دانستنی‌های اساسی درباره آزمایش‌های کووید-19

توضیح مترجم:

آنچه در پی می‌آید ترجمه نوشته‌ای است در دو بخش که در اواخر فروردین ماه جاری در ارتباط با آزمایش‌های کووید-19 توسط آقای دکتر وین دیمک (Wayne Dimech) نوشته و در وبسایت وستگارد منتشر شده است. دکتر دیمک مدیر اجرایی، علمی و ارتباطات تجاری آزمایشگاه مرجع ملی استرالیا (NRL) است. NRL یکی از آزمایشگاه‌های تخصصی ارزشیابی کیت‌های بیماری‌های عفونی است و در این راستا با WHO همکاری می‌کند. ترجمه این مطلب به منظور تقدیم به آزمایشگاهیان ایران با استقبال گرم نویسنده روبرو شد؛ امری که موجب کمال تشکر بنده از ایشان و مؤسسه NRL است.

همچنین مراتب قدردانی و سپاس خود را به همکار و دوست گرانقدر جناب آقای دکتر صابونی که با دقت و به زیبایی این ترجمه را ویرایش نموده و توضیحات مفیدی به صورت درون قلاب به متن افزودند و نیز جناب آقای دکتر محمدرضا عابدی سردبیر محترم و کارکنان سختکوش نشریه ارزشمند اخبار آزمایشگاهی که انتشار این نوشته را متقبل شدند، تقدیم می‌کنم.

حسن بیات؛ دانش‌آموخته علوم آزمایشگاهی

بخش اول: آزمایش کردن برای کووید-19

“آزمایش کنید، آزمایش کنید، آزمایش کنید”. این توصیه تئودور آدهانوم گیبرسوس مدیر کل سازمان بهداشت جهانی (WHO) است. طی ماه‌های گذشته، رسانه‌های خبری پر از گزارش‌های تحسین‌آمیز درباره تولید آزمایش‌های جدید برای کووید-19 بوده‌اند (آزمایش‌های 5 دقیقه‌ای؛ فقط نیاز به یک قطره خون؛ برگزاری مراسم عکاسی از مدیران اجرایی شرکت‌های سازنده کیت‌ها در رز گاردن). آزمون‌های آزمایشگاهی در خط مقدم پاسخ جهانی به پاندمی کووید-19 قرار گرفته‌اند. در این شرایط بی‌سابقه، درک نقش آزمایش‌ بسیار مهم است و بسیار حیاتی است که فکر نکنیم در مراحل اولیه‌ی یک عفونت جدید و در حال ظهور، آزمایش‌ها همواره درست هستند.

نخست، یک معرفی کوتاه. من از اوایل دهه 1980 متخصص میکروبیولوژی پزشکی بوده‌ام و طی دو دهه گذشته در آزمایشگاه سرولوژی مرجع ملی استرالیا (NRL)، یک مرکز غیر انتفاعی و همکار WHO، کار کرده‌ام. این آزمایشگاه در ملبورن استرالیا قرار دارد و مأموریت آن ارتقای کیفیت آزمایش‌های بیماری‌های عفونی در سطح جهان است. NRL با WHO، مرکز مراقبت و پیشگیری از بیماری‌های امریکا (CDC)، و سازمان‌های غیردولتی (NGO) نظیر بنیاد Merieux (لیون، فرانسه) و FIND (ژنو، سوئیس) فعالانه همکاری می‌کند. ما بر آزمایشگاه‌های بیماری‌های عفونی استرالیا که توسط دولت استرالیا برپا شده‌اند نظارت می‌کنیم و همکاری تنگاتنگی با اغلب شرکت‌های تولیدکننده وسایل تشخیصی آزمایشگاه پزشکی (IVDs) داریم و در این راستا طراحی و اجرای برنامه‌های ارزیابی کیت‌های آزمایشگاهی را از طرف این شرکت‌ها انجام می‌دهیم. NRL یکی از معدود آزمایشگاه‌های دارای مجوز در سطح جهان است که به نیابت از «برنامه پیش‌ارزیابی WHO[1]» کیت‌های آزمایشگاهی را ارزشیابی می‌کنند. شناختن عملکرد کیت‌ها و مراقبت از عملکرد آن‌ها [در سطح مصرف] فعالیت روزمره ماست.

مهم است اندکی درباره‌ آزمایش‌های کووید-19 بدانیم تا بتوانیم تأثیری را که این فوریت بر کیفیت آزمایش کردن گذاشته است، درک کنیم. من برای کسانی که ارتباط نزدیکی با آزمایش و آزمایشگاه‌ ندارند، جوانب مختلف آزمایش‌های کووید-19 را توضیح خواهم داد. در شروع عفونت، حدود 5 تا 14 روز پیش از ظهور علائم بیماری، ویروس در سلول‌های پشت بینی و حلق رشد می‌کند. می‌توان از بینی یا حلق یک سوآب گرفت و اسید نوکلئیک ویروس را شناسایی کرد. از چند روز پیش از ظهور علائم و تا هشت روز پس از علائم، ویروس قابل شناسایی است [برخی مطالعات نشان داده‌اند که ویروس تا 28 روز پس از ظهور علائم قابل شناسایی است. مترجم]. البته، این دوره بستگی به حساسیت آزمایش اسید نوکلئیک (NAT)، کیفیت نمونه‌گیری و مقدار ویروس در زمان نمونه‌گیری دارد. [معمولاً] هنگامی که پاسخ آنتی‌بادی شروع می‌شود، ویروس از بدن پاکسازی می‌شود. هنگامی که ویروس دیگر در بینی/ حلق وجود نداشته باشد، آزمایش اسید نوکلئیک (NAT) منفی خواهد شد. در پاسخ اولیه به این پاندمی، آزمایشگاه‌هایی که یکی از چندین روش توصیف‌شده توسط WHO را به‌کار می‌بردند، نظیر مؤسسه ویروس‌شناسیCharité آلمان، دانشگاه هنگ‌کنگ (HKU) و CDC امریکا، پروتوکل‌های NAT را تدوین کردند. سایر آزمایشگاه‌ها که روش‌های طراحی‌شده توسط خودشان را به‌کار می‌برند از پروتوکل‌های مختلفی استفاده می‌کنند.

NAT می‌تواند قسمت‌های مختلفی از اسید نوکلئیک ویروس را هدف قرار دهد که این کار می‌تواند بر عملکرد این آزمایش‌ها، به‌ ویژه در مورد واکنش متقاطع با سایر ویروس‌های مشابه، تأثیر بگذارد. اگر یک آزمایش ویژگی (اختصاصیت) کمتری داشته باشد، ممکن است میزان نتایج مثبت کاذب آن زیاد باشد. اگر یک روش برای شناسایی بخش ثابتی از سکانس ویروسی طراحی نشده باشد و آن بخش [که ثابت نیست] تغییر کند، آن روش ممکن است برخی مثبت‌های واقعی را شناسایی نکند. راه‌اندازی NATهایی که توسط آزمایشگاه‌ها طراحی شده‌ بود، دسترسی به آزمایشی را که بیش از هر چیز دیگری موردنیاز بود، ممکن ساخت. متأسفانه، آزمایش CDC با مشکلات اولیه‌ای مواجه شد که باعث تأخیر در جوابدهی و برجسته شدن این واقعیت شد که حتا در بهترین آزمایشگاه‌ها نیز ممکن است کارها اشتباه از آب دربیاید. این آزمایش‌های دست‌ساز یا “خانه‌پرورده” یا “خانگی” باید در آزمایشگاه‌های دارای تجهیزات ویژه و دانشمندان و تکنسین‌های متبحر استفاده شود. به تازگی سازندگان IVD توانسته‌اند NATهایی را طراحی کنند که می‌توان تحت فرآیندهای سختگیرانه تولید، آن‌ها را در مقیاس وسیع تولید و تأمین کرد. این کار به ما فرصت داده است تا با دخیل کردن تعداد بیشتری آزمایشگاه‌ و با بهره‌گیری از بستر دستگاه‌های خودکار، آزمایش‌ها را به‌سرعت افزایش دهیم.

به طور کلی در عفونت‌های ویروسی، حدوداً هنگامی که علائم بروز می‌کند، در نتیجه یک سلسلسه واکنش‌های پیچیده شیمیایی، گلبول‌های سفید ساختن آنتی‌بادی بر علیه بخش‌هایی از ویروس را آغاز می‌کنند. در ابتدا این آنتی‌بادی‌ها نسبتاً غیراختصاصی هستند و با بخش‌های معینی از ویروس‌ که آنتی‌ژن نامیده می‌شود واکنش می‌دهند، ولی ممکن است با سایر آنتی‌ژن‌های دارای ساختار مشابه که غیر کووید-19 هستند نیز واکنش متقاطع بدهند. به مرور زمان، پاسخ آنتی‌بادی بالغ می‌شود و اختصاصی‌تر و هدفمندتر علیه آنتی‌ژن‌های ویروسی کووید-19 عمل می‌کند. البته هنوز این احتمال هست که این آنتی‌بادی‌ها با آنتی‌ژن‌های ویروس‌هایی از همان خانواده (غیر از کووید-19) واکنش متقاطع بدهند. چند نوع آنتی‌بادی مختلف به نام IgM و IgG وجود دارد؛ آنتی‌بادی‌های IgM معمولاً اولین آنتی‌بادی‌های قابل شناسایی هستند، اما گذرا بوده و پس از چند هفته غیر قابل شناسایی می‌شوند. IgG حدوداً هنگام برطرف شدن علائم تولید می‌شود و تا مدتی به افزایش ادامه می‌دهد. معمولاً IgG در گردش خون فرد قابل شناسایی باقی می‌ماند. IgA نوع دیگری از آنتی‌بادی است که توسط غشای مخاطی در بینی و حلق ترشح می‌شود، اما در خون نیز یافت می‌شود. از آزمایش‌ آنتی‌بادی‌ها (آزمایش‌های سرولوژی) می‌توان برای پی بردن به مواجهه فرد با یک عفونت خاص استفاده کرد. این آزمایش‌ها ابزار مهمی هستند برای تعیین اینکه چند درصد افراد دارای آنتی‌بادی‌های IgG هستند و بنابراین [احتمالا] ایمن در نظر گرفته می‌شوند و به‌طور بالقوه می‌توان به ایشان اجازه داد که به فعالیت‌های معمول بازگردند و/ یا ابزار مهمی هستند برای تخمین ایمنی جمعی (شیوع سرمی یا seroprevalence)؛ یعنی موقعی که درصد کافی از جمعیت ایمن شده‌ و سرایت عفونت کند یا متوقف شده است. شناسایی آنتی‌بادی‌های مختلف ممکن است به تمایز افرادی که به‌تازگی عفونی شده‌اند (با تعیین IgM و احتمالاً IgA) از کسانی که در گذشته عفونت داشته‌اند کمک کند. توانایی تمایز عفونت جدید از عفونت قبلی، پس از فروکش کردن پاندمی و ظهور احتمالی موج جدید، خیلی مهم خواهد بود.

آزمایش‌های سرولوژی به اشکال گوناگون وارد بازار می‌شوند؛ برخی آزمایش‌ها یکی از کلاس‌های ایمونوگلوبولین‌ها را شناسایی می‌کنند، برخی دیگر بدون مشخص کردن این که چه نوعی ایمونوگلوبولینی شناسایی شده است، همه انواع را شناسایی می‌کنند (آزمایش‌های توتال آنتی‌بادی‌ها)، و برخی نیز هر کلاس را به‌طور جداگانه شناسایی می‌کنند. در حال حاضر، بیشتر آزمایش‌های کووید-19 آزمایش‌های سریع (RDT[2]) هستند، شبیه آزمایش‌های بارداری که خود اشخاص انجام می‌دهند. RDTها معمولاً به یک قطره خون از نوک انگشت نیاز دارند. هرچند این آزمایش‌ها نسبتاً سریع هستند و انجام آن‌ها کمتر از 15 دقیقه وقت می‌برد، اما غالباً به صورت تک‌تک یا چندتایی انجام می‌شوند [و بنابراین انجام تعداد زیادی آزمایش با این روش‌ها وقتگیر خواهد بود]. لازم به توجه است که از زمان ظهور کووید-19، بر خلاف معمول تعداد زیادی RTD وارد بازار شده است، از جمله آن‌هایی که توسط شرکت‌هایی ساخته شده‌اند که در گذشته در این زمینه فعال نبوده‌‌اند. کیفیت این آزمایش‌ها معلوم نیست. سازندگان IVD به زودی آزمایش‌هایی برای سنجش آنتی‌بادی‌ها در آزمایشگاه‌ها روانه بازار خواهند کرد که می‌توان بر بستر دستگاه‌های خودکار آن‌ها را با تعداد زیاد انجام داد. یکی از چنین آزمایش‌هایی قبلاً وارد بازار شده است (SNIBE Diagnostic). این امر [عرضه کیت‌های آزمایشگاهی به‌جای RDTها] امکان انجام دسته‌جمعی‌تر آزمایش‌های سرولوژی را فراهم خواهد ساخت.

خلاصه، آزمایش‌های کووید-19 همانند سایر بیماری‌های عفونی پیچیده است و به آگاهی از جزئیات عملکرد کیت‌های مورد استفاده نیاز دارد. غربالگری اولیه برای کووید-19 از طریق شناسایی اسید نوکلئیک ویروسی در سوآب‌های بینی و/ یا حلق انجام می‌شود. آزمایش NAT، هم توسط آزمایشگاه (به صورت دست‌ساز) و هم توسط تولیدکنندگان تجاری طراحی می‌شود. یک آزمایش سوآبی که فقط می‌تواند ویروس را در مقادیر زیاد شناسایی کند، ممکن است عفونتی را که تازه شروع شده است و/ یا عفونتی که مدتی از آن گذشته است را شناسایی نکند. درستی آزمایش سوآبی به کیفیت نمونه‌ها نیز بستگی خواهد داشت. آزمایش‌های خون، آنتی‌بادی‌های ضد ویروس را شناسایی می‌کنند. انواع مختلف آنتی‌بادی‌ها را می‌توان به‌صورت دسته‌جمعی یا جداگانه شناسایی کرد. در حال حاضر آزمایش‌های سرولوژی به صورت PoCTهایی هستند که از نمونه‌ خون نوک انگشت استفاده می‌کنند، اما آزمایش‌های سرولوژی برای استفاده در آزمایشگاه با توانایی انجام تعداد زیادی نمونه در راهند. از آنجا که نشانگرهای مختلف بیماری در زمان‌های مختلف قابل شناسایی هستند، هر یک از این آزمایش‌ها در مراحل مختلفی از بیماری مثبت خواهد بود؛ بنابراین، اگرچه گفته‌ی “آزمایش کنید، آزمایش کنید، آزمایش کنید” اساساً درست است، اما لازم است با این هشدارها همراه شود: با استفاده از کیت‌ها و برای مقصود اعلام شده‌شان “آزمایش کنید“؛ با علم به این که آزمایش را برای شناسایی چه چیزی انجام می‌دهید و محدودیت‌های آن آزمایش چه چیزهایی هستند “آزمایش کنید” و با کیت‌های با کیفیتِ شناخته‌شده “آزمایش کنید“.

بخش دوم: حفظ کیفیت آزمایش کردن در شرایط اضطراری

آیا بدون تردید روانه شدن این همه کیت کووید-19، یا به اصطلاح وسایل تشخیصی آزمایشگاه پزشکی (IVDs) به بازار چیز خوبی است؟ خُب، آره و نه. من یک راز تجاری را با شما در میان می‌گذارم. هیچ آزمایشی 100% حساس و اختصاصی نیست. به بیان دیگر همه آزمایش‌ها (البته برخی بیشتر از بقیه) هم تعدادی مثبت کاذب و هم تعدادی منفی کاذب گزارش خواهند کرد. در کشورهایی که دارای سامانه‌های نظارتی پیشرفته هستند (مانند اروپا، امریکا، استرالیا، ژاپن، کره و دیگران)، فروش IVDها، مثل فعالیت‌های دارویی، تحت نظارت شدید است. بسته به این که مخاطره ناشی از نتایج کاذب برای فرد و/ یا جامعه چقدر است، نظارت سختگیرانه متناسبی بر فروش IVDها اعمال می‌شود. در برخی از کشورها سامانه‌‌های نظارت بر IVD نابالغ است و در برخی دیگر وجود ندارد. در چنین کشورهایی دولت‌ها اغلب به جای برگزیدن بهترین گزینه برای کاربرد مورد نظر، کیت‌ها را از طریق مناقصه که ارزان‌ترین محصولات را برمی‌گزیند، انتخاب می‌کنند. در پاسخ به چنین وضعیتی، سازمان بهداشت جهانی «برنامه پیش‌ارزیابی IVD» (The IVD Prequalification Program) را راه‌اندازی کرده است. WHO و آزمایشگاه‌های همکارش مانند NRL برای کمک به دولت‌ها و NGOها در تصمیم‌گیری آگاهانه هنگام خرید کیت‌ها، عملکرد IVDها را بررسی و نتایج را در دسترس عموم قرار می‌دهند.

IVDهای HIV و هپاتیت و همه کیت‌هایی که برای غربالگری فرآورده‌های خونی استفاده می‌شوند، به‌شدت تحت نظارت هستند؛ زیرا در این موارد یک نتیجه کاذب می‌تواند هم به فرد و هم به جامعه آسیب برساند. سایر بیماری‌های عفونی در درجات پائین‌تری دسته‌بندی می‌شوند و آزمایش‌هایی مانند گلوکز یا عملکرد کبدی/ کلیوی حتا در سطوح پائین‌تری قرار می‌گیرند. برای ثبت یک کیتِ آزمایش برای ارگانیسم‌هایی پرمخاطره، سازنده باید به عنوان تولیدکننده، گواهی بین‌المللی (ISO 13485) داشته باشد، پرونده‌ای حاوی شواهد کامل درباره عملکرد وسیله به ناظر ارائه دهد، برگه راهنما یا دستور استفاده (IFU[3])ای داشته باشد که از نظر گویایی و کامل بودن بررسی و از نظر همخوانی با الزامات تأییدشده باشد، همچنین برای بررسی ایمن بودن IVD، ارزیابی مخاطره انجام ‌شود. غالباً شرکت سازنده از نظر تبعیت از استاندارد ارزیابی می‌شود. ثبت IVDها پیچیده و هزینه‌بر است، اما به منظور کمینه کردن مخاطره ناشی از آزمایش‌های دارای عملکرد ضعیف که وارد بازار می‌شوند و استفاده نادرست از IVDها وضع شده است. به منظور کاستن از هزینه‌های نظارتی تحمیل‌شده به سازندگان IVDها، یک کارگروه جهانی هماهنگ‌سازی که اکنون مجمع بین‌المللی ناظران تجهیزات پزشکی (IMDF[4]) جایگزین آن شده است، تشکیل شد تا سازمان‌های نظارتی کشورهای مختلف را ترغیب کند ثبت IVDها در دیگر کشورهای عضو را به رسمیت بشناسند. بیشتر اقتصادهای پیشرو عضو IMDF هستند.

هر IVD برای یک “کاربرد مورد نظر” (Intended Use) ثبت می‌شود [مقصود از استفاده]، و آزمایشگاه‌ها قانوناً حق ندارند آن‌ را برای مقاصد دیگر به‌کار ببرند. چنانچه بر روی یک IVD تغییراتی داده شود [حتا کم و زیاد کردن زمان انکوباسیون و یا تغییر نوع نمونه مثلاً از پلاسما به سرم]، آن وسیله به یک آزمایش “دست‌ساز” تبدیل می‌شود و از پوششِ مجوزِ گرفته‌شده توسط تولیدکننده خارج می‌شود (off license) و مسئولیت کیفیت نتایج آزمایش و هرگونه پیامدی برای بیماران بر عهده آزمایشگاه خواهد بود. برخی کشورها از جمله استرالیا، الزامات خاصی در مورد استفاده از آزمایش‌های “دست‌ساز” دارند. سازندگان IVDهای پرمخاطره باید شواهد علمی مربوط به عملکرد کیت آزمایش و مناسب بودن آن برای “کاربرد مورد نظر” را که در دستورالعمل استفاده (IFU) قید شده است ارائه دهند. مثال‌هایی از “کاربرد مورد نظر” عبارتند از: غربالگری اهدای خون و بافت، آزمایش کلی برای مقاصد تشخیصی، پیگیری مؤثر بودن درمان یا پیشرفت بیماری، آزمایش‌ تأییدی، آزمایش سریع بر بالین بیمار برای آزمایش کردن عموم و صرفاً برای استفاده در منزل. بسته به IVD و کاربرد مورد نظر آن، طیفی از شاخصه‌های عملکردی که ممکن است ارزیابی شوند، عبارتند از:

حساسیت Sensitivity– توانایی یک آزمایش در گزارش کردن یک نتیجه مثبت برای یک نمونه مثبت واقعی؛
ویژگی Specificity– توانایی یک آزمایش در گزارش کردن یک نتیجه منفی برای یک نمونه منفی واقعی؛
دقت Precision– میزان نوسان ذاتی آزمایش؛
تورش Bias– درستی آزمایش در مقایسه با نتایج واقعی (معمولاً به‌دست‌آمده از روش مرجع یا استاندارد)؛
حدّ شناسایی Limit of Detection (LOD)– سنجه‌ای برای کمترین مقدار آنالیت که کیت آزمایش می‌تواند شناسایی کند؛
حدّ تعیین مقدار Limit of Quantification (LOQ)– سنجه‌ای برای کمترین مقدار آنالیت که کیت آزمایش می‌تواند تعیین مقدار کند (معمولاً با اطمینان 95%)؛
خطیّت Linearity– بیان اینکه سیگنال، متناسب با افزایش مقدار آنالیت افزایش می‌یابد؛
واکنش متقاطع Cross Reaction– آیا آنالیت‌هایی غیر از آنالیتی که باید شناسایی شود سبب گزارش نتایج مثبت می‌شود؟ این اتفاق در برخی وضعیت‌های بیماری‌ مانند بیماری‌های اتوایمیون یا عفونت‌های ناشی از ارگانیسم‌های شبیه به ارگانیسمی که باید شناسایی شود، رایج است؛
تنوع سروتایپ/ ژنوتایپ Serotype/Genotype variation– بسیاری از ارگانیسم‌ها تعدادی سروتایپ یا ژنوتایپ مسری دارند، که ممکن است کیت‌های دارای طراحی ضعیف قادر به شناسایی همه آن‌ها نباشند؛
پایداری Stability– اطمینان از اینکه معرف‌ها پایدار هستند و به مرور زمان خراب نمی‌شوند.

البته همه شاخصه‌های عملکردی برای همه کیت‌ها کاربرد ندارد، اما وقتی کاربرد دارد، مصرف کننده باید آن‌ها را بشناسد تا بتواند تفسیر درستی از نتایج داشته باشد. بیشتر این شاخصه‌ها بی نیاز از توضیح هستند، اما مرور مختصری بر این که چگونه هر یک از این شاخصه‌ها می‌تواند در آزمایش کووید-19 مهم باشد ارائه می‌شود.

حساسیت و اختصاصیت تقریباً از شاخصه‌های مهم همه کیت‌ها هستند. برای برآورد کردن این شاخصه‌ها، دسترسی به تعداد زیادی از نمونه‌های مثبت و منفی شناخته‌شده لازم است. در حال حاضر «الزامات فنی رایج (CTS)^[5] اروپایی» حدود 500 نمونه مثبت و 5000 نمونه منفی را برای ارزیابی اختصاصیت و حساسیت روش‌های غربالگری خون لازم می‌داند. در مورد آزمایش‌های تشخیصی سریع (RDT) برای HIV، HCV و HBsAg، با حساسیت منتظره بیش از 99%، تعداد 500 نمونه مثبت و 1,500 نمونه منفی لازم است. در بررسی اختصاصیت و حساسیت باید به طور مشخص نمونه‌های اهدا کنندگان خون، نمونه‌های بالینی، نمونه‌های زنان باردار و نمونه‌های حاوی مواد بالقوه مداخله‌گر گنجانده و آزمایش شوند. در مورد روش‌های NAT برای HIV RNA، HCV RNA و HBV DNA لازم است با استفاده از استانداردهای بین‌المللی، حدّ شناسایی یا LOD (Limit of Detection) برآورد شود، و برای روش‌های کمی باید حدّ تعیــــــــــــــــــــــــــــین مــقدار یا LOQ (Limit of Quanitification) نیز برآورد شود. باید بیش از 10 نمونه برای هر ژنوتایپ HIV آزمایش شود تا بتوان توانایی شناسایی یکسانِ همه‌ ژنوتیپ‌ها را نشان داد. برای نشان دادن اختصاصیت، نمونه‌های دارای مواد مداخله‌گر و آنالیت‌هایی که واکنش متقاطع می‌دهند، آزمایش می‌شوند. مطالعه دقت، هم در حضور تعداد معدودی از متغیرها یعنی یک دستگاه، یک شماره ساخت و یک کاربر طی یک دوره کوتاه زمانی (تکرارپذیری repeatability) و هم با متغیرهای متعدد طی یک دوره زمانی طولانی (همانندسازی reproducibility) انجام می‌شود. بررسی تغییرات کیت در سری ساخت‌های مختلف (lot-to-lot variation) نیز لازم است و در اروپا و امریکا سازمان نظارت‌کننده باید تا زمانی که به عملکرد یک IVD پرمخاطره اطمینان پیدا کند، هر سری ساخت را آزمایش و برای آن مجوز صادر نماید. پروتکل‌های پیش‌ارزیابی WHO شبیه همین هستند، اما سختگیری کمتری دارند. به این ترتیب، تا قبل از اینکه یک IVD وارد بازار شود، ارزیابی‌های وسیع عملکردی روی آن انجام شده و نتایج آن در دامنه (domain) عمومی برای بررسی توسط کاربران بالقوه قرار داده شده است.

کیفیت آزمایش‌های کنونی برای کووید-19

به هر حال در وضعیت کنونی برای آزمایش کووید-19، الگوی کیفیت متفاوتی حاکم است. اخیراً، به‌منظور ممکن ساختن استفاده از کیت‌ها بدون نیاز به ارائه شواهد کامل از طرف سازنده که در شرایط معمولی لازم است، دولت‌ها به‌درستی برای الزامات نظارتی، معافیت در نظر گرفته‌اند. بر اساس سند IVD [اروپایی] 98/79/EC، وسایل تشخیصی کووید-19 در حوزه الحاقیه سوم (Annex 3) هستند و سازنده باید شاخصه‌های عملکردی وسیله را مشخص و خودش اظهار کند که وسیله با الزامات ایمنی و الزامات عملکردی فهرست‌شده در این سند مطابقت دارد. [به عبارت دیگر] لازم نیست نهادهای گواهی‌دهنده (Notified bodies) هیچ بررسی عملکردی انجام دهند، یا برای شماره ساخت‌های مختلف مجوز عرضه به بازار صادر کنند. اروپا اخیراً در حال انتقال به یک چارچوب نظارتی مبتنی بر IMDF است، اگرچه این انتقال هنوز کامل نشده است. هنوز مشخص نیست که آیا کووید-19 در دسته پرمخاطره‌ترین آزمایش‌ها قرار خواهد گرفت یا نه و یک ارزیابی کامل شامل صدور مجوز برای هر شماره ساخت آن الزامی خواهد شد یا نه. به احتمال خیلی زیاد، اروپا نیز همان راه امریکا، استرالیا و WHO را خواهد رفت و تمهیدات استفاده اضطراری را مجاز خواهد کرد. در استرالیا، قانون ویژه‌ای تصویب شد که IVDها را از موشکافی‌های معمول نظارتی معاف می‌کند. سازمان بهداشت جهانی پروتکل “فهرست استفاده اضطراری” را برای روش NAT کووید-19 (اما نه سرولوژی) ارائه کرده است، که شواهد عملکردی محدودی را طلب می‌کند. به همین شکل FDA امریکا، کانادا، ژاپن، کره و سنگاپور نیز “فهرست استفاده اضطراری” (بدون نیاز به ارائه شواهد کامل عملکرد) برای NAT و سرولوژی اجرا کرده‌اند. اروپا و استرالیا بر خلاف فرآیندهای معمول نظارتی، ارزشیابی آزمایش‌های کووید-19 را به آزمایشگاه‌های سلامت عمومی واگذار کرده‌اند. این آزمایشگاه‌ها خط مقدم انجام آزمایش‌های کووید-19 هستند، اما تجربه کمی در ارزشیابی‌های رسمی کیت‌ها دارند و در حال حاضر در حال سر و کله زدن با حجم بالای نمونه‌هایی هستند که بر سرشان ریخته است. FIND (ژنو، سوئیس) در حال گردآوری نتایج ارزیابی‌های روش‌های NAT و سرولوژی کووید-19 است.

هنگام طراحی برنامه‌های ارزشیابی برای آزمایش‌های کووید-19 با برخی مشکلات فنی روبرو می‌شویم؛ برخلاف آزمایش‌های سرولوژی HIV، سیفیلیس و HBsAg، برای کووید-19 هیچ روش مرجع یا تأییدی شناخته‌شده‌ای وجود ندارد. در ارزشیابی سرولوژی HIV از راهبرد آزمایش‌های متعدد شامل آزمایش‌های غربالی و به دنبال آن آزمایش‌های تکمیلی و/ یا تأییدی مانند وسترن بلات استفاده می‌شود. در ارزشیابی سرولوژی سیفیلیس نیز به همین شکل از راهبرد آزمایش‌های متعدد آنتی‌تروپونمایی اختصاصی مانند EIAها، CHLIA و TPPA استفاده می‌شود. مثبت بودن HBsAg و HIV p24 را می‌توان با آزمایش خنثی‌سازی^[6] تأیید کرد. در حال حاضر هیچ آزمایش مرجعی برای سرولوژی کووید-19 وجود ندارد، البته NRL در حال کار بر روی یک وسترن بلات است. خنثی‌سازی ویروسی ممکن است مفید باشد. برای ارزیابی LOD یا LOQ آزمایش اسید نوکلئیک کووید-19، داشتن یک استاندارد بین‌المللی با بار ویروسی شناخته‌شده لازم است. ولی تهیه چنین استانداردی زمان زیادی لازم دارد. در میان‌مدت، باید چندین پنل از رقت‌های سریال ویروسی تهیه شده و در دسترس قرار بگیرد و همه NATها با استفاده از سری‌های رقتیِ یکسان مقایسه شوند تا بتوان مقایسه LOD را انجام داد. بدون چنین سطحی از انضباط، درک ما از عملکرد کیت‌های آزمایش‌ کووید-19 محدود باقی خواهد ماند.

مهم است دریابیم که در حال حاضر داده‌های اندکی در ارتباط با کیت‌های‌ آزمایش کووید-19 وجود دارد. در نوشته‌ای که به‌تازگی توسط دانشگاه ملی سنگاپور (NUS) منتشر شده است، الحاقیه‌ای وجود دارد که فهرست کیت‌هایی که تا زمان تهیه آن نوشته در دسترس بوده است را شامل می‌شود. متأسفانه، در این فهرست داده‌های کمی درباره عملکرد کیت‌ها وجود دارد یا درباره برخی کیت‌ها هیچ داده‌ای وجود ندارد. در مورد آن‌هایی هم که داده وجود دارد، حساسیت و اختصاصیت قابل قبول نیست و اطمینان خاطر کمی را بر‌می‌انگیزاند. یکی از روش‌های موجود در مطالعه NUS که داده‌های آن ارائه شده است، کیت آزمایش سریع IgM/IgG کووید-19 ساخت BioMedomics /Jiangsu Medonics Medical است. فقط به عنوان نمونه، حساسیت اعلان‌شده این کیت 88/6% و اختصاصیت اعلان شده آن 90/6% است. اول این که بدون ارائه محدوده‌های اطمینان 95%، گزارش حساسیت و اختصاصیت زیر سؤال است. اگر یک روش، 9 نمونه از 10 نمونه مثبت را به‌درستی شناسایی کند، حساسیت آن 90% می‌شود (بازه اطمینان 95% از 54/1% تا 99/5%)، که معنای آن این است که حساسیت واقعی ممکن تا 54/1% پایین باشد، ولی اگر 1000 نمونه مثبت استفاده شده بود و 900 نمونه شناسایی شده بود، باز هم حساسیت همان 90% می‌شد، اما با بازه اطمینان 95% برابر با %87/9 تا %91/7 که نشان‌دهنده‌ اطمینان بسیار بیشتری به برآورد حساسیت است. در ارزیابی کیت یاد‌شده، 397 نمونه مثبت استفاده و 351 نمونه شناسایی شده است که به معنای حساسیت 88/6% است. بازه اطمینان 95% این کیت برابر است با 84/8% تا 91/3%. به بیان دیگر، از هر 100,000 فرد مثبت واقعی که آزمایش شوند، 11,400 نفر به طور نادرست منفی گزارش خواهند شد. خطر استفاده از آزمایش‌های دارای عملکرد ضعیف، هم از دیدگاه سلامتی و هم از دیدگاه اقتصادی کاملاً عیان است.

ما داریم با چشمان بسته پرواز می‌کنیم. در زمان نوشتن این مطلب، بیش از یک میلیون نفر عفونت تأیید‌شده کووید-19 دارند و ارقام واقعی بسیار بالاتر است. با وجود این، مشکل تهیه تعداد کافی از نمونه‌های با حجم مناسب برای اجرای مطالعات فراگیر همچنان باقی است. یک مشکل این است که وقتی آزمایش NAT افراد مثبت می‌شود، بیماران ایزوله می‌شوند و تهیه نمونه از آنها مشکل می‌گردد. کسانی که در خط مقدم قرار دارند از نیاز به نمونه‌های ارزشیابی آگاه نیستند و نوع نمونه‌های مورد نیاز را نمی‌شناسند. بله، “ارزیابی‌های” بسیاری با استفاده از نمونه‌های دم‌دستی در حال انجام است. FIND در حال گردآوری و انباشتن این داده‌ها برای استفاده عمومی است. تولیدکنندگان نیازمند دستیابی به داده‌های مربوط به عملکرد روش‌هایشان هستند تا در آینده، زمانی که کووید-19 دیگر مشمول کاربرد اضطراری نبود، آن‌ داده‌ها را برای اثبات ادعاهایشان ارائه کنند.

با وجود این، تا جایی که من خبر دارم، تا کنون یک فرآیند سامانمند و علمی‌ برای ارزیابی کیت‌های آزمایش با استفاده از یک پنل یکسان که به‌درستی ساختاربندی شده باشد وجود نداشته است. در حال حاضر، بدون احتساب کیت‌های دست‌ساز، بیش از 200 کیت‌ ابداع شده یا در دسترس است. آنچه که لازم است، یک پنل نمونه‌ی مرتب‌شده است که بتوان از آن در ارزشیابی شاخصه‌های عملکردی کیت‌های‌ آزمایش کووید-19 استفاده کرد. حجم این پنل‌ها باید آنقدر باشد که بتوان تا حد ممکن کیت‌های‌ بیشتری را بررسی کرد. گردآوری نتایج حاصل از هر کیت [و افزودن آنها به داده‌های قبلی]، بر ارزش این پنل ارزیابی خواهد افزود. برنامه پیش‌ارزیابی WHO چنین پنلی را برای سرولوژی HIV تهیه کرده است و NRL اخیراً در حال تهیه پنلی برای سیفیلیس است. چنین فعالیتی نیازمند تلاشی هماهنگ‌شده و دانش کافی درباره برنامه‌های ارزشیابی است.

NRL از همکاران بالقوه‌ای که می‌توانند در تأمین نمونه‌های بالینی به شکل اخلاقی و غیرتجاری به‌منظور تهیه یک پنل ارزشیابی کمک کنند، استقبال می‌کند. به‌عنوان یک جامعه علمی و برای اطلاع‌رسانی به دولت‌هایمان، نیاز به اطلاعات فراگیر و معتبر علمی درباره آزمایش‌ کووید-19 اضطراری و مهم است. ارزشیابی‌های باری ‌به‌هرجهت و از سر ضرورت، با استفاده از نمونه‌های دم‌دست و بدون برنامه‌های علمی که به خوبی ساختاربندی شده باشند، کافی نیست و حتا ممکن است خطرناک و گمراه‌کننده باشند. برای حل این مشکل به یک رویکرد بین‌المللی هماهنگ نیاز داریم.

چنانچه سازمان شما تمایل دارد و می‌تواند در تهیه پنل‌های نمونه‌ جهانی برای ارزیابی آزمایش‌های سرولوژی کمک کند، لطفاً به wayne@nrlquality.org.au ایمیل بفرستید.

درباره نویسنده

وین دیمک مدیر اجرایی، علمی و ارتباط تجاری NRL است. NRL یک مرکز همکار سازمان بهداشت جهانی (WHO) برای پشتیبانی تشخیصی و آزمایشگاهی HIV و ایدز و دیگر عفونت‌های خونزاد است. آقای دیمک پیش از گذراندن دوره فلوشیپ میکروبیولوژی در «مؤسسه استرالیائی دانشمندان پزشکی» و تکمیل MBA در دانشگاه LaTrobe، اولین مدرک آزمایشگاهی خود را از «مؤسسه فن‌آوری سلطنتی ملبورن RMIT» گرفت. او همچنین فلوی «دانشکده علوم (تحقیقات)» در «کالج سلطنتی آسیب‌شناسان استرالیا» است. وی با کار کردن در بخش‌های میکروبیولوژی در آزمایشگاه‌های آسیب‌شناسی خصوصی و دولتی، در زمینه سرولوژی بیماری‌های عفونی صاحب تخصص شده است. علاقمندی‌های تحقیقاتی آقای دیمک عبارت است از پایش و عیارمندسازی روش‌هایی که در شناسایی و پیگیری بیماری‌های عفونی خونزاد و آمیزشی به‌کار برده می‌شود. علاقه ویژه ایشان عیارمندسازی آزمایش‌های روبلا و پیگیری تغییرات سنجشی بیماری‌های عفونی است. ایشان در راه‌اندازی EDCNet که یک برنامه مبتنی بر اینترنت برای پایش کیفیت نتایج آزمایش‌ها است و نیز در بهینه‌سازی OASYS، نرم‌افزاری که برای مدیریت برنامه‌های ارزیابی خارجی کیفیت استفاده می‌شود، نقشی اساسی داشته است. آقای دیمک مشاور بسیاری از کارگروه‌های ملی و بین‌الملی است، شامل «راهبرد استرالیایی آزمایش هپاتیت [7]B»، «استانداردهای استرالیا[8] و مشاوره زیر نظر WHO»، «قواعد سلامتی بین‌المللی[9]»، UNDP و «سرمایه جهانی[10]». او نویسنده یا نویسنده همکار حدود 50 مقاله است که در مجلات معتبر مرورشده منتشر شده است و نیز در نوشتن سه بخش کتاب همکاری کرده است.

منابع:

Wayne Dimech, B. Appl Sci.; MASM; MBA; FAIMS; FRCPA (science faculty)
April 2020

https://www.westgard.com/covid-19-test-test-test.htm