کریسپر

معرفی تکنولوژی جدید ویرایش ژنومی با نام کریسپر

مرجان حیدرزاده

عضو هیئت علمی گروه بیولوژی پژوهشکده صنایع غذایی و کشاورزی پژوهشگاه استاندارد

 

سیستم کریسپر

تناوب‌هایِ کوتاهِ پالیندرومِ فاصله‌دارِ منظمِ خوشه‌ای  (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) یا به اختصار CRISPR  بخشی از DNA  پروکاریوت هستند که حاوی تناوب‌های کوتاهِ توالی‌های بنیادین هستند. کریسپر نوعی سیستم ایمنی تطابق‌پذیر در باکتری‌ها است که آن‌ها را قادر به کشفDNA  ویروس و بُعد نابودیشان می‌کند. بخشی از سیستم کریسپر، پروتئینی به نام  Cas9است که قابلیت جستجو، برش‌زدن و سرانجام استحالهٔ DNA ویروس را به روشی خاص دارد. فناوری کریسپر به دانشمندان اجازه می‌دهد، تغییراتی در DNA سلول‌ها ایجاد کنند.

توانایی ویرایش دقیق و هدفمند هر نقطه‌ای از ژنوم موجودات برای سال‌های طولانی آرزوی دانشمندان بوده است. با کشف سیستم CRISPR/Cas9 ابزاری برای اصلاح ژن در اختیار دانشمندان قرار گرفت که در دنیا هیاهویی ایجاد کرده است. این ابزار، سریع، ارزان و بسیار دقیق‌تر از تکنیک‌هایی است که قبلاً برای ویرایش ژن استفاده می‌شده و دارای طیف گسترده‌ای از برنامه‌های کاربردی بالقوه است. CRISPR/Cas9 تکنولوژی منحصربه‌فردی است که این امکان را ایجاد می‌کند تا بتوان با حذف، اضافه کردن یا جایگزین کردن، بخشی از ژنوم را ویرایش نمود. این روش در حال حاضر روشی ساده، دقیق و تطبیق‌پذیر برای دست‌ورزی ژنتیکی است.

ویرایش ژنوم بر اساس سیستم CRISPR/Cas9 یک ابزار کارآمد و با پتانسیل است که قابلیت کنار زدن و جایگزینی با روش‌های قدیمی مانند Finger Zinc و TALEN را دارد.

 

تاریخچه سیستم کریسپر

در سال 1987،Nakata  و همکارانش حین مطالعه بر روی آنزیم iap متوجه شدند که در پایین‌دست این ژن، توالی‌های تکراری و غیرتکراری وجود دارد. مطالعات در سال 2002 نشان داد که این قسمت‌های تکراری به‌صورت پالیندرومی هستند و همچنین به‌طور متناوب تکرار شده‌اند و به‌وسیله قســــــمت‌های غیرتکراری به نام  spacer از هم جدا شده‌اند که اســــم این نوع آرایش ژنی را CRISPR گذاشتند که مخفــــــــف
Clustered Regular Interspaced short Palindromic Repeat است.

 

مکانیسم عمل کریسپر

برای اولین بار CRISPR به‌عنوان یک سیستم ایمنی میکروبی در باکتری‌ها و آرکئی‌ها شناخته شد که توسط این سیستم این موجودات، ایمنی اکتسابی را علیه ویروس‌ها و پلاسمیدهای مهاجم کسب می‌کنند.

در هنگام ورود DNA خارجی مهاجم به درون باکتری، این DNA توسط آنزیم‌های نوکلئازی Cas شکسته می‌شود و سپس بخشی از آن در جایگاه کریسپری و بین دو توالی تکراری قرار می‌گیرد که در این حالت به آن spacer گفته می‌شود. توالی‌های spacerبه‌عنوان الگوهایی به‌منظور تولید توالی‌های RNA کوتاه کریسپری (crRNA) مورد استفاده قرار گرفتـــــــــه و کمپلکســـــــــــــــــــــــــی را با مولکول (trans- activating- CrRNA) tracrRNA تشکیل می‌دهد. این دو توالی به همراه هم به‌عنوان یک توالی راهنما، پروتئین Cas9 را به سمت DNA مهاجم هدایت می‌کنند. به‌محض اتصال پروتئین Cas9 به DNA  مهاجم، این پروتئین توالی  DNA خارجی مکمل crRNA  و توالی مقابل آن را به ترتیب از طریق دومین‌های نوکلئازی NHN وLike-RuvC1  می‌برد.

طبقه‌بندی Makarova  و همکاران ۵ نوع سیستم کریسپر را تعریف می‌کند که دارای ۱۶ زیرنوع بر اساس ویژگی‌های مشترک و شباهت تکاملی است. این‌ها به دو دسته بزرگ تقسیم می‌شوند. کلاس‌ها بر اساس ساختار پیچیده‌ای است که DNA ژنوم را تجزیه می‌کند. در گام بعدی از روی ژن‌های کمپلکس cas هم پروتئین Cas9 ساخته می‌شود. سپس کمپلکس Cas9-crRNA-tracrRNA تشکیل می‌شود که این کمپلکس برای هدف قرار دادن یا تخریب  DNA خارجی، لازم و ضروری است.

در CRISPR نوع I و III، رونوشت pre-CrRNA توسط ریبونوکلئازهای مرتبط با CRISPR، شکسته می‌شوند و این کار موجب آزاد شدن چندین CrRNAs کوچک می‌شود. به‌طور متوسط CrRNA نوع III بیشتر در انتهای ´۳ توسط RNaseهایی که هنوز مشخص نشده‌اند برای تولید رونوشت کاملاً بالغ، پردازش می‌شوند. CRISPR نوع II، یک RNA کریسپر فعال‌کننده ترانس است (tracrRNA) که با تکرارهای مستقیم هیبرید می‌شود و یک RNA دوپلکس را تشکیل می‌دهد و توسط  RNase III درونی و نوکلئازهای ناشناخته دیگر شکسته و پردازش می‌شود. ‌CrRNAهای بالغ‌شده نوع I و III سیستم CRISPR، سپس درون افکتورهای کمپلکس‌های پروتئینی برای تشخیص و تخریب توالی هدف، لود می‌شوند.

در سیستم‌های نوع II، کمپلکس هیبرید CrRNA-tracrRNA به Cas9 متصل شده و در واقع هیبرید شدن این دو باعث فعال شدن Cas9 می‌شود. هر دو نوع I و III سیستم CRISPR از چند پروتئین مداخله‌گر تنظیم‌کننده برای تسهیل شناسایی توالی هدف استفاده می‌کنند. در CRISPR نوع I، کمپلکس Cascade با یک مولکول CrRNA لود می‌شود که یک مجموعه نظارتی منحصربه‌فردی است که DNA هدف را شناسایی می‌کند، سپس نوکلئاز Cas3، لوپ R Cascade را بکار گرفته و به آن متصل می‌شود و واسطه تخریب توالی هدف می‌شود.

در CRISPR نوع III، CrRNAها به کمپلکس‌های Csm یا به کمپلکس‌های  Cmrمتصل شده و به ترتیب سوبستراهای DNA و RNA را می‌شکنند. در مقابل، سیستم نوع II فقط نیاز به Cas9 برای تخریب  DNA جفت‌شده با RNA راهنمای دوپلکس خود دارد که این RNA راهنما حاوی ترکیبی از CrRNA-tracrRNA  است.

 

کریسپر ابزاری برای ویرایش ژنوم

سیستم مدرن ویرایش ژنوم به‌صورت هدفمند با استفاده از تکنولوژی Cas9/CRISPR دو جزء دارد:

1- یک اندونوکلئاز

2- توالی RNA کوتاه راهنما

اندونوکلئاز موردنظر، پروتئین اندونوکلئازی Cas9 باکتریایی برگرفته از Streptococcus pyogenes است. نوکلئاز  Cas9دو دومین برنده DNA دارد که شــامل دومین نوکلئــــازی HNH و دومین نوکلئازی Like-RuvC1 است و منــــــــــجر به شکستـــــن DNA دو رشته‌ای به‌صورت بلانت DSB (Double Strand Breaks)  می‌شود. واژه gRNA در این سیستم خاموشی به یک RNA کایمر تک‌رشته‌ای مهندسی‌شده اشاره دارد که هم نقش tracrRNA و هم crRNA  باکتریایی را دارد.

بیست جفت نوکلئوتید آخر انتهای ˊ5 مربوط به gRNA homing device را محقق علیه توالی ژنی موردنظر جهت برش و ویرایش طراحی می‌کند، این توالی 24 نوکلئوتیدی کمپلکس gRNA/Cas9 را به جایگاه ژنی موردنظر درست در بالادست جایگاه PAM از طریق اتصال DNA-RNA هدایت می‌کند. توالی PAM در بین استرین‌های باکتری‌های مختلف و انواع پروتئین‌های Cas CRISPR تفاوت دارد و این توالی برای باکتری Streptococcus pyogenes توالی NGGˊ-5 است و سیستمCas CRISPR قابل استفاده موجود به سمت هر توالی DNA با آدرس ´NGG-N20-5 هدایت شده و به‌صورت کاملاً دقیق موجب شکست DNA به‌صورتblunt  می‌شود.

دو رشته DNA بریده‌شده توسط این سیستم با دو مکانیسم ترمیمی که در تمامی انواع ارگانیسم‌ها یافت می‌شود و مسیر ترمیمی اتصال انتهاهای غیرهمـــولوگ (non- homologous end joining)  NHEJ و مســـیر ترمیمی شباهتی HDR (Homology Directed Repair) نام دارند، ترمیم می‌شود.

مسیر ترمیمی اتصال انتهاهای غیرهمولوگ NHEJ (Non- Homologous End Joining)  در یوکاریوت‌ها یک مکانیسم ترمیمی خطادار است که به‌منظور ترمیم شکست DNA ، در صورت فقدان الگوی ترمیمی مناسب استفاده می‌شود. مسیر NHEJ در جهت اتصال دو رشته برش‌خورده به‌صورت blunt به همدیگر به‌کار گرفته می‌شود، اما در طول این پروسه اغلب موتاسیون‌های حذف یا اضافه (InDels) در جایگاه DSB رخ می‌دهد که موجب تغییر در فریم یا ایجاد کدون ختم در بدنه ژن شده و باعث تغییر دائمی در frame Reading Open می‌شود.

علاوه بر مسیر به روش NHEJ ، سلول‌ها قادر به استفاده از یک مکانیسم ترمیمی بسیار دقیق‌تر با نام ترمیم شباهتی Homology Directed Repair  هستند. از این مکانیسم ترمیمی می‌توان به‌منظور وارد کردن یک تغییر نوکلئوتیدی خاص در DNA  ژنومی استفاده کرد. DNA الگوی مورد استفاده در ترمیم که دارای همولوژی بسیار بالادست و پایین‌دست مکان ژنی موردنظر جهت ترمیم است به همراه Cas9 و gRNA موردنظر به سلول هدف وارد می‌شود.

در صورت وجود این الگوی مناسب، مکانیسم کم‌خطای HDR با انجام نوترکیبی می‌تواند تغییرات دلخواه را در ناحیه شکسته‌شده توسط Cas9 ایجاد کند. وقتی الگوی ترمیمی را طراحی می‌کنید بایستی مطمئن شوید که توالی هدف دقیقاً بعد از توالی PAM نباشد یا توالی PAM جدا شده و یا در آن موتاسیون ایجاد شود. رعایت کردن این موارد از تجزیه الگوی ترمیمی با سیستم Cas9/CRISPR  مشابه جلوگیری می‌کند.

 

کاربردها:

پژوهشگران در چند سال اخیر با بهره‌گیری از فناوری کریسپر (CRISPR) دستاوردهای زیادی داشته‌اند. خبرهای زیادی در مورد موفقیت کریسپر در درمان بیماری‌های مختلف، مقابله با باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک یا حشرات ناقل بیماری منتشر شده است.

1- برای اولین بار پژوهشگران موفق به استفاده از تکنیک ویرایش ژن برای پاک‌سازی ویروس HIV از یک عضو زنده‌ی بدن شدند؛ این روش روی ۳ گونه‌ی مختلف از حیوانات جواب داده است. به کمک کریسپر، تیم تحقیقاتی، DNA ویروس HIV را از DNA بدن جدا نمود و موفق به از بین بردن عفونت‌ها شد.

2- توسعه‌ی اولین موجود زنده‌ی نیمه‌مصنوعی با کمک فناوری کریسپر اتفاق افتاد. این روش با پرورش یک نوع باکتری E. coli با رمز ژنتیکی شش‌حرفی به نتیجه رسیده است؛ اطلاعات ژنتیکی در حالت عادی با ۴ حرف نوشته می‌شوند. با استفاده از کریسپر، پژوهشگران شکل‌گیری DNA‌های مهاجم به‌وسیله‌ی باکتری‌ها را مورد پایش قرار دادند.

3- با استفاده از روش ویرایش محتوای ژنوم، دانشمندان موفق به حذف سلول‌های سرطانی با هدف قرار دادن مرکز فرماندهی سلول‌های سرطانی شدند. در این آزمایش، سلول‌های سرطانی انسانی کبد و پروستات به بدن موش انتقال پیدا کرد و با کمک روش CRISPR/cas9، دانشمندان موفق به از بین بردن سلول‌های همجوش شدند.

4- در تحقیقاتی دیگر، سرعت رشد سلول‌های سرطانی با استفاده از کریسپر کاهش پیدا کرده است. پژوهشگران در این تحقیق به پروتئینی با نام Tudor-SN حمله کردند که در تقسیمات سلولی نقش مهمی دارد.

5- محققین با بهره‌گیری از کریسپر موفق به از بین بردن باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک شدند. در این روش باکتریوفاژها به‌طوری قدرتمند شدند که باکتری‌های مقاوم را مجبور به از بین بردن خود می‌کنند. با تجهیز ویروس‌های میکروفاژ به توالی ژنتیکی که شامل ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک است، دانشمندان نوعی مکانیزم خودتخریبی را در باکتری‌ها ایجاد کردند.

6- انتشار بیماری‌های منتقل‌شده از پشه به انسان مثل زیکا یا مالاریا با استفاده از تکنیک ویرایش ژن CRISPR/cas9 محدود شد. در این روش دانشمندان با استفاده از کریسپر، موفق به شکافت ژن‌های باروری پشه و تغییر چندین رمز ژنتیکی به‌طور هم‌زمان شدند.

7- علائم بیماری ‌هانتینگتون در موش‌ها به‌طور موفقی مدیریت شدند و تا حدی بهبود یافته‌اند. استفاده از این تکنیک در موش‌ها برای درمان این بیماری نادر که سلول‌های مغزی را از بین می‌برد، می‌تواند امید‌ها برای درمان آن در انسان‌ها را افزایش دهد.

8- فناوری کریسپر تنها در دنیای پزشکی کاربرد ندارد؛ به‌تازگی گروهی از دانشمندان با استفاده از این روش موفق به اصلاح و مهندسی ژنتیکی جلبک‌ها شدند. در نتیجه‌ی این عمل تا دو برابر بیشتر سوخت‌های زیستی بر پایه‌ی جلبک بدست می‌آید.

بهبود کیفیت محصولات کلاسیک دام، مانند گاو، طیور و خوک‌ها، توسط مهندسی ژنوم مبتنی بر کریسپر تسریع شده است. دامداران قبلاً مارکرهای کروموزومی مرتبط با صفات شناخته‌شده به‌عنوان صفات کمی را شناخته‌اند و از کمک مارکرها استفاده می‌کنند تا ویژگی‌های ارزشمندی را به‌طور انتخابی پیش‌گویی کنند. این روند با استفاده از فناوری‌های ویرایش ژن، به‌تازگی در خوک‌ها و گاوهای لبنی به ترتیب به‌منظور محافظت در برابر ویروس‌ها و حذف شاخ‌ها، نشان داده شده است.

کاربرد دیگر این سیستم در حیوانات، مهندسی تولید محصولات پزشکی یا تولید بافت است؛ به‌عنوان مثال، اضافه کردنcDNA  آلبومین انسانی به لوکوس آلبومین خوک با استفاده از CRISPR/Cas9 می‌تواند تولید آلبومین را با استفاده از خوک‌های تراریخته فعال کند.

مهندسی فعال کریسپر در محصولات تجاری و مدل‌های آزمایشگاهی برای افزایش عملکرد ایده‌آل، افزایش تحمل به خشکی و افزایش رشد در شرایط محدود مواد غذایی و تولید محصولات با خواص تغذیه‌ای بهبودیافته مورد استفاده قرار می‌گیرد. استفاده از تکنولوژی کریسپر در ذرت و سویا نشان‌دهنده سرعت پذیرش تکنولوژی کریسپر خارج از آزمایشگاه است. هدف قرار دادن ژن مبتنی بر کریسپر نیز می‌تواند برای مبارزه با بیــــــماری‌های گیاهی مورد استفاده قرار گیرد، همان‌طور که برای ویروس leaf curl گوجه‌فرنگی در Nicotiana benthamian نشان داده شده ‌است.

تا به امروز، کاربرد سیستم‌های کریسپر در باکتری‌ها شامل کشت محصولات صنعتی علیه ویروس‌ها، کنترل جذب و انتشار ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک توسط باکتری‌ها و کشت‌های پروبیوتیک مهندسی می‌باشند. موفقیت تجاری سیستم ایمنی طبیعی کریسپر برای واکسیناسیون استرپتوکوکوس ترموفیلوس که از آن در فراورده‌های لبنی استفاده می‌شود (ماست و پنیر)، راه را برای این سیستم در تغذیه راه‌اندازی کرده است. کار اخیر نیز ثابت کرده است که مفهوم تولید باکتری مفید این است که در برابر جذب و انتشار ژن‌هایی که مقاومت آنتی‌بیوتیکی را رمزگذاری می‌کنند، ایمن می‌شود.

فناوری کریسپر تأثیر گسترده‌ای بر تمامی صنایع مربوط به باکتری‌ها، قارچ‌ها و مخمرها خواهند داشت، چرا که ما درصدد استفاده گسترده از این ویرایش‌کننده ژنوم در این ارگان‌ها هستیم. احتمالاً CRISPR/Cas9 برای مهندسی باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌های صنعتی برای تولید مواد شیمیایی سبز، از جمله سوخت‌های زیستی و مواد بیولوژیکی استفاده می‌شود.

9- در جدیدترین تحقیق صورت‌گرفته، دانشمندان به لطف کریسپر موفق به ذخیره‌سازی تصویری متحرک در DNA سلول باکتری زنده‌ی E. coli شدند. این آزمایش اولین قدم به سمت فهم محدودیت‌ها و ایجاد فضاهای ذخیره‌سازی بیولوژیک به‌حساب می‌آید.

در کنار این تحقیقات می‌توان به آزمایش‌های دیگری چون ویرایش ژنتیکی جنین انسانی اشاره کرد که امیدها را برای کاهش و کنترل بیماری‌ها در آینده افزایش می‌دهد. البته نباید فکر کرد که کریسپر عوارض جانبی ندارد؛ ممکن است استفاده از کریسپر باعث بروز جهش‌های ژنتیکی ناخواسته ‌شود.

 

آزمایش‌های انسانی

کریسپر یک روش درمانی با استفاده از دستکاری ژنتیکی است و همین امر موجب شده تا شبهات اخلاقی بسیاری در این زمینه بوجود آید که پاسخ به آنها کار راحتی نخواهد بود؛ البته به علت وجود فواید بسیار زیاد و همچنین کمک شایانی که این روش درمانی به بهبود سطح سلامت انسان می‌کند می‌توان از این سؤالات چشم‌پوشی کرد.

به‌عنوان مثال، در حال حاضر این فناوری خطرات بسیاری دارد. علی‌رغم همه وعده‌هایی که به‌واسطه تکنیک کریسپر داده شده، این فناوری کامل و بی‌نقص نیست و دانشمندان هنوز باید روی آن کار کنند تا به‌قدری بی‌خطر باشد که روی انسان کاربرد پیدا کند.

چینی‌ها همین الان کار روی انسان را آغاز کرده‌اند و فناوری CRISPR-Cas9  در حال آزمایش روی انسان است.

البته، این بدان معنا نیست که چینی‌ها مسئولیتی در قبال اخلاقیات نمی‌پذیرند. آزمایش مذکور روی بیماران مبتلا به سرطانی انجام پذیرفته که همه راه‌ها را پیموده‌اند و حالا تنها امیدشان زنــــــده ماندن به شیوه CRISPR-Cas9 است و آزمایش مشابهی نیز قرار است در آمریکا انجام شود که البته هنوز تأییدیه سازمان غذا و دارو را دریافت نکرده است.

دولتمردان هنوز نمی‌دانند که آیا این فناوری می‌تواند تمام بیماری‌های ژنتیکی را از بین ببرد و حتی در برابر دیگر بیماری‌ها نیز ایمنی ایجاد کند یا خیر. کسب رضایت آن‌ها احتمالاً چندین سال به طول می‌انجامد. زمانی که قوانین به نفع دانشمندان تغییر کند، می‌توان در انتظار تغییرات بزرگی ماند.

 

References:

1- Barrangou R (2015). “The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond”. Current Opinion in Immunology. 32: 36–41. doi:10.1016/j.coi.2014.12.008. PMID 25574773.

2- Redman M, King A, Watson C, King D (August 2016). “What is CRISPR/Cas9?”. Archives of Disease in Childhood. Education and Practice Edition. 101 (4): 213–5. doi:10.1136/archdischild-2016-310459. PMC 4975809. PMID 27059283.

3- Mohanraju P, Makarova KS, Zetsche B, Zhang F, Koonin EV, van der Oost J (2016). “Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems”. Science. 353 (6299): aad5147. doi:10.1126/science.aad5147. PMID 27493190

4- Hille F, Richter H, Wong SP, Bratovič M, Ressel S, Charpentier E (March 2018). “The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward”. Cell. 172 (6): 1239–1259. doi:10.1016/j.cell.2017.11.032. PMID 29522745

5- Mojica FJ, Montoliu L (2016). “On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals”. Trends in Microbiology. 24 (10): 811–20. doi:10.1016/j.tim.2016.06.005. PMID 27401123

6- Mojica FJ, Rodriguez-Valera F (2016). “The discovery of CRISPR in archaea and bacteria”. The FEBS Journal. 283 (17): 3162–9. doi:10.1111/febs.13766. PMID 27234458.

7- Charpentier E, Richter H, van der Oost J, White MF (May 2015). “Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity”. FEMS Microbiology Reviews. 39 (3): 428–41. doi:10.1093/femsre/fuv023. PMC 5965381. PMID 25994611.

ژنومیکس و کاربرد آن در تشخیص بیماری‌ها (2)

ژنومیکس و کاربرد آن در تشخیص بیماری‌ها

 برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

پاسخی قرار دهید

ایمیل شما هنوز ثبت نشده است.