تکنولوژی تولید آنتیبادی مونوکلونال و کاربردهای بالینی آن
کاوه طاری1، آرزو رحیمی2.
- دانشجوی کارشناسی ارشد هماتولوژی و کارشناس علوم آزمایشگاه
- دانشجوی کارشناسی ارشد ایمونولوژی و کارشناس علوم آزمایشگاه
مقدمه
آنتی‌بادی‌های تولید شده توسط لنفوسیت‌های B به صورت پلی‌کلونال می‌باشد، در واقع لنفوسیت‌های B در بدن فرد دارای توزیع کلونال بوده و انواع مختلفی از لنفوسیت‌های B دارای گیرنده‌هایی هستند که اپی‌توپ‌های مختلف آنتی‌ژن را شناسایی کرده و علیه آن آنتیبادی می‌سازند. از آنجایی که آنتی‌ژن‌ها دارای اپی‌توپ‌های زیادی هستند از این رو هنگام ورود به بدن منجر به تکثیر کلون‌های مختلف لنفوسیت‌های B می‌شوند. اگر بتوان یک کلون از لنفوسیت B را جداسازی و آن را در محیط آزمایشگاه تکثیر کرد، می‌توان آنتی‌بادی‌های مونوکلونال را به دست آورد، اما این روش با مشکلات عدیده‌ای از جمله جدا کردن لنفوسیت‌های مربوط یه یک کلون و مشکلات در ارتباط با نگهداری سلول‌ها در محیط کشت همراه است، بنابراین با ایجاد شرایطی که بتوان سلول‌هایی ایجاد کرد که علاوه بر توانایی رشد و تکثیر نامحدود، توانایی تولید یک کلون خاص آنتیبادی را داشته باشد، می‌توان آنتیبادی مونوکلونال را تهیه کرد.
اولین بار در سال 1975 میلتشاین و کهلر سلول سرطانی حاصل از لنفوسیت B (میلومایی) را با لنفوسیت‌های B تولیدکننده آنتیبادی الحاق کردند که همانند سلول‌های میلومایی دارای توانایی رشد بوده و همانند لنفوسیت‌های B آنتیبادی با ویژگی موردنظر را می‌سازند.
مراحل مختلف تولید سلول‌های هیبرودومایی و تولید آنتیبادی مونوکلونال شامل ایمونیزاسیون، کشت سلولی، ادغام سلولی، غربالگری سلول‌های هیبرید مولد آنتیبادی، کلونینگ هیبریدومای مولد آنتیبادی، نگهداری درازمدت هیبریدوما، تولید انبوه آنتی‌بادی‌ها، تطبیق آنتی‌بادی‌های مونوکلونال و تعیین مشخصات آنتی‌بادی‌های مونوکلونال می‌باشد.
در ایمونیزاسیون ابتدا آنتی‌ژن موردنظر باید آماده گردد. برای آماده‌سازی آنتی‌ژن به این صورت عمل می‌شود که آنتی‌ژن ابتدا با ادجوانت همراه می‌گردد. ادجوانت‌ها می‌توانند موجب افزایش پاسخ ایمنی از طریق تحریک بیشتر سیستم ایمنی و افزایش نیمه‌عمر آنتی‌ژن و افزایش زمان پاسخ به آن از طریق آزادسازی تدریجی آنتی‌ژن شوند. دوز آنتی‌ژن تزریقی بر اساس سن، وزن و نژاد حیوان انتخاب می‌شود و معمولاً فواصل 2 تا 3 هفته به عنوان زمان تزریق در نظر گرفته می‌شود. معمولاً تزریق به صورت داخل صفاقی یا ترکیبی از داخل صفاقی و عضلانی می‌باشد.
در مرحله‌ی کشت سلول‌ها می‌توان از رده میلومایی SP210 استفاده کرد و لکوسیت را از طحال موش ایمونیزه شده در مرحله قبل در شرایط استریل خارج می‌کنیم و در مرحله‌ی بعد ادغام سلولی صورت می‌گیرد. برای این کار، سلول‌های میلومایی و لکوسیت‌های استخراج شده از طحال موش با نسبت 1 به 10 مخلوط شده و با محیط بدون سرم 3 بار شست و شو داده می‌شود، سپس PEG را به آن اضافه کرده و محیط کشت بدون سرم را اضافه نموده، سانتریفوژ کرده و محلول رویی را دور می‌ریزیم. اکنون باید غربالگری سلول‌های هیبرید تولیدکننده آنتیبادی اختصاصی صورت گیرد. برای این کار محیط کامل HAT اضافه می‌شود که آمینوپترین آن موجب مرگ سلول‌های میلومایی SP210 شده و سلول‌های طحالی الحاق نشده هم قدرت تکثیر در این محیط را نداشته و می‌میرند اما سلول‌های ادغام شده که قدرت رشد و تکثیر خود را از سلول‌های SP210 و قدرت بقا در محیط HAT را از سلول‌های طحالی گرفته‌اند زنده می‌مانند. در مرحله‌ی بعد و بعد از تیتراسیون آنتی‌بادی‌های اختصاصی تولیدی، کلونینگ هیبریدومای مولد آنتیبادی اختصاصی انجام می‌گیرد که سلول‌ها را در یک پلیت 96 چاهکی کشت سلول قرار می‌دهیم، بدین صورت که در سه ستون اول در هر چاهک 10 سلول در حجم 50 میکرولیتر، در چهار ستون بعد در هر چاهک 20 سلول در حجم 50 میکرولیتری و در 5 ستون آخر در هر چاهک یک سلول در همان حجم اضافه می‌گردد، سپس هر روز تمامی چاهک‌ها را از لحاظ نوع رشد سلول‌ها بررسی می‌کنیم و در صورتی که فقط یک مجموعه سلول رشد کرده باشد آن را یک کلون سلولی می‌نامند و سلول‌های آن چاهک را دوباره به روش فوق کلون می‌کنند. در نهایت سلول هیبریدوما جهت تولید آنتیبادی مونوکلونال در حفره صفاقی موش تزریق می‌گردد و آنتیبادی از مایع آسیت استخراج می‌شود، اما جهت تولید آنتیبادی در مقیاس بالا می‌توان از فرمنتورهای استاندارد آزمایشگاهی یا صنعتی استفاده کرد.
کاربردهای بالینی آنتیبادی مونوکلونال
آنتیبادی مونوکلونال که توسط کلون خاصی از لنفوسیت‌های B ساخته می‌شود امروزه در درمان و تشخیص بسیاری از بیماری‌ها و سرطان‌ها به کار می‌رود. استفاده از آنتی‌بادی‌های ضد فاکتور رشد اپیدرمال و آنتیبادی ضد فاکتور رشد اندوتلیال عروقی در درمان سرطان ریه، سینه و کلونورکتوم، استفاده از آنتی HER2 در درمان و کاهش عوارض سرطان سینه متاستاتیک، استفاده از آنتی APO-1 که منجر به آپوپتوز و یا بلوک رده‌ی سلولی لنفوسیت‌های بدخیم انسانی در لوسمی‌ها و لنفوم‌ها می‌شود، استفاده از آنتیبادی مونوکلونال علیه TNFα (CA2) در کاهش علائم آرتریت روماتوئید و بیماری کرون و در سندرم بهجت برای کاهش واسکولیت مغزی و کاهش عوارض هپاتیت الکلی شدید، استفاده از آنتی CD4 در درمان پسوریازیس و درمان لوسمی‌ها و لنفوم‌های خونی نظیر لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL)، لوسمی میلوسیتی مزمن (CML) در فاز بلاستیک و لوسمی میلوئیدی مزمن (AML) از جمله کاربردهای آنتی‌بادی‌های مونوکلونال می‌باشد. به علاوه در بیماری‌های خود ایمن و همچنین پیوند بافتی برای القای تولرانس استفاده می‌شود، مثلاً استفاده از آنتی CD3 برای کاهش رد آلوگرافت کلیوی. از مهم‌ترین اهداف آنتیبادی مونوکلونال رسپتورهای فاکتور رشد سلولی، رسپتورها و یا مدیاتورهای آنژیوژن مشتق شده از تومور و خود شاخص‌های سطح سلول می‌باشد و مکانیسم‌های عمل آنها بلوک پرولیفراسیون سلولی، القای آپوپتوز سلولی، رقابت با لیگاند رسپتوری، لیز سلولی به واسطه ADCC، فعال‌سازی کمپلمان برای تخریب سلول و اپسونیزاسیون سلولی می‌باشد.
1- لنفوم‌های غیرهوچکینی سلول‌های B
آنتی‌بادی‌های مونوکلونال از الحاق سلول‌های میلومایی و لنفوسیت‌های B نرمال حاصل می‌شوند و می‌توانند علیه یک شاخص خاص سلولی عمل کنند. این مزیت آنتی‌بادی‌های مونوکلونال آنها را در تشخیص و درمان انواع مختلف سرطان‌ها، لوسمی‌ها و لنفوم‌ها، بیماری‌های آلرژیک و خودایمن و دیابت توانا کرده است. یکی از مهم‌ترین کاربردهای آن در درمان بیماری‌های لنفوپرولیفراتیو غیرهوچکینی سلول B می‌باشد. سلول‌های B نرمال و تقریباً تمام سلول‌های B لنفومایی CD20 را بر سطح خود بیان می‌کنند، از این رو استفاده از آنتیبادی مونوکلونال علیه آن می‌تواند در درمان این اختلالات مفید باشد. مهم‌ترین آنتیبادی در دسترس برای درمان این بیماری‌ها، آنتیبادی مونوکلونال کایمریسم ضد CD20 (IDEC-C2B8) می‌باشد که شامل قسمت ثابت IgG-k و قسمت متغیر آنتیبادی ضد CD20 در موش می‌باشد. مطالعات نشان داده است که استفاده از این آنتیبادی می‌تواند موجب لیز سلول‌های +CD20 توسط کمپلمان یا سیتوتوکسیسیته سلولی وابسته به آنتیبادی (ADCC) و القای آپوپتوز شود و در مطالعات درمان افراد مبتلا به DLCL، MCL و FL نشان داده شده است که در تحقیقات مختلف میزان بهبودی کامل و بهبودی اولیه بسته به سن، جنس، درجه هیستولوژیکی و درمان‌های قبلی، در افراد مختلف با هم متفاوت می‌باشد و به طور میانگین به ترتیب 37%، 33% و 48% می‌باشد. استفاده از این آنتی‌بادی‌ها دارای عوارضی نیز می‌باشد که از آن جمله عوارض می‌توان به تب و لرز، سردرد، ضعف، افت فشار خون،تهوع، استفراغ، دیس‌پنی، پان‌سایتوپنی، درد قفسه سینه، راش‌های پوستی، کهیر و عرق شبانه اشاره کرد.
2- آرتریت روماتوئید
آرتریت روماتوئید یک بیماری التهابی مزمن بوده که حدود 1-0/5 درصد از بالغین را درگیر می‌کند و با التهاب مزمن مفاصل، التهاب سیستماتیک و اختلالات ایمونولوژیکی همراه است. فرم فعال و کنترل نشده‌ی آن باعث آسیب به مفاصل، کاهش کیفیت زندگی، ناتوانی و اختلالات قلبی-عروقی می‌گردد. لنفوسیت‌ها و سلول‌های التهابی و محصولات آنها نظیر سایتوکاین‌ها شامل TNF-α، IL1، IL6، IL7، IL15، IL17A، IL18 و IL21 در ایجاد این بیماری نقش دارند، بنابراین استفاده از آنتیبادی علیه آنها می‌تواند در کاهش عوارض بیماری و بهبود بیماری مفید باشد. مهم‌ترین سایتوکاینی که می‌تواند به عنوان هدف درمانی مدنظر قرار گیرد TNF-α می‌باشد. مهم‌ترین آنتیبادی مونوکلونال علیه آن، Infliximab (IFX) می‌باشد که کارآزمایی بالینی آن جهت درمان آرتریت روماتوئید با کارایی بالا اثبات شده است. این آنتیبادی می‌تواند موجب کاهش عوارض مفاصلی بیماری و کاهش التهاب مفاصل گردد. از دیگر آنتی‌بادی‌هایی که می‌تواند در درمان آرتریت روماتوئید استفاده شود آنتیبادی مونوکلونال علیه رسپتور IL6 می‌باشد که Tocilizumab نام دارد و در مرحله‌ی کارآزمایی بالینی می‌باشد.
3- بیماری لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE)
SLE یک بیماری اتوایمیون بوده که با تولید تعداد زیادی آنتیبادی علیه آنتی‌ژن‌های خودی مشخص می‌گردد. عوامل ایمنی نظیر لنفوسیت‌های B، لنفوسیت‌های T، سلول‌های دندرتیک، اینترفرون آلفا و همچنین فاکتورهای محیطی و ژنتیکی در پاتوژنز بیماری دخیل هستند. مطالعات نشان داده است که لنفوسیت‌های B نقش اصلی و مرکزی را در پاتوژنز این بیماری بازی می‌کنند، از این رو استفاده از آنتیبادی علیه لنفوسیت‌های B و مارکرهای سطحی آن می‌تواند در کاهش عوارض و شدت این بیماری نقش داشته باشد. Rituximabیک آنتیبادی IgG1 مونوکلونال موشی/انسانی بوده که کارایی آن در درمان لنفوما اثبات شده است. این آنتیبادی از طریق سایتوتوکسیسیته سلولی با واسطه آنتیبادی (ADCC)، سیتوتوکسیسیته با واسطه کمپلمان و پیام‌رسانی مستقیم منتج به آپوپتوز موجب لیز سلول‌های B CD20 مثبت می‌شود. مطالعات نشان داده است که افراد مبتلا به SLE که ریتوکسیماب دریافت کرده‌اند در آنها نفریت لوپوسی، التهاب مفاصل، واسکولیت‌های جلدی، راش‌ها و علایم عصبی بهبود می‌یابد. همچنین موجب کاهش نیاز به درمان با IVIG می‌گردد.
از دیگر آنتیبادی مونوکلونال می‌توان به آنتی CD22 یا Epratuzumab اشاره کرد که در فاز دوم کارآزمایی بالینی برای SLE می‌باشد و موجب کاهش 45-35 درصدی لنفوسیت‌های B می‌گردد.
4- استفاده از آنتیبادی مونوکلونال در درمان سرطان سینه
سرطان یکی از بیماری‌هایی است که با رشد غیرطبیعی سلول‌ها و نیز پتانسیل گسترش آن از یک نقطه از بدن به نقاط دیگر همراه است. یکی از انواع این سرطان‌ها سرطان سینه بوده که طبق آمار جهانی طی سال‌های 2011-2007 میزان ابتلا به آن 124/6 در هر یکصد هزار نفر در سال و آمار مرگ‌ومیر ناشی از آن 2/22 نفر در هر یکصد هزار نفر در سال است و در سال 2011 حدود 2899726 نفر در آمریکا به این سرطان مبتلا شده‌اند. روش‌های درمانی سرطان سینه مختلف بوده و از جمله آنها می‌توان به جراحی، شیمی درمانی، رادیوتراپی، هورمون‌تراپی، پیوند سلول‌های بنیادی و استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال اشاره کرد.
یکی از مواردی که در بروز سرطان سینه نقش مهمی دارد، اعضای خانواده گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (HER) می‌باشند. این خانواده شامل چهار عضو به نام‌های: EGFR ,HER-1 ,ErbB1/HER-2 ,ErbB2/ HER-3, ErbB3/ HER-4 ,ErbB4 بوده که HER-1 ,HER-2 و HER-4 تیروزین کیناز هستند. در حالی که HER-3 با وجود داشتن دومین کینازی، غیرفعال بوده و پیام‌رسانی آن از طریق PI-3 کیناز انجام می‌گردد. اعضای این خانواده جدا از نقشی که در رشد و تمایز سلولی در حالت طبیعی دارند، زمانی که میزان بیان آنها بالا رود و یا در ساختمان آنها جهش رخ دهد، نقش مهمی در بروز سرطان بخصوص سرطان سینه ایفا می‌کنند؛ مثلاً میزان بیان HER-2 در 30-20% زنان مبتلا به سرطان سینه افزایش می‌یابد. امروزه از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال علیه اعضای این خانواده در درمان سرطان سینه استفاده می‌گردد. از جمله مهم‌ترین آنتی‌بادی‌های مونوکلونال آنتیبادی ضد HER-2 (Trastuzumab, Herceptin) و HER-1(Cetuximab) است.
Trastuzumab امروزه به عنوان داروی خط اول درمانی و در فاز چهارم کارآزمایی بالینی مورد استفاده قرار می‌گیرد. مکانیسم عمل این آنتیبادی مونوکلونال، جذب سلول‌های ایمنی به خصوص NK cellها به جایگاهی است که فزونی بیان HER-2 در آنجا وجود دارد که در آنجا شاهد بروز ADCC هستیم. مکانیسم دیگر آن مهار MAPK و مسیر PI3K/Akt بوده که منجر به افزایش توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و القای پروتئین P27و در نتیجه مهار رشد و تکثیر سلولی می‌شود. مکانیسم‌های احتمالی دیگر Trastuzumab شامل کاهش بیان پروتئین HER-2، ممانعت از تشکیل هترودایمر حاوی HER-2، جلوگیری از شکست HER-2 و مهار آنژیوژنز است. عوارض جانبی دارو به صورت زیر است:
در 40% از بیمارانی که از این دارو استفاده می‌کنند، علائمی شبیه به آنفلوانزا همانند: تب، لرز، تهوع و درد اسکلتی مشاهده می‌گردد که این عوارض معمولاً در بار اول تزریق و یا هفته اول مشاهده می‌گردد. در 5 الی 30 درصد از موارد، عوارض قلبی و کاهش کارایی برون‌ده قلبی نیز مشاهده می‌گردد. علاوه بر این در موارد بسیار نادری، این دارو دو عارضه تنفسی نیز می‌تواند بر جای گذارد که اولی تقریباً مشابه یک آلرژی تنفسی بوده و عوارضی همچون تنگ شدن مجاری هوایی و اختلالات تنفسی دارد و عارضه دوم سمیت ریوی نامیده می‌شود که منجر به تورم بافت ریه، کاهش فشار خون و تجمع مایع ریوی در اطراف ریه‌ها (افیوژن ریوی) می‌گردد.
متدهای کونژوگاسیون آنتی‌بادی‌ها و مصارف درمانی آنتی‌بادی‌های کونژوگه شده
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام