متدهای کونژوگاسیون آنتی‌بادی‌ها و مصارف درمانی آنتی‌بادی‌های کونژوگه شده

 متدهای کونژوگاسیون آنتی‌بادی‌ها و مصارف درمانی آنتی‌بادی‌های کونژوگه شده

نویسنده: جواد سنچولی

دانشجوی رشته ایمونولوژی، مقطع دکترای تخصصی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد

E.mail: sanchoolij921@mums.ac.ir

 خلاصه

آنتی‌بادی‌ها به عنوان ماکرومولکول‌های بزرگ در تشخیص و درمان موردتوجه هستند. تمام آنتی‌بادی‌ها و ساب‌کلاس‌های متعدد آنها از واحدهای حفاظت شده دومینی تشکیل شده‌اند که اساس فعالیت‌های بیولوژیک آنها خواهد بود. اتصال عوامل نشانه (فلورسنس، رادیواکتیو، آنزیم و داروها) به بنیان‌های مختلف آمینی، کربوهیدراتی، دی‌سولفیدی و یا تلفیقی از هر دو بنیان در انواع آنتی‌بادی‌ها به روش‌های متنوع آزمایشگاهی صورت خواهد گرفت که کاربردهای متنوعی را برای این آنتی‌بادی‌های کونژوگه ایجاد خواهد کرد. در این مقاله مروری سعی شده است تا بطور خلاصه روش‌های متنوع کونژوگه نمودن آنتی‌بادی‌ها و برخی مصارف بالینی آنها ذکر گردد.

واژه‌های کلیدی: کونژوگاسیون، آنتی‌بادی، درمان

مقدمه

امروزه آنتی‌بادی‌ها کاربردهای بسیاری در سلامتی و غلبه ما بر بسیاری از بیماری‌های صعب‌العلاج دارند. روش‌های متعددی برای کونژوگاسیون (‌آنتی‌بادی‌ها) با واسطه آنزیم وجود دارد مانند:

1. اتصال از طریق گروه‌های آمینو از آنتی‌بادی و آنزیم
2. اتصال از طریق گروه‌های قندی از آنزیم و آمینو از آنتی‌بادی
3. اتصال از طریق گروه‌های آمینو از آنزیم و –SH از آنتی‌بادی

در واقع گلیکوپروتئین‌هایی مانند HRP، گلوکز اکسیداز و اکثر آنتی‌بادی‌ها در اثر وجود برخی نمک‌ها مانند پریودات، فعال شده و آماده اتصالات کووالان به مولکول‌های دیگر می‌شوند. در مراحل بعد تخلیص آنتی‌بادی‌ها به روش‌های متعدد ایمونوشیمی (ژل فیلتراسیون) می‌تواند انجام شود.

• اتصال از طریق گروه‌های آمینو از آنتی‌بادی و آنزیم با استفاده از روش گلوتارآلدهید
• به روش یک مرحله‌ای و دو مرحله‌ای انجام می‌شود. در روش یک مرحله‌ای هر دو پروتئین بطور همزمان با گلوتارآلدهید مواجه می‌شوند اما در روش دو مرحله‌ای یکی از پروتئین‌ها با گلوتارآلدهید مواجه و پس از حذف عامل جفت کننده (گلوتارآلدهید)، پروتئین دوم افزوده می‌شود. به ویژه زمانی از این روش استفاده می‌شود که آنزیم اول HRP باشد زیرا محتوای آمینی این آنزیم پایین بوده و کنترل واکنش تسهیل می‌شود.
• اتصال از طریق گروه‌های قندی از آنزیم و آمینو از آنتی‌بادی

گلیکوپروتئین‌هایی مانند: HRP، گلوکز اکسیداز و اکثر آنتی‌بادی‌ها در اثر نمک پریودات، فعال شده و آماده اتصالات کووالان به مولکول‌های دیگر می‌شوند. این عمل موجب تبدیل گروه‌های قندی به آلدهیدی فعال می‌شود که مستعد اتصال به گروه آمین یا هیدرازین می‌شوند. جهت جلوگیری از اتصال مولکول‌های آنزیم به یکدیگر از DNFB استفاده می‌شود که گروه آمینی در حلقه بنزنی قرار گرفته و بلوکه می‌شود (تصویر 1-1).

اکسیداسیون گروه‌های قندی در آنزیم بوسیله پریودات، منجر به تبدیل آنها به گروه‌های آلدهیدی می‌شود. اتم کربن در آلدهید نقصان الکترون داشته و به گروه آمینی حمله نوکلئوفیلی می‌کند. بعد از اضافه کردن آنتی‌بادی، اتصال با این پروتئین واجد آمین تحت شرایط قلیایی صورت گرفته و منجر به تشکیل واسطه‌های شیف– باز یا ایمن می‌شود.

• روش Nakane در تهیه کونژوگه HRP-IgG

5 mg از آنزیم HRP در بافر سدیم بیکربنات حل می‌شود، سپس جهت بلوکه کردن گروه‌های آمینی آنزیم از محلول DNFB به مدت یک ساعت استفاده می‌نماییم و بعد از آن به مدت 30 دقیقه با محلول سدیم پریودات مجاور می‌کنیم. جهت بی‌اثر نمودن باقیمانده پریودات از محلول 0.16M اتیلن گلیکول به مدت یک ساعت استفاده می‌نماییم. این مجموعه را توسط بافر بی‌کربنات در PH:95 دیالیز نموده و با IgG به نسبت 1 به 4 جهت انجام واکنش کونژوگاسیون مخلوط می‌نماییم. مجموعه جدید دوباره توسط بافر فسفات دیالیز شده و با روش ژل فیلتراسیون توسط سفادکس G-100 or G-200)) تخلیص می‌شود.

• کونژوگاسیون آنتی‌بادی با استفاده از (SMCC succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate)

در این روش آنزیم از طریق گروه آمینو خود با smcc وارد واکنش شده و مشتق فعالی از آنزیم به نام میل–ایمید، ایجاد می‌شود. این شکل فعال آنزیم با گروه سولفیدریل آزاد در پروتئین دیگر از جمله آنتی‌بادی، اتصال کووالان برقرار می‌کند و منجر به اتصال محکم دو پروتئین می‌شود.

• کونژوگه گروه آمینی در مولکول آنتی بادی با بیوتین

مشتق بیوتین موردنظر را در DMSO حل می‌نماییم و به آنتی‌بادی موردنظر مطابق پروتوکل موجود اضافه می‌نماییم و نهایتاً کونژوگه آنتی‌بادی با بیوتین را با استفاده از روش ژل فیلتراسیون تخلیص می‌نماییم.

• مصارف آنتی‌بادی‌های کونژوگه
• 1: آنتی‌بادی‌های مونوکلونال کونژوگه در درمان سرطان

آنتی‌بادی‌های مونوکلونال کونژوگه واکنش دهنده با آنتی‌ژن‌های سطح، از طریق فعال کردن سیتوتوکسیسیتی وابسته به کمپلمان و سیتوتوکسیسیتی وابسته به آنتی‌بادی موجب تعدیل رشد تومور می‌شوند.

2: آنتی‌بادی‌های مونوکلونال کونژوگه با سموم (ایمونوتوکسین‌ها)

آنتی‌بادی‌های کونژوگه با سموم گیاهی یا میکروبی هستند که اول بار به عنوان گلوله‌های جادویی نامگذاری شدند. با توجه به اختصاصیت بالای آنها، می‌توانند عوامل سمی و توکسیک را به سلول‌های توموری رسانده و موجب مرگ این سلول‌ها شوند. این مولکول‌ها به آنتی‌ژن‌های سطح سلول (که به درون سلول می‌روند) متصل می‌شوند و با ممانعت کاتالیتیک از سنتز پروتئین‌ها در سیتوزول موجب مرگ سلول‌ها می‌شوند. درمان تومورهای جامد توسط ایمونوتوکسین‌ها به علت وجود اتصالات سخت بین سلول‌های توموری، فشار بالای مایع میان بافتی و ذخیره خون ناهمگن، مورد بحث و مجادله است.

3: رادیوایمونوتراپی با آنتی‌بادی مونوکلونال کونژوگه با ماده رادیواکتیو

امروزه از آنتی‌بادی‌های کونژوگه با مواد رادیواکتیو جهت تشخیص انواع سرطان‌ها و درمان استفاده می‌شود. به سبب حساس بودن سرطان خون و لنفوما به مواد رادیو اکتیو، رادیوایمونوتراپی برای بدخیمی‌های هماتولوژیک بیشتر نسبت به تومورهای بافت جامد مؤثر است، نمونه‌هایی از این آنتی‌بادی‌های کونژگه و کاربرد آنها در سرطان در جدول زیر آورده شده است:

محلول کونژوگه	تومور موردنظر	میزان کارآیی کونژوگه
131Ianti-B1 (anti- CD20) antibody	B-cell lymphoma	Four of the ten patients with complete remissions
131I-tositumomab	Low-grade B-cell non-Hodgkin’s lymphomas (Multicenter phase II study)	One third of patients had a complete remission
131I-tositumomab	Follicular Lymphoma	Prolonged clinical and molecular remissions
90Y-ibritumomab tiuxetan	Follicular, or transformed B-cell non-Hodgkin’s lymphoma	Well tolerated and produces statistically and clinically significant higher overall response rate and complete remission
90 Y-Ibritumomab tiuxetan	relapsed or refractory non-Hodgkin lymphoma	Safe and well tolerated
90Y-ibritumomab tiuxetan	advanced follicular lymphoma (Phase III trial)	Highly effective with no unexpected toxicities
90Y-ibritumomab tiuxetan and 131I-tositumomab	non-hodgkin lymphoma (a phase II multicenter trial)	(40.9%) had treated patients
90 Y-Ibritumomab Tiuxetan	non-Hodgkin’s lymphoma	Confirmed to be useful in assessing treatment response

4: درمان مؤثر سرطان با کونژوگه‌های مبتنی بر نانوبادی

نانوبادی‌ها کوچکترین قطعات حاصل از آنتی‌بادی در حد یک دومین زنجیره با وزن مولکولی 15KD بوده که فاقد یک زنجیره سبک کامل می‌باشند. این مولکول‌ها بسیار پایدار هستند و میل پیوندی بسیار بالایی برای آنتی‌ژن‌های توموری دارند و می‌توانند با آنزیم‌های میکروبی مانند بتالاکتاماز میکروب E.coli کونژوگه شوند. این مولکول‌های کوچک بعد از نفوذ به سلول می‌توانند موجبات تخریب سلول‌های توموری را فراهم کنند.

نتیجه و بحث  

ساختار پروتئینی آنتی‌بادی و وجود بنیان‌های حاوی N و O در آنها، امکان اتصال کربوهیدرات‌ها در سیستم گلژی درون سلولی را فراهم نموده است. با الگوبرداری از این اتصالات، در محیط آزمایشگاه، پدیده کونژوگه نمودن آنتی‌بادی با سموم، داروها، مواد رادیواکتیو و فلورسنت‌ها فراهم شده است.

آنتی‌بادی با ساختار 4 زنجیره‌ای کامل و کونژوگه شده با دارو و یا سم، دارای فعالیت بیولوژیکی رایج خود بوده و این امکان برای آن است که پس از اتصال با آنتی‌ژن توموری که بطور اختصاصی صورت می‌پذیرد، سیستم کمپلمان را بر روی سلول توموری فعال نماید یا اینکه سلول‌های کشنده ایمنی را بواسطه اپسونیزه شدن سلول توموری به ناحیه مربوطه جلب کند و موجب مرگ سلول توموری شود. امروزه این آنتی‌بادی‌ها توانایی ایجاد پدیده آپوپتوز در سلول‌های سرطانی را نیز دارند و در بالین مورد استفاده قرار می‌گیرند. ساخت گلوله‌های جادویی، راه آغازین برای استفاده از این مولکول‌های کوچک در پزشکی و تشخیص بود. آنتی‌بادی کونژوگه با سم برضد آنتی‌ژن CD5 بر سطح سلول‌های لنفوسیتی در بیماری Acute GVHD، یک نمونه از بسیاری از تلاش‌های صورت گرفته در این بخش می‌باشد.

آنتی‌بادی‌های کونژوگه شده با مواد رادیواکتیو مانند ید 131 نیز در تشخیص بسیاری از تومورها و سرطان‌ها استفاده می‌شوند، به عنوان مثال در لنفومای لنفوسیتی B، از آنتی‌بادی ضد CD20 که با ید 131 کونژوگه شده است استفاده می‌شود. مطالعات و پژوهش‌ها در جهت ساخت آنتی‌بادی‌های مؤثر علیه آنتی‌ژن‌های درون سلولی و عبور این مولکول‌ها از سدهای سلولی منجر به ساخت نانوبادی‌ها شد. این مولکول‌ها نیز با مواد دارویی و تشخیصی کونژوگه شده و مورد استفاده قرار گرفته‌اند.

:References

1. Monoclonal antibody drug conjugates in the treatment of cancer Trail and Bianchi, Current Opinion in Immunology 1999, 11:584–588
2. Antibody Conjugates for Cell Biology, Contributed by Rosaria P. Haugland,Current Protocols in Cell Biology (2000) 16.5.1-16.5.22
3. Targeted delivery of cytotoxic agents: direct conjugation to antibodies and pretargeting approaches. Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Cornelia Halin Winter (co-examiner) 2013
4. Theoretical debates in immunocytochemistry, Research Center of Iranian Blood Transfusion Organization,1387
5. Advances in Bioconjugation, Jeet Kalia1,2 and Ronald T. Raines1,3:Curr Org Chem. 2010 January ; 14(2): 138–147.
6. Efficient Cancer Therapy with a Nanobody-Based Conjugate, Virna Cortez-Retamozo,1 Natalija Backmann,1 Peter D. Senter,2 Ullrich Wernery,3 Patrick De Baetselier,1Serge Muyldermans,1 and Hilde Revets1, CANCER RESEARCH 64, 2853–2857, April 15, 2004
7. Monoclonal antibody immunoconjugates for cancer treatment ,R.W. Baldwin and V.S. Byers:Current Opinion in immunology 1989, 1:891494
8. Novel Antibody-Based Proteins for Cancer Immunotherapy ,Jaheli Fuenmayor * and Ramon F. Montaño * Cancers 2011, 3, 3370-3393.
9. Antibody therapy of cancer, www.nature.com/reviews/cancer, APRIL 2012 | VOLUME 12
10. Shokrollah Farrokhi, Mohammad Reza Ravanbod,Shahram Amiri,Iraj Nabipour, Majid Assadi; Radioimmunotherapy-based treatment of cancer ; Iran J Nucl Med 2012, Vol 20, No 1 (Serial No 37)

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید