راهنمای کمیته استانداردسازی هماتولوژی (ICSH) در گزارش مرفولوژی (1)

دکتر حبیب‌اله گل‌افشان

با توجه به اینکه سیستم نمره‌دهی یا درجه‌بندی شدت ناهنجاری گلبول‌های قرمز و سفید در بسیاری از آزمایشگاه‌ها سلیقه‌ای است، ازاین‌رو با در نظر گرفتن اهمیت بالینی این ناهنجاری‌ها، گروه استانداردسازی در هماتولوژی (ICSH) با استفاده از تجارب متخصصین مرفولوژی و پاتولوژی و علوم آزمایشگاهی، اقدام به تهیه یک راهنما برای گزارش درجه و یکسان‌سازی نامگذاری مرفولوژی نموده است. در این نوشتار به اهمیت بالینی برخی از ناهنجاری‌های مرفولوژی اشاره می‌گردد و شیوه گزارش مرفولوژی بر اساس خفیف Few (+)، متوسط Moderate (++) و شدید Marked (+++)، طبق جدول ارائه می‌گردد. سفارش می‌شود که برای دست‌یابی به درصد یک مرفولوژی سلول غیرنرمال، 1000 سلول مورد ارزیابی قرار گیرد.

در این نوشتار نیز سعی شده است که اخطار آنالیزورها (Flags) برای اپراتورها و شیوه برطرف کردن اخطار و نیز چگونگی مطالعه گستره محیط در رابطه با اخطارهای مرفولوژی موردتوجه قرار گیرد. هرگونه اخطار مرفولوژی آنالیزور بایستی با ارزیابی گستره محیطی همراه گردد.

با وجود پیشرفت‌های تکنولوژی در زمینه‌ی ساخت آنالیزورهای خون‌شناسی، هنوز مطالعه گستره محیطی سنگ بنای تشخیص بیماری‌های خون است و یافته‌های آنالیزور بایستی با یافته‌های خون محیطی مورد تأیید قرار گیرد. شیوه درجه‌بندی (grading Level)مرفولوژی‌های غیرطبیعی گلبول‌های قرمز و سفید در آزمایشگاه‌های مختلف قانونمند نبوده و سلیقه‌ای عمل می‌گردد. درجه‌بندی براساس تعیین درصد گلبول‌های غیرنرمال در میان جمعیت نرمال است و گفتنــی اســت که حــتی در میان کتاب‌های مرجع خون‌شناسی (text book)، شیوه‌های مختلف و غیریکنواخت برای گزارش مرفولوژی وجود دارد؛ برای مثال در یک مرجع یک مرفولوژی غیرطبیعی 2 تا 5% به‌عنوان اندک (slight)،6 تا 15% متوسط و بیشتر از 16 درصد به‌عنوان شدید (marked) آمده است، درحالی‌که در رفرانس دیگر یک مرفولوژی غیرطبیعی بین 6 تا 10 درصد با علامت + و بین 10 تا 25 درصد +2 و بین 25 تا 50 با +3 و بیشتر از 50 درصد به‌صورت +4 گزارش می‌گردد و گاهی مقادیر کم مرفولوژی با لغت نایاب (Rare) و گاه (Occasional) گزارش می‌گردد.

گزارش شدت درجه یک مرفولوژی ویژه ممکن است در رابطه با طول دوره بیماری و یا ناشی از شیوه وراثت آن باشد و برای هر مرفولوژی شیوه گزارش متفاوت است، برای مثال گلبول‌های قرمز شکسته یا شیستوسیت کمتر از یک درصد نرمال تلقی می‌گردد، درحالی‌که حضور بیشتر از یک درصد در همراهی با کاهش شمارش پلاکت و نبود مرفولوژی دیگر هرگز نبایستی نادیده گرفته شود، زیرا ممکن است در زمینه بیماری‌های اورژانس همچون انعقاد داخل عروقی منتشره و میکروآنژیوپاتی ترومبوتیک باشد و حتی در این موارد گزارش درصد شیستوسیت‌ها برای پیگیری درمان سودمند است. برخی از آنالیزورهای خون‌شناسی، گلبول‌های شکسته را از روی اخطار شروع طرف چپ هیستوگرام گلبول‌های قرمز که بالای محور x قرار می‌گیرد مورد شناسایی قرار می‌دهند.

در حضور گلبول‌های قرمز شکسته، لبه‌ی هیستوگرام گلبول‌های قرمز در سمت چپ از خط پایه شروع نمی‌شود

مشاهده شیستوسیت در همراهی با الیپتوسیتوز همولیتیک یا پیروپویکیلوسیتوز گرچه قابل گزارش است ولی به اهمیت کم‌خونی‌های میکروانژیوپاتیک نمی‌باشد. در این حالت گلبول‌های شکسته در میان جمعیت گلبول‌های نرمال ظاهر می‌گردند که بسیار حائز اهمیت است.

مرفولوژی‌های الیپتوسیت/ اوالوسیت از مرفولوژی‌های شایع است و در برخی از کتاب‌های مرجع تا کمتر از 10 تا 15 درصد نرمال تلقی می‌شود، درحالی‌که گزارش‌های اخیر بیشتر از 5 درصد را نرمال تلقی نمی‌کند. در الیپتوسیتوز ارثی بیشتر از 25 تا 75 الی 100 درصد از گلبول‌های قرمز به‌صورت الیپتوسیت یا اوالوسیت هستند.

مرفولوژی الیپتوسیت ممکن است در زمینه کم‌خونی فقر آهن، کـــم‌خونی مگالوبلاستیک و بدخیمی‌های متاستازدهنده به مغز استخوان همراه با گلبول‌های قطره اشکی یافت شود، ازاین‌رو گزارش این مرفولوژی در رابطه با یافته‌های دیگر اهمیت می‌یابد، برای مثال مرفولوژی الیپتوسیت همراه با گلبول‌های شکسته، الیپتوسیت‌های شکسته و اسفروسیت گویای الیپتوسیت همولیتیک است که ممکن است نیاز به برداشتن طحال داشته باشد.

مرفولوژی رولکس در رابطه با افزایش هموگلوبین‌ها و فیبرینوژن است که شاهد بهم چسبیدن گلبول‌های قرمز مثل ستون سکه در سرتاسر گستره محیطی هستیم. گزارش رولکس از درجه slight (ملایم) تا متوسط و شدید در رابطه با غلظت پروتئین‌ها و میزان ESR متفاوت است، ولی باید در نظر داشت که در بیماران کم‌خون مشاهده خفیف رولکس به علت کاهش تعداد گلبول‌های قرمز و تمایل آنها به چسبیدن به یکدیگر نرمال تلقی می‌گردد.

در گزارش مرفولوژی اسفروسیت، مشاهده اسفروسیت‌های هم‌اندازه، ارثی بودن را مطرح می‌کند که در اغلب موارد با MCV در طیف نرمال و افزایش MCHC همراه است، درحالی‌که مشاهده اسفروسیت در اندازه‌های گوناگون امکان کم‌خونی آتوایمیون را مطرح می‌کند.

تارگت سل شبیه به چشم جغد در موارد مختلفی مشاهده می‌شود؛ تارگت سل ممکن است در تالاسمی و آنمی فقر آهن به‌صورت میکروسیتیک و در هموگلوبینوپاتی‌های داسی و C و E به‌صورت نرموسیت و در بیماری‌های کبدی به علت توسعه غشا و انباشت آن از چربی به‌صورت ماکروسیت مشاهده شود. در گزارش تارگت بایستی دقت کرد زیرا می‌تواند به‌صورت آرتیفکت ناشی از دیر خشک شدن گستره محیطی یا افزایش نسبت ضدانعقاد به خون باشد.

گزارش آکانتوسیت ممکن است ارزش تشخیصی برای بیماری‌های کبدی، سوءتغذیه و کم‌کاری تیروئید داشته باشد و در همراهی با اجسام هاول‌ژولی و تارگت‌ سل، علامت کم‌کاری طحال یا اسپلنکتومی می‌باشد. گاهی با برداشتن طحال در برخی از بیماران، افزایش شمارش لنفوسیت‌ها نمایی شبیه به لوسمی مزمن لنفوسیتیک به خون می‌دهد.

توجه داشته باشید که مرفولوژی طبیعی گلبول‌های قرمز نوزادان دارای تفاوت چشمگیر نسبت به بچه‌ها است. در بچه‌ها و بزرگسالان تا یک درصد گلبول شکسته نرمال است درحالی‌که یک نوزاد ممکن است تا 3 درصد گلبول شکسته، گلبول پلی‌کروماژی، تعدادی اسفروسیت و آکانتوسیت و اجسام هاول‌ژولی را به‌طور طبیعی نشان دهد. گلبول‌های قرمز هسته‌دار بین 3 تا 10 به ازای 100 گلبول سفید تا هفته دوم تولد نرمال قلمداد می‌گردد. گلبول‌های قرمز به‌طور فیزیولوژیک در بدو تولد ماکروسیتیک هستند و MCV بین 104 تا 120 فمتولیتر متغیراست.

گزارش درجه هایپوکرومی با توجه به میزان MCH یا با توجه به درصد گلبول‌های قرمزی که قطر هاله مرکزی آنها بیشتر از 1:3 قطر گلبول باشد صورت می‌گیرد. مقدار طبیعی MCH بین 34-27 پیکوگرم است و مقدار 26-22 به‌صورت slight(1+) و بین 21-18 به‌صورت هایپوکروم متوسط (2+) و کمتر از 18 به‌صورت هایپوکروم شدید گزارش 3+ می‌گردد.

مقدار طبیعی MCV در بزرگسالان 99-80 فمتولیتر است و بین 79-70 و 69-60 و کمتر از 60 به ترتیب با درجه میکروسیت خفیف (slight) و متوسط و شدید و یا با علامت + و ++ و +++ درجه‌بندی می‌گردند. میزان MCV بین110-100 و 125-111 و بیشتر از 125 به ترتیب ماکروسیت خفیف و متوسط و شدید یا با علائم + و ++ و +++ درجه ماکروسیت گزارش می‌شوند.

چنانچه هسته لنفوسیت کوچک به‌عنوان راهنمای اندازه‌ی طبیعی گلبول‌های قرمز در نظر گرفته شود، می‌توان در نبود پارامترRDW درجه تغییرات اندازه (Anisocytosis) را با مقایسه سایز گلبول‌های قرمز با هسته لنفوسیت انجام داد و چنانچه بین 11 تا 20 درصد گلبول‌های قرمز دارای تفاوت سایز باشند با علامت 2+ یا متوسط و بیشتر از 20 درصد را به‌صورت 3+ یا شدید گزارش کرد. تفاوت اندازه در کمتر از 10 درصد از گلبول‌های قرمز به‌صورت 1+ گزارش می‌گردد.

هسته لنفوسیت کوچک (شکل F) راهنمای اندازه طبیعی گلبول‌های قرمز می‌باشد

برای گزارش درجه میکروسیت و ماکروسیت در نبود MCV می‌توان درصد گلبول‌هایی که کوچک‌تر از هسته لنفوسیت هستند را به‌عنوان درصد گلبول‌های میکروسیت و درصد گلبول‌هایی که از هسته لنفوسیت کوچک بزرگترند را به‌عنوان ماکروسیت در نظر گرفت و بین 1 تا 10 درصد و 11 تا 20 درصد و بیشتر از 20 درصد را به‌صورت 1+ و 2+ و 3+ گزارش کرد.

بخش‌های نامنظم گلبول‌های قرمز روی گستره‌ی محیطی

آگلوتیناسیون سرد، رولکس، رسوب کرایو و رشته‌های فیبرین موجب بخش‌های نامنظم سلول‌ها شده و در مواردی با تغییر مرفولوژی گلبول‌های قرمز به‌صورت آرتیفکت همراه می‌شود. رسوب کرایو به‌صورت رسوب گلوبولار نامنظم به‌صورت آبی کم‌رنگ و یا به‌صورت زمینه‌ای از مواد پروتئینی لابه‌لای گلبول‌های قرمز ممکن است، مشاهده گردد. رسوب کرایوگلوبولینی در هپاتیت C و اختلالات لنفوپرولیفراتیو و بیماری‌های اتوایمیون مشاهده گردیده و گزارش می‌شود.

رسوب کرایو گلوبولین به‌صورت ذرات آمورف به رنگ آبی کم‌رنگ در زمینه گستره

آگلوتیناسون سرد به‌صورت تجمعات خوشه‌ای شکل گلبول‌های قرمز در گستره‌ی محیطی نمایان شده و با خطای افزایش اندکس‌های خونی MCV و MCH و MCHC و کاهش شمارش گلبول‌های قرمز همراه است. شدت آگلوتیناسیون سرد وابسته به عیار آنتی‌بادی سرد و طیف حرارتی آن است.

هیستوگرام گلبول‌های قرمز در سمت راست گلبول‌های ماکروسیت و در سمت چپ توده‌های به‌هم چسبیده آگلوتیناسیون سرد در اندازه‌های مختلف را نشان می‌دهد

لنفوم سلول‌های B و عفونت با میکوپلاسما و منونوکلئوز عفونی از مهم‌ترین علل شکل‌گیری آنتی‌کرهای سرد هستند. گلبول‌های قرمز در صورت‌بندی رولکس به‌صورت ستون سکه روی هم قرار می‌گیرند و با افزودن سرم فیزیولوژی به یک قطره خون، تجمعات گلبول پخش می‌گردد. پدیده رولکس ناشی از افزایش پروتئین‌های فاز حاد یا پاراپروتئین‌ها در اختلال پلاسماسل یا لنفوپرولیفراتیو است.

پدیده رولکس با افزایش سرعت رسوب همراه است و چنانچه در حضور این پدیده سرعت رسوب نرمال باشد ممکن است هایپرویسکوسیته پلاسما مانع از رسوب گلبول‌های قرمز شده باشد.

تجمعات رولکس به علت اینکه در رقیق‌کننده‌های آنالیزور پخش می‌گردند موجب خطا در پارامترهای خون نمی‌شوند.

گزارش آگلوتیناسیون سرد و رولکس با درشت‌نمایی 10 یا 40 صورت می‌گیرد و بایستی آنها را از ابتدای منطقه نازک گستره مشاهده کنیم و منطقه ضخیم گستره برای بیمار گزارش نشود.

تصویر سمت راست آگلوتیناسیون سرد و تصویر سمت چپ رسوب فیبرین را نشان می‌دهد

اخطار هیستوگرام گلبول‌های قرمز در حضور آگلوتیناسیون سرد یا حضور گلبول‌های قرمز هسته‌دار و یا لکوسیتوز شدید

اخطار هیستوگرام گلبول‌های قرمز در حضور دو جمعیت گلبول‌های قرمز با اندازه‌های مختلف

تغییرات اندازه و رنگ گلبول‌های قرمز

تغییرات اندازه (Anisocytosis) در آنالیزورها با پارامتر RDW-SD (دامنه توزیع حجم) و RDW-CV (دامنه توزیع حجم حول حجم میانگین) گزارش می‌شود.

سفارش می‌شود که درجه تغییرات اندازه براساس گزارش آنالیزور گزارش گردد و در صورت فراهم نبودن آنالیزور با مشاهده گستره اقدام به گزارش درجه آن گردد. مقدار نرمال RDW-CV بین 11 تا 14/5 درصد و مقدار طبیعی RDW-SD بین fl42±3 است.

پهنای خطی که از 20 درصد فراوانی هیستوگرام حجم را قطع می‌کند برابر با دامنه پراکندگی حجم برحسب SD می‌باشد. (RDW-SD)

برای محاسبه‌ی RDW-CV، یک SD از پراکندگی حجم که 68 درصد از گلبول‌ها را دربر می‌گیرد بر MCV تقسیم شده و حاصل در عدد 100 ضرب می‌شود و مقدار طبیعی آن 11 تا 14/5 درصد است

دای‌مرفیسم (Dimorphism)

دای‌مرفیسم اشاره به حضور دو جمعیت جداگانه از گلبول‌های قرمز دارد که به‌آسانی از روی هیستوگرام گلبول‌های قرمز مشاهده شده و موجب افزایش پارامتر RDW می‌گردد. اصطلاح دای‌مرفیسم در بیشتر اوقات با مشاهده گلبول‌های میکروسیت هایپوکروم با جمعیت نرموکروم یا جمعیت ماکروسیت بکار می‌رود. مرفولوژی دای‌مرف ممکن است با همراهی گلبول‌های ماکروسیت و نرموسیت باشد. سفارش می‌شود که در گزارش مرفولوژی دای‌مرفیسم به دو جمعیت مختلف گلبول‌های قرمز اشاره شود.

مرفولوژی دای‌مرفیسم در کم‌خونی سیدروبلاستیک، آنمی فقر آهن در پاسخ به آهن‌درمانی و تزریق خون به بیماری که مرفولوژی میکرو یا ماکرو دارد مشاهده می‌شود.

دایمرف با مخلوط گلبول‌های ماکروسیت و مشاهده تغییرات شبه پلگر در گلبول‌های سفید ممکن است زنگ خطر یا نشانه‌ای از سندرم‌های پیش‌سرطانی باشد.

تصویر دای‌مورفیسم در هیستوگرام و تصویر لام خون محیطی

هایپوکروم

هایپوکروم یا کم‌رنگ شدن گلبول‌های قرمز به حالتی اشاره دارد که قطر هاله‌ی مرکزی بیش از 1:3 قطر گلبول گردد. همگام با افزایش قطر هاله‌ی مرکزی، پارامتر MCH و در موارد شدید پارامتر MCHC نیز کاهش می‌یابد.

غالب موارد بالینی هایپو کروم با میکروسیت شدن گلبول‌های قرمز نیز همراه است. سفارش می‌شود که درجه هایپوکروم با پارامترMCH هماهنگ باشد. در مواردی که آنالیزور در دسترس نباشد می‌توان با مشاهده گستره محیطی آن را طبق جدول گزارش کرد.

ماکروسیت

گلبول‌های قرمز با قطر بیشتر از 8/5 میکرومتر و MCV بیشتر از 100 فمتولیتر در گروه ماکروسیت جای می‌گیرند. گزارش مرفولوژی ماکروسیت از روی‌داده‌های آنالیزور دقیق‌تر است. گلبول‌های ماکروسیت ممکن است تخم‌مرغی (ماکرواوالوسیت) یا گرد باشند. شکل تخم‌مرغی آن با MCV و MCH بالا و MCHC طبیعی از ویژگی کم‌خونی مگالوبلاستیک است. با دقت در هیستوگرام گلبول‌های قرمز می‌توان گلبول‌های ماکروسیت را از آگلوتیناسیون سرد که هر دو MCV بالای نرمال دارند، تشخیص داد. در آگلوتیناسیون سرد افزایش همزمان MCV و MCH و MCHC مشاهده می‌شود. رتیکولوسیتوز نیز موجب افزایش MCV و مرفولوژی ماکروسیت می‌گردد. توجه به هیستوگرام برای گزارش ماکروسیت گاهی باارزش‌تر از MCV است چون حتی ممکن است در حضور تعدادی از گلبول‌های ماکرواوالوسیت مقدار MCV نرمال گردد. نوزادان در بدو تولد تا حدود یک یا دو هفته دارای مرفولوژی ماکروسیت فیزیولوژیک هستند. برای شیوه‌ی گزارش و درجه‌بندی ماکروسیت و گلبول‌های تخم‌مرغی به جدول توجه کنید.

توجه داشته باشید که در اکثر موارد، حضور ماکروسیت پهنای توزیع حجم (RDW-SD) را افزایش می‌دهد، ولی گاهی ممکن است در این موارد RDW-CV نرمال گزارش گردد. یادآوری می‌شود که در محاسبه‌ی RDW-CV دامنه‌ی توزیع در یک انحراف معیار بر MCV تقسیم می‌شود و چنانچه همزمان پهنای دامنه‌ی حجم و MCV افزایش یافته باشد، مقدارRDW-CV نرمال می‌شود، درحالی‌که مشاهده‌ی گستره‌ی محیطی تغییرات اندازه را به‌وضوح نشان می‌دهد.

میکروسیت

گلبول‌های قرمز میکروسیت دارای قطر کمتر از 7 میکرومتر و MCV کمتر از 80 فمتولیتر می‌باشند و در اکثر موارد هایپوکروم نیز می‌باشند. پارامتر MCV را بایستی با توجه به سن تفسیر کرد. نوزادان دارای MCV بالا و بچه‌ها دارای MCV کمتر از نرمال هستند. توجه به هیستوگرام حجم برای گزارش درجه‌ی میکروسیت اهمیت دارد، زیرا گاهی در حضور جمعیت میکروسیت ممکن است MCV نرمال گزارش شده باشد. برخی از آنالیزورها درصد گلبول‌های میکرو (کمتر از 60 فمتولیتر) و درصد گلبول‌های هایپو (MCH) کمتر از 17 پیکوگرم را گزارش کرده و فرمول‌هایی برای افتراق آنمی فقر آهن از سندرم‌های تالاسمی ماینور که هر دو نمای میکروسیت و هایپوکروم دارند، ارائه نموده‌اند. گفتنی است که فرمول‌های یادشده تنها جنبه‌ی آکادمیک داشته و برای تشخیص‌های افتراقی نیاز به آزمایش‌های اختصاصی‌تر است. پارامترهای RDW-CV با توجه به اینکه حاصل تقسیم انحراف حجم بر MCV است، ممکن است در شخصی که دامنه توزیع نرمال با کاهش MCV دارد به دلیل کاهش مخرج کسر، به‌طور کاذب افزایش یابد.

گلبول‌های قرمز پلی‌کروماژی

رتیکولوسیت پس از اقامت 72-48 ساعته در مغز استخوان بخشی از رشته‌های خود را از دست داده و از آن پس وارد خون محیطی می‌شود که پس از 24 ساعت با از دست دادن تمام رشته‌ها و ریبوزوم‌ها و میتوکندری به گلبول قرمز مقعرالطرفین با عمر 120 روز تبدیل می‌شود. به رتیکولوسیت‌های نارس که با رنگ‌های رومانوفسکی به رنگ مخلوط قرمز و آبی درمی‌آیند، پلی‌کروماژی گفته می‌شود. حضور این گلبول‌ها بیانگر خونریزی و یا همولیز حاد و مزمن است که نیاز به مطالعه گستره را الزامی می‌کند. گلبول‌های پلی‌کروماژی بزرگ‌تر از گلبول قرمز بوده و فاقد هاله مرکزی هستند. گفتنی است که انکلوزیون حلقه کابوت در این نوع گلبول‌ها را می‌توان به‌راحتی جستجو کرد. سفارش می‌شود که با مشاهده پلی‌کروماژی آن را درجه‌بندی کرده و شمارش رتیکولوسیت را انجام دهیم و در ضمن برای تصحیح شمارش رتیکولوسیت از فرمول RPI (اندکس تولید روزانه رتیکولوسیت) استفاده گردد که زمان بلوغ رتیکولوسیت‌ها را دربر می‌گیرد.