آسپرجیلوس
بخش ششم
دکتر محمد قهری
آزمایش اسید نوکلئیک آسپرجیلوسی به‌وسیله‌ی روش PCR
محدودیت‌های مربوط به آزمایش آنتی‌بادی و مشکلات حساسیت مرتبط با سنجش آنتی‌ژن، انگیزه‌ای شد تا از روش PCR برای تشخیص آسپرجیلوزیس مهاجم کمک گرفته شود. به نظر می‌رسد که فواید اصلی PCR این باشد که مقادیر پائین مواد ژنتیکی را می‌تواند سنجش کند و حضور احتمالی آسپرجیلوزیس تهاجمی را مشخص نماید. تکنیک‌های متعدد PCR برای شناسایی گونه‌ها به‌صورت انفرادی و یا روش‌های عمومی باواسطه‌ی پرایمر برای شناسایی قارچ‌های رشته‌ای به‌طور کلی ایجاد شده است. نمونه‌های کلینیکی مختلفی به‌وسیله‌ی این روش‌ها آنالیز شده‌اند که شامل خلط، خون کامل و مایع BAL می‌باشند. گزارش‌های اولیه روش‌هایی را شرح می‌دهند که در آن ژن 18 کیلو دالتونی ریبونوکلئوپروتئین آسپرجیلوس فومیگاتوس آمپلیفیه شده است. بعد از آن، PCR بر پایه‌ی توالی‌های محافظت‌شده‌ی اونیورسال در DNA ریبوزومال قارچی (شامل آسپرجیلوس فومیگاتوس) شرح داده شده است. پرایمرهای مربوط به توالی‌های ژن‌های زیرواحد بزرگ DNA ریبوزومال که به‌صورت اونیورسالی محافظت شده است درون سلسله‌ی قارچ‌ها قادر به آمپلیفیه کردن اسید دزوکسی ریبونوکلئیک از 43 استرین که نماینده‌ی 20 گونه از قارچ‌های مهمِ پزشکی است، می‌باشند. به‌وسیله‌ی آنالیز توالی محصولات آسپرجیلوس فومیگاتوس، پرایمرهای اختصاصی طراحی شده است که فقط اسید دزوکسی ریبونوکلئیک همولوگ را تکثیر بنماید. به کمک این راهکار، آسپرجیلوس فومیگاتوس را می‌توان در عرض مدت 8 ساعت مورد شناسایی قرار داد. حساسیت روش PCR مسئله‌ی مهمی است. حد پائینی سنجش که برای آسپرجیلوس فومیگاتوس اعلام شده با 10 تا 100 اسپور در نمونه مطابقت دارد و البته به همین اندازه در مورد نتایج مثبت کاذب سؤال مطرح است. این مشکل در آزمایش PCR نمونه‌های BAL برجسته‌تر است. در اینجا یک کنترل داخلی و رقابتی در PCR که برای سنجش اسیددزوکسی ریبونوکلئیک گونه‌های آسپرجیلوس در نمونه‌های BAL طراحی شده، شرکت داده شده است. برای این منظور یک قطعه‌ی DNA میتوکندریال 1 کیلو بازی آسپرجیلوس فومیگاتوس تعیین توالی شده است، پرایمرهائی برای آمپلیفیکاسیون اسیددزوکسی ریبونوکلئیک آسپرجیلوس فومیگاتوس، آسپرجیلوس فلاووس، آسپرجیلوس ترئوس و آسپرجیلوس نیجر مورد استفاده قرار گرفته‌اند، اما DNA مربوط به سایر قارچ‌ها (کپک‌ها) و مخمرها خیر.
نمونه‌های BAL از 55 بیمار مورد آزمایش و بررسی قرار گرفته‌اند. از 28 بیمار با اختلالات دستگاه ایمنی (ایمیونوکامپرومایزد)، 6 نفر از آنها PCR مثبت بودند، 3 نفر به علت آسپرجیلوزیس تهاجمی ریوی فوت کردند و از کشت‌های مایع BAL آنها آسپرجیلوس فومیگاتوس به دست آمد و 3 نفر کشت منفی داشتند و آسپرجیلوزیس تهاجمی ریوی در آنها وجود نداشت. از 15 بیمار HIV مثبت و 9 بیمار با ایمنی شایسته به ترتیب 5 و 4 نفرشان PCR مثبت و کشت منفی بودند و هیچ‌کدام آسپرجیلوزیس نداشتند؛ بنابراین در این ارزیابی، روش PCR آسپرجیلوزیس تهاجمی ریوی را در 3 بیمار تأئید کرد، اما نتایج مثبت برای 25% (12 از 49) از بیمارانی که شواهدی از آسپرجیلوزیس را نداشتند، ارائه داد.
Bretagne و همکارانش نتیجه‌گیری کردند که ارزش پیشگوئی نتایج مثبت PCR برای بیماران در معرض خطر آسپرجیلوزیس پائین است و از آنجا که خطر آلودگی بافرهای واکنش یا نمونه‌های بیولوژیکی با کونیدی آسپرجیلوس بالا است، بنابراین، اینکه پتانسیل سودمندی تشخیصی PCR درک شود مسئله‌ی مهمی است.
به‌تازگی نتایج امیدوارکننده در انجام آزمایش PCR بر روی نمونه‌های سرم و پلاسما به دست آمده است. راهکار دیگر تشخیص ملکولی آسپرجیلوزیس تهاجمی از پرایمرهای اونیورسال مشترک برای تمام قارچ‌ها در ترکیب با پلی‌مرفیسم طولی قطعه‌ی محدودشده، هیبریداسیون قطعه‌ی DNA آمپلیفیه شده با یک پروب اختصاصی یا پلی‌مرفیسم کنفورماسیون تک‌رشته‌ای (single-stranded conformational polymorphism) استفاده می‌کند. این روش‌ها اجازه می‌دهند که طیف وسیعی از قارچ‌های فرصت‌طلب مهم در نمونه‌های کلینیکی تا سطح گونه مورد سنجش و شناسایی قرار گیرند و ممکن است برای تشخیص ملکولی سریع میکوزهای مهاجم شامل آسپرجیلوزیس تهاجمی مورد استفاده واقع شوند. هرچند که نمونه‌های کلینیکال از تنها تعداد محدودی از بیماران مورد ارزیابی قرار گرفته‌اند و بنابراین ارزش تشخیصی PCR باید در مطالعات بیشتری ثابت شود.
استفاده از تکنولوژی PCR بر روی نمونه‌های سرم یا خون کامل در حال پیگیری است، استفاده از نمونه‌ی سرم یا خون کامل نسبت به استفاده از نمونه‌های BAL دارای چندین مزیت است؛ نخست، کار کردن مناسب با نمونه سرم یا خون است و نتایج مثبت کاذب از طریق آلودگی محیطی به دست نمی‌آید. دوم اینکه تهیه‌ی نمونه‌ی خون به‌طور قابل‌توجهی آسان‌تر از به دست آوردن مایع BAL است. سوم اینکه نمونه‌گیری را می‌توان تکرار کرد، بنابراین PCR را همراه با الایزا می‌توان انجام داد. استفاده‌ی ترکیبی از این دو روش (PCR و الایزا) باید یک تشخیص قطعی از آسپرجیلوزیس تهاجمی را- حتی در غیاب علائم آشکار کلینیکی- فراهم کند. در نهایت، از آنجا که ارگانیسم معمولاً از کشت خون حتی در مراحل نهائی بیماری به دست نمی‌آید، داده‌های PCR موجب یک سؤال قابل توجه در مورد منشأ اسیددزوکسی ریبونوکلئیک آسپرجیلوس فومیگاتوس می‌گردد.
دستگاه زایشی آسپرجیلوس فومیگاتوس
جنبه‌های هیستولوژیک
یک مشخصه‌ی بسیار مهم در هیستولوژی آسپرجیلوزیس تهاجمی، تمایل چشمگیر هایفی قارچی به تهاجم به شریان‌ها و وریدهای بزرگ و کوچک است که موجب التهاب و ترومبوز و انفارکتوس می‌شود. طیفی از تظاهرات کلینیکی و نشانه‌های بدعملکردی عضوی منعکس‌کننده‌ی این رفتار آنژیوتروپیک گونه‌های آسپرجیلوس است. هایفی‌های آسپرجیلوس را می‌توان در عروق ترومبوزه و بافت‌های نکروتیک مشاهده کرد. هایفی‌های آسپرجیلوس معمولاً با انشعابات دوشاخه‌ای در حدود 45 درجه‌ای و دیواره‌های عرضی منظم داخل سلول‌های آن و پیشرفت و پیشروی (رشد) آنها در یک جهت، مشخص می‌شود.
هایفی‌های آسپرجیلوس به کمک هماتوکسیلن- ائوزین ضعیف رنگ می‌گیرند و به‌وسیله‌ی گوموری متنامین سیلور (GMS) بهتر و پررنگ‌تر می‌شوند. مقاطع بافتی منجمدشده (frozen section) بیوپسی یا مواد به دست آمده از کالبدشکافی را می‌توان با کالکوفلور سفید نیز (یک سفیدکننده‌ی فلئورسنت) رنگ‌آمیزی نمود که هایفی‌های آسپرجیلوس را درخشان‌تر می‌کند. مخلوطی از سلول‌های التهابی بسته به وضعیت ایمنی بیمار نیز دیده می‌شود.
رشد همسوی هایفی‌ها در آسپرجیلوزیس تهاجمی
هایفی‌های دارای دیواره‌های عرضی منظم و انشعابات دوشاخه‌ای (آسپرجیلوزیس تهاجمی)
انشعابات دوشاخه‌ای (هایفی دیکوتوموس)
بلوکاژ رگ خونی توسط هایفی‌های آسپرجیلوس
مارکرهای پیش‌آگهی در آسپرجیلوزیس
در فرم‌های آلرژیک آسپرجیلوزیس، تیترهای آنتی‌بادی ممکن است تا حدودی دارای ارزش پروگنوستیک باشند. تیتر پرسیپیتین‌ها ممکن است با درمان موفقیت‌آمیز توسط کورتیکوستروئیدها کاهش یابند. سطوح IgE مفیدترین پارامتر برای پیگیری در درمان بیماران مبتلا به آسپرجیلوزیس برونکوپولمونری آلرژیک (ABPA) است. مقدار توتال IgE اغلب قبل از عود بالینی بیماری افزایش می‌یابد و طول مدت درمان ممکن است بر اساس افت سطح IgE پایه‌گذاری شود. آزمایش‌ها برای پرسیپیتاسیون‌های آسپرجیلوس اغلب در تشخیص فرم‌های مختلف آسپرجیلوزیس در افرادی که سیستم ایمنی آنها دچار اختلال نشده است، مفید هستند. پرسیپیتاسیون‌ها را می‌توان در 70 درصد بیماران مبتلا به آسپرجیلوزیس آلرژیک و در بیش از 90 درصد بیماران مبتلا به آسپرجیلوما نشان داد. تست پرسیپیتاسیون همچنین برای تشخیص آسپرجیلوزیس مزمن نکروزدهنده‌ی ریه و سایر فرم‌های مهاجم عفونت آسپرجیلوس مثل اندوکاردیت در بیمارانی که ایمیونوکامپرومایزد نیستند، مفید است. نشان دادن پرسیپیتاسیون‌ها در یک بیمار نوتروپنیک با تب (که به آنتی‌بیوتیک پاسخ نمی‌دهد) یا یک ارتشاح ریوی اغلب برای شروع درمان کافی است اما باید تأکید کرد که نتیجه‌ی تست مثبت عفونت را ثابت نمی‌کند و نتیجه‌ی منفی تست پرسیپیتین مانع از تشخیص آسپرجیلوزیس در بیمار ایمیونوکامپرومایزد نمی‌شود، زیرا چنین افرادی اغلب قادر به پاسخ سرولوژیک قابل سنجش نیستند.
آزمایش‌های شناسایی آنتی‌ژن‌های در گردش آسپرجیلوسی در خون و ادرار به عنوان یک جانشین تشخیص آسپرجیلوزیس در بیماران ایمیونوکامپرومایزد پیشنهاد می‌شود. تیترهای تغییریافته‌ی گالاکتومانان ممکن است پیامد درمان را پیشگوئی کند یا نشان‌دهنده‌ی پیشرفت بیماری باشد. اگرچه گالاکتومانان آسپرجیلوسی به‌سرعت از جریان خون پاک می‌شود و برای سنجش مطلوب آنتی‌ژن به نمونه‌گیری مکرر نیاز دارد.
سطوح آنتی‌ژنمی (antigenemia) و آنتی‌ژنوری (antigenuria) ممکن است با دوره‌ی کلینیکال آسپرجیلوزیس تهاجمی همبستگی داشته باشد. داده‌ها در مطالعات حیوانی و برخی از سری‌های بیماران مطرح می‌کنند که سطوح آنتی‌ژن به موازات بدتر شدن وضعیت، افزایش می‌یابند. همچنین، برخی مطالعات نشان داده است که درمان مؤثر ضد قارچی، سطوح آنتی‌ژن را کاهش می‌دهد، اگرچه این مسئله در تمام مطالعات تأیید نشده است.
منبع:
1 – CLINICAL MYCOLOGY, E. J. Anaissie, Michael R. McGinnis, Michael A. Pfaller. CHURCHILL LIVINGSTONE, 2009
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام