:

این باکتری قادر است با تولید آنزیم‌های هیدرولیتیک، سوبستراهای مختلف را هضم کند. این باکتری ژلاتین را به‌سرعت ذوب کرده و آمونیاک تولید می‌کند، همچنین می‌تواند با تولید آنزیم‌های لیپاز، لسیتیناز و اوره‌آز به‌ترتیب توئین 80، زرده تخم‌مرغ و اوره را هیدرولیز کند، اما قادر به هیدرولیز نشاسته، پلی‌بتاهیدروکسی بوتریک اسید و ONPG نیست. بیشتر سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا، گلوکز را در محیط پایه اکسید کرده و بدون ایجاد گاز، اسید تولید می‌کنند. این باکتری همچنین قادر است این واکنش را در محیط‌های حاوی فروکتوز، گالاکتوز، مانوز، رامنوز، گزیلوز و مانیتول انجام دهد. سودوموناس آئروژینوزا اوره‌آز، اکسیداز، کاتالاز و آرژينين دهيدرولاز مثبت است. لیزیــــن دكربوكسيلاز، لاکتوز و اورنيتين دكربوكسيلاز منفي اسـت. IMViC=++– و روی KIA و TSI به‌صورت AIK/AIK است و H2S منفی است (جدول 2). همولیز کامل روی محیط بلاد آگار می‌دهد.

تست اكسيداز:

اين گروه از باکتری‌ها اكثراً اكسيداز مثبت هستند و به‌راحتی با انجام تست پس از 60-10 ثانيه معرف احیاشده را اكسيده نموده و از بي‌رنگ به رنگ صورتي تبديل مي‌كنند. برای انجام این تست بایستی از کلنی‌هایی استفاده شود که بر روی محیط فاقد مواد رنگی و گلبول قرمز باشند تا از ایجاد نتایج مثبت کاذب جلوگیری شود.

 محيط (Hugh- Leifson) O-F:

سودوموناس آئروژینوزا دارای متابولیسم اکسیداتیو است و مهم‌ترین راه متابولیسم گلوکز و سایر هگزوزها در این باکتری مسیر متابولیکی انترو-دئودوروف (Ed) است و از اکسیداسیون قندها مقدار کمی آب و اسید تولید می‌کند. جهت بررسی تجزیه گلوکز می‌توان از محیط Hugh & Leifson استفاده کرد. از طریق اکسیداسیون گلوکونات و تشکیل لعاب در این محیط، احیای نمک‌های تترازولیوم و ایجاد کلنی‌های قرمز، احیای سلنیت و دامیناسیون استامید، می‌توان سودوموناس آئروژینوزا را از سایر سودوموناس‌های فلورسنت تشخیص داد. این محیط حاوي 0/2 درصد پپتون و يك درصد قند (در انتروباكترياسه به نسبت 2/1) بوده که كاهش پپتون جهت تشكيل محصولات اكسيداسيون از اسيدهاي آمينه در نتيجه افزايش pH لازم است. کشت باکتری بر روی این محیط به شکل خطی و عمقی در دو لوله حاوی محیط کشت انجام می‌گیرد، سپس بر روی سطح یکی از لوله‌ها به مقدار 2- 1 سانتی‌متر پارافین مایع استریل اضافه می‌گردد تا رشد باکتری در شرایط بیهوازی قرار گیرد، در صورتی‌که لوله اولی در شرایط هوازی قرار دارد. چنانچه لوله کشت در شرایط هوازی زرد رنگ شد و لوله دومی بدون تغییر رنگ باقی ماند، باکتری هوازی بوده و گلوکز را اکسیده نموده است که از جمله خصوصیات سودوموناس‌ها است و اگر لوله فاقد پارافین به رنگ آبی تغییر رنگ داد و لوله دارای پارافین بدون تغییر باقی ماند، نشانه اکسیداسیون پروتئین‌ها بوده که از جمله صفات آلکالیژنز است. اگر هر دو لوله به رنگ زرد تغییر رنگ دادند نشان‌دهنده تخمیری بودن باکتری است (شکل 5).

شکل (5): نتایج تست OF

نکته: انجام آزمایش تخمیر در محیط OF نیاز به چهار روز وقت دارد.

جدول (2): خصوصیات و ویژگی‌های بیوشیمیایی سودوموناس‌ها و بورخولدرياها

سروتايپينگ:

آنتي‌ژن LPS در سودوموناس، مقاوم به حرارت، اختصاصي گروه بوده که بوسيلة تست آگلوتيناسيون بر اساس آنتي‌ژن نوع O سروتيپ مي‌گردد. 90% سوش‌ها داراي اين آنتي‌ژن هستند. بر اساس آنتي‌ژن H، 50% سوش‌ها داراي اين آنتي‌ژن هستند. این آنتی‌ژن‌ها با روش‌های ايمونوفلورسنس هم قابل اندازه‌گيري‌اند.

باكتريوسين تايپينگ:

بر اساس توليد پيوسين صورت مي‌گيرد و يك روش معمول و رايج است، حتي از روش سروتيپ كارآيي بيشتري دارد و براي كلني‌هاي موكوئيدي هم قابل اجرا است.

درمان:

درمان عفونت‌های ناشی از سودوموناس آئروژینوزا مشکل است، زیرا که این باکتری به‌طور معمول به داروهای متعددی مقاوم است و همچنین برخی از سویه‌ها سفالوسپورینازها را تولید می‌کنند که می‌توانند سفالوسپورین‌های نسل سوم را تجزیه کنند، لذا به درمان ترکیبی و یک عامل بتالاکتام ضد سودوموناسی نیاز است تا زمانی که میزان قابلیت‌های دارو تعیین شود. ارگانیسم‌های حساس ممکن است در طی درمان آنتی‌بیوتیکی با تولید آنزیم‌های خنثی‌کننده فعالیت آنتی‌بیوتیک و یا با انتقال پلاسمیدهای مقاومت از سویه‌های حساس و یا با موتاسیون در ژن کدکننده پورین‌های منافذ غشای خارجی مقاوم شوند. انتقال ایمونوگلوبولین و گرانولوسیت به‌منظور بهبود سیستم ایمنی می‌تواند در بیماران مبتلا به عفونت سودوموناسی و دارای نقص ایمنی مفید واقع شود. برای درمان معمولاً یکی از انواع پنی‌سیلین‌های فعال علیه سودوموناس نظیر تیکارسیلین یا پیپراسیلین همراه با یک آمینوگلیکوزید نظیر توبرامایسین تجویز می‌گردد. کینولون‌ها و کارباپنم‌ها دو نوع از آنتی‌بیوتیک‌های جدید با فعالیت ضد سودوموناسی هستند. سیپروفلوکساسین مثالی از یک کینولون با فعالیت خوب ضد سودوموناسی است.

در موارد سوختگی، کاربرد موضعی کرم سولفامایلون، کرم سیلور سولفادیازین و یا محلول شستشوی نیترات نقره پذیرفته‌شده‌ترین شکل درمان است. در بیماران سرطانی، درمان ایمونولوژیک در شکل گاماگلوبولین هیپرایمیون و ترانسفورماسیون گرانولوسیت با موفقیت همراه بوده است. سفتازیدیم در درمان اولیه عفونت‌های سودوموناس آئروژینوزا به‌کار می‌رود.

 آنتی‌بیوگرام:

به‌عنوان یک قانون کلی به‌دلیل اینکه این باکتری‌ها نسبت به اکثر آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم هستند بایستی آنتی‌بیوگرام برای همه سویه‌ها صورت بگیرد. همچنین بررسی الگوی مقاومت دارویی می‌تواند در تأیید تشخیص مؤثر باشد. سودوموناس آئرژینوزا بجز آمینوگلیکوزیدها، کربوکسی پنی‌سیلین‌ها و یوریدوپنی‌سیلین‌ها، سفتازیدیم، سفی‌پیم، کارباپنم‌ها، کینولون‌ها، کلیستین و پلی‌میکسین B به بیشتر داروها مقاومت دارند. البته برخی از انواع این باسیل که از خلط افراد مبتلا به فیبروزیس سیستیک جدا می‌شوند، حساسیت بیشتری داشته و به آمپی‌سیلین و نالیدیکسیک اسید حساس هستند. سودوموناس آئروژینوزا همیشه به سولفومتوکسازول– تری متوپریم و تتراسایکلین‌های وسیع‌الطیف مانند تایجی‌سیکلین، ارتاپنم و نیتروفورانتوئین مقاوم‌اند. مقاومت به چندین دارو در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا در حال افزایش است، به‌خصوص در بخش‌های مراقبت‌های ویژه و در میان بیماران دارای عفونت طولانی مدت سودوموناس نظیر سیستیک فیبروزیس و سایر سندروم‌های مزمن. هنگام مواجهه با ایزوله‌های مقاوم، از آزمایشگاه خواسته می‌شود که آنتی‌بیوتیک‌های بیشتری مانند کلیستین یا پلی‌میکسین B را تست کنند. اخیراً CLSI برای تست پلی‌میکسین B Break pontهایی را ارائه کرده است که می‌توان آن را برای پلی‌میکسین و یا کلیستین تفسیر نمود.

 کنترل و پیشگیری

کوشش برای ریشه‌کنی سودوموناس‌ها از بیمارستان‌ها بی‌فایده است. استفاده بی‌رویه آنتی‌بیوتیک‌ها نیز باید کنترل شود تا مانع از بین رفتن فلور نرمال و ایجاد سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک شود. پیشگیری مشکل است، اما با کنترل بهداشتی و دقیق هوادهنده‌ها و فیلترها در واحدهای احتراق، استریلیزاسیون تجهیزات تنفسی درمانی و سرانجام در برخی افراد حساس با واکسیناسیون امکان‌پذیر است. واکسن‌هایی که از فرآورده خالص‌شده‌تر به همراه اگزوتوکسین ضعیف‌شده یا توکسوئید A هستند، مقادیر بیشتری از آنتی‌بادی را برای مدت‌های طولانی‌تر تحریک می‌کنند. بقیه محققین واکسن‌هایی را تکمیل کرده‌اند که با استفاده از پروتئین F غشای خارجی، فلاژله و یا گلیکوکالیس سودوموناس بوده است. بعضی از محققین اعتقاد دارند که بجای واکسینه کردن بیماران به عفونت‌های سودوموناسی، بهتر است از ایمونیزاسیون غیرفعال استفاده شود.

در مورد باکتری سودوموناس آئروژینوزا مانند باکتری کزاز می‌توان سم آن را جدا و غیرفعال کرد تا از آن در درمان استفاده شود. واکسنی به این منظور ساخته شده است، بنابراین سم این باکتری را جدا و غیرفعال کرده و از خاصیت ایمنی‌زایی آن می‌توان بهره برد. سم ضعیف‌شده از اگزوتوکسین A از سوش‌های سم‌زای سودوموناس آئروژینوزا تهیه شد و ثابت شد که از این واکسن می‌توان در جلوگیری از مرگ افراد در شغل‌های پرخطری که دچار سوختگی می‌شوند، استفاده کرد.

با توجه به اینکه سودوموناس آئروژینوزا، آنتی‌ژن‌های سطحی و محصولات خارج سلولی فراوانی تولید می‌کند، امروزه کاندیداهای مختلفی در مورد واکسن‌های آن مطرح هستند:

1.LPS  کونژوگه‌شده با اگزوتوکسین A باکتری یا با توکسوئید تتانوس

2. آلژینات به همراه پلی‌ساکارید با وزن مولکولی بالا و اگزوتوکسین A
3. DNA واکسن‌ها (فلاژلین B، اگزوتوکسین A و OmpF)
4. افکتورهای تیپ III ترشحی مانند PcrV

بورخولدريا

گونه‌های بورخولدريا (قبلاً به آن سودوموناس می‌گفتند) باسیل‌های گرم منفی بدون اسپور و هوازی هستند و به استثنای بورخولدريا مالئي همگی متحرک هستند زیرا دارای فلاژل قطبی هستند. این ارگانیسم‌ها کاتالاز مثبت بوده و اکثر آنها اکسیدار مثبت‌اند. بر روی محیط مک کانگی آگار تولید کلنی‌های لاکتوز منفی می‌کنند. این باکتری‌ها در محیط، آب، خاک و بر روی گیاهان یافت می‌گردند. به دلیل تمایل آنها به محیط‌های مرطوب مانند سودوموناس‌ها در محیط بیمارستان یافت شده و به‌طور بالقوه عامل عفونت‌های اکتسابی از بیمارستان هستند. دو پاتوژن مهم انسانی در این جنس بورخولدريا سودومالئي و کمپلکس بورخولدريا سپاشیا هستند.

بورخولدريا (سودوموناس) سودومالئي

بورخولدريا (سودوموناس) سودومالئي یا باسیل ویت موریس يك باكتري آزادزي است كه در آب‌های گرم و خاك مرطوب جنوب شرقي آسيا يافت می‌شود. اين باكتري در مزارع برنج عامل بيماري بنام مليوئيدوزيس یا بیماری بمب ویتنام است. عفونت انساني با بورخولدريا سودومالئي معمولاً با ورود باكتري از طريق زخم‌ها، بریدگی‌ها يا خراش‌ها آغاز می‌شود، به‌هرحال در بعضي از موارد، آلودگی از طريق تنفس باكتري توسط فرد سالم يا در افراد بستري در بيمارستان از طریق وسايل برونكوسكوپي و كاتتر ادراري آلوده و يا كاركنان آزمايشگاه در حين كشت بورخولدريا سودومالئي آغاز می‌شود.

بورخولدريا سودومالئي در گروه rRNA II سودوموناسيه (گروه سودومالئي) قرار دارد. در بيشتر محیط‌های كشت استاندارد ميكروبيولوژي ايجاد كلني‌هاي فشرده (Wrinkled colonies) می‌کند. بورخولدريا سودومالئي رنگ را به‌صورت دوقطبی به خود گرفته و در زير ميكروســــــكوپ به شكل سنجاق‌قفلی (Safety pin) ديده می‌شود. باكتري اكسيداز مثبت است و نيترات را به نيتريت احيا می‌نماید. لیزین دکربوکسیلازمثبت و Dnase منفی و به پلی‌میکسین مقاوم است. در محیط تريپل شوگرآيرون آگار (TSI‌) بعد از 24 ساعت به‌صورت ايجاد اسيد در سطح و خنثي در ته لوله درمی‌آید ولي بعد از 72 ساعت ته لوله نيز به‌صورت اسيدي درمی‌آید (جدول 1). آنتي‌سرم‌ها نيز در تشخيص سويه‌هاي بورخولدريا سودومالئي استفاده می‌شوند.

بورخولدريا سپاشیا

این باکتری یک پاتوژن بیمارستانی است که با تجهیزات آلوده، داروها و ضدعفونی‌کننده‌ها مرتبط است و می‌تواند سبب باکتریمی، عفونت دستگاه ادراری، آرتریت عفونی و عفونت دستگاه تنفسی شود. یک پاتوژن مهم در بیماران سیستیک فیبروزیس و در بیماران مبتلا به گرانولوماتوز مزمن است. بیماران مبتلا به سیستیک فیبروزیس که به‌طور مزمن با این ارگانیسم آلوده هستند شانس کمی برای زنده ماندن دارند. کمپلکس بورخولدریا سپاشیا حداقل شامل 9 گونه است و همه گونه‌ها از بیماران سیستیک فیبروزیس جداسازی شده‌اند، با این حال در ایالات متحده آمریکا تقریباً 85 درصد سویه‌های بورخولدریا مولتی ورانس[3] و بورخولدریا سنوسپاشیا[4] هستند. بسیاری از مطالعات نشان داده‌اند که بورخولدریا سنوسپاشیا دارای فاکتورهای ویرولانس ذاتی است که منجر به افزایش میزان مرگ و میر در بیماران سیستیک فیبروزیس که با این باکتری آلوده شده‌اند در مقایسه با سایر سویه‌ها بورخولدریا می‌گردد.

گونه‌های بورخولدریا به‌خوبی بر روی محیط‌های استاندارد آزمایشگاهی شامل بلاد آگار و شکلات رشد می‌کنند. جداسازی ایزوله‌های بورخولدریا سپاشیا از نمونه‌های آلوده مثل خلط ممکن است از طریق استفاده از محیط‌های انتخابی مانند PC (بورخولدریا سپاشیا آگار انتخابی)، محیط OFLP (پلی‌میکسین B با پاسخ اکسیداتیو تخمیری، باسیتراسین لاکتوز آگار) و BCSA (بورخولدریا سپاشیا آگار انتخابی) تسهیل گردد. برای مشاهده کلنی‌های این باکتری‌ها 3 روز وقت لازم است. بورخولدریا سپاشیا اکسیداز مثبت و لیزین دکربوکسیلاز مثبت است و از گلوکز اسید تولید می‌کند. لازم به ذکر است که روش‌های بیوشیمیایی مناسبی برای افتراق میان کمپلکس بورخولدریا سپاشیا یا بین این کمپلکس و گونه‌های مرتبط نظیر بورخولدریا گلادیولی، رالستونیا، کوپریاویدوس و گونه‌های پاندورا وجود ندارد. روش‌های مولکولی اغلب جهت تأیید شناسایی نیاز است و هنگامی که شک به کمپلکس بورخولدریا سپاشیا وجود دارد، انجام این روش‌ها توصیه می‌شود. استفاده از MALDI-TOF نیز ممکن است در آینده منجر به شناسایی گونه‌های جدید گردد.

بورخولدریا سپاشیا به بسیاری از عوامل ضدمیکروبی بسیار مقاوم است، اما معمولاً به پیپراسیلین، سفتازیدیم، کلرامفینکل و تری‌متوپریم– سولفومتوکسازول حساس است. سویه‌های جداشده از بیماران سیستیک فیبروزیس که تحت درمان آنتی‌بیوتیکی متعدد قرار می‌گیرند احتمالاً مقاوم به این عوامل می‌گردند. CLSI تنها سفتازیدیم، مروپنم، مینوسیکلین و تری‌متوپریم– سولفومتوکسازول را برای بورخولدریا سپاشیا توصیه کرده است. همه ارگانیسم‌های بورخولدریا سپاشیا به‌صورت ذاتی به پلی‌میکسین‌ها (کلیستین) مقاوم هستند.

[1] Musty grape-like

[2] Ground glass

[3] B. multivorans

[4] B. cenocepacia

مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا

خانواده سودوموناداسه

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید