پیروسکوئنسینگ

Pyrosequencing

پیروسکوئنسینگ

 دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا…(عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (دانشیار دانشگاه)

 

پیروسکوئنسینگ[۱] یک تکنیک جدید تعیین توالی DNA بر پایۀ ساخت زنجیره و بر اساس بیولومینومتری غیرمستقیم[۲] می‌باشد. در این تکنیک توالی قطعه موردنظر با استفاده از سیستم آبشار آنزیمی در زمان واقعی[۳] تعیین می‌شود. در این سیستم چهار آنزیم (قطعه کلنو فاقد فعالیت اگزونوکلئازی، آپیراز، ATP سولفوریلاز و لوسیفراز) با سوبسترای خاص خود استفاده می‌گردد.

 

مکانیسم توالی‌خوانی:

طبق پروتکل کاری، چهار نوکلئوتید به‌طور متوالی به محلول واکنش اضافه می‌شوند. اگر نوکلئوتیدی مکمل الگو بود، به زنجیرۀ در حال ساخت اضافه شده و یک مولکول پیروفسفات آزاد می‌شود. PPi و آدنوزین ‘۵ فسفوسولفات (APS) به‌عنوان سوبسترای آنزیم ATP سولفوریلاز می‌باشند که نتیجۀ این واکنش تولید ATP می‌باشد. آنزیم دیگر این مجموعه یعنی لوسیفراز از ATP و لوسیفرین استفاده کرده، اکسی‌لوسیفرین، AMP، Ppi و نور تولید می‌کند. این نور توسط دستگاه لومینومتر[۴] یا وسایل مشابه اندازه‌گیری می‌شود. میزان نور حاصل بستگی به تعداد نوکلئوتید اضافه شده به پرایمر دارد. همین موضوع موجب شده که تکنولوژی تعیین توالی Pyro به روش تعیین توالی کمّی منحصر به فردی تبدیل شود. نوکلئوتیدهای اضافه، قبل از اضافه شدن نوکلئوتید بعدی، توسط آنزیم آپیراز[۵] موجود در واکنش از بین می‌روند. استفاده از یک پیکومول DNA موجب تولید  مولکول ATP، از اتصال یک نوکلئوتید به رشتۀ الگو می‌شود. در نتیجه در حالت فوق در اثر اتصال یک نوکلئوتید،  فوتون با طول‌موج ۵۶۰ نانومتر تولید می‌گردد. این میزان نور تولیدی، به‌راحتی با دیودهای نوری، فتومولتی‌پلایر و یا دوربین CCD قابل اندازه‌گیری است (شکل ۱).

پیروسکوئنسینگ دارای مزایایی از جمله صحت بالا، انعطاف‌پذیری، آزمایش همزمان چندین نمونه، و اتوماسیون آسان می‌باشد. در این روش به لکه‌گذاری، الکتروفورز و یا هر تکنیک دیگری برای جداسازی قطعات نیاز نیست (برخلاف روش ختم زنجیره[۶] (روش سانگر) که نیاز به الکترفورز پلی‌آکریل آمید دارد) و بنابراین سریع‌تر از روش ختم زنجیره است. همچنین در این تکنیک از پرایمرها و نوکلئوتیدهای نشاندار استفاده نمی‌شود. این تکنیک برای تعیین توالی DNA، تعیین توالی cDNA، تعیین جهش‌های ژنی دخیل در بیماری، تعیین تیپ میکروب‌ها و تعیین ژنوتیپ SNP کاربرد دارد. این تکنیک اخیراً با بکارگیری پروتئین متصل‌شونده به DNA تک‌رشته‌ای[۷] (SSB) بهتر شده است، زیرا این پروتئین مانع از تشکیل ساختار دوم در DNA الگو می‌شود.

در هر دور آزمایش این روش، تنها تا ۱۵۰ جفت باز را می‌توان تعیین توالی کرد که شاید گرچه در نگاه اول کم‌اهمیت‌تر از روش ختم زنجیره با ۷۵۰ توالی‌یابی در هر دور آزمایش به نظر برسد، اما این مزیت در این روش وجود دارد که قابلیت ماشینی شدن را دارد؛ بنابراین با این روش توالی‌ها بسیار سریع‌تر از روش ختم زنجیره ایجاد می‌شوند که این موضوع نشان می‌دهد چرا این روش، به‌تدریج، روش ترجیحی برای پروژه‌های ژنومی می‌شود.

پیروسکوئنسینگ

 

شکل ۱: تصویر شماتیک از فعالیت آنزیمی در تکنیک پیروسکوئنسینگ

DNA الگو و پرایمر و چهار آنزیم موردنیاز این تکنیک، به چاهک پلیت میکروتیتر اضافه می‌شود. چهار نوکلئوتید مختلف طی مراحل مجزا، به واکنش اضافه می‌شود. نوکلئوتید به الگو متصل شده و واکنش با کمک آنزیم‌های ATP سولفوریلاز و لیگاز ادامه پیدا می‌کند. نوکلئوتیدها به‌طور مدام توسط آنزیم آپیراز تجزیه می‌شوند تا اجازۀ افزودن نوکلئوتید بعدی داده شود. (d)XMP شامل AMP و dNMP است

روش پربازده سازی پیروسکوئنسینگ:

معمولاً برای استفاده از این روش در سطح وسیع و توالی‌یابی DNA ژنومی، ابتدا ژنوم را به قطعات بین ۳۰۰ تا ۵۰۰ جفت بازی می‌شکنند. سپس به دو انتهای هر قطعه، یک آداپتور وصل می‌کنند. نقش اول این آداپتورها در وهله اول این است که DNA را به ذرات فلزی وصل کنند؛ بدین طریق که سر یکی از این آداپتورها، در سمت ‘۵ رشته، بیوتینیله شده است که می‌تواند به ذرات پوشیده شده با استرپتوآویدین متصل شود (بیوتین تمایل بالایی برای اتصال به استرپتوآویدین دارد). نسبت قطعات DNA به این ذرات به نحوی تنظیم می‌شود که به‌طور متوسط یک قطعه به یک ذره وصل می‌گردد. در مرحله بعد این قطعات توسط PCR تکثیر می‌شوند تا تعداد نسخه کافی برای تعیین توالی، تولید شود. آداپتور در این مرحله نقش دوم خود به‌عنوان جایگاه اتصال پرایمر را ایفا می‌کند و چون آداپتورهای همه قطعات یکسانند از یک جفت پرایمر یکسان می‌توان برای همه قطعات استفاده کرد.

مسلماً اگر PCR بلافاصله انجام بگیرد تنها چیزی که بدست می‌آید مخلوطی از همه محصولات خواهد بود که برای بدست آوردن توالی هر قطعه مناسب نیست. به‌منظور حل این مشکل، PCR در یک امولسیون روغنی انجام می‌گیرد که در آن، هر ذره به همراه قطره آبکی مربوط به خودش درون امولسیون قرار می‌گیرد. هر قطره آبکی تشکیل شده است از کل مواد موردنیاز برای  PCR و به‌صورت فیزیکی توسط سدی که امولسیون فراهم می‌کند، از سایر قطره‌ها جدا شده است.
بعد از انجام PCR، این قطعات آبکی به چاهک‌های یک نوار پلاستیکی منتقل می‌شوند، به‌نحوی‌که تنها یک قطره (یعنی محصول یک PCR) در هر چاهک قرار می‌گیرد، سپس واکنش پیروسکوئنسینگ، در هر چاهک انجام می‌شود.

 

تعیین ژنوتیپ SNP با استفاده از تکنولوژی پیروسکوئنسینگ:

این تکنولوژی توسط یک شرکت سوئدی به نام Biotage AB به‌صورت تجاری درآمد. این شرکت مجموعه‌ای از مواد، نرم‌افزار،‌ دستگاه و سیستم‌ها را برای آزمایش بر روی ۹۶ نمونه به‌طور موازی و بر روی فاز جامد تولید و عرضه نموده است. این روش‌ها، برای آماده‌سازی و انجام آزمایش به‌صورت سریع[۸] طراحی شده‌اند. همچنین این روش طوری است که قابلیت اتوماتیک شدن را داراست. نرم‌افزار آن نیز طوری طراحی شده است که بتواند انواع SNP و جهش‌ها را در نقاط مختلف و همچنین در نمونه‌های مختلف، به‌طور همزمان شناسایی کند[۹]. این نرم‌افزار همچنین قابلیت تشخیص چندین SNP در یک نمونه، بررسی حذف و اضافه، مطالعه کمّی فراوانی آلل و تعیین ژنوتیپ قطعات کوچک در حد ۴۰-۲۰ بازی را دارد. در این تکنیک احتیاجی نیست که انتهای ‘۳ پرایمر در نزدیکی SNP قرار گیرد. این انعطاف‌پذیری پرایمر، یک مزیت برای این روش محسوب می‌شود.

در این بخش مراحل آماده‌سازی الگو، پیروسکوئنسینگ و نحوۀ استفاده از این تکنیک در آنالیز SNP بیان می‌شود.

 

اندازه‌گیری فراوانی آلل

سه موضوع مهم مطرح در نقشه‌برداری ژنتیکی بر پایه SNP عبارت است از: هزینه تعیین ژنوتیپ در سطح گسترده، صحت اندازه‌گیری و امکان بکارگیری تعیین هاپلوتیپ مستقیم (مولکولی) به‌منظور افزایش قدرت پیشگویی.

مطالعات عدم پیوستگی بر روی نمونه افراد، نیاز به تعیین ژنوتیپ وسیعی دارد که این امر نیز به‌شدت هزینه‌بر است، اما یک روش جایگزین و فرعی، اندازه‌گیری آلل‌های SNP در یک حوضچۀ DNA[10] می‌باشد. این روش تعیین ژنوتیپ، کمّی است؛ زیرا ارتفاع نمودار[۱۱] به تعداد بازهای متصل‌شده بستگی دارد. با استفاده از این امر می‌توان هتروزیگوت‌ها را به‌دقت تعیین کرد. همچنین با استفاده از این نمودار، فراوانی آلل‌های موجود در استخر حاوی انواع DNAها را نیز می‌توان محاسبه نمود. نمونۀ این نمودار را در شکل زیر مشاهده می‌کنید:

در این نمودار، ارتباط بین فراوانی آلل یک SNP و ارتفاع قله پیروگرام[۱۲]، در نمونۀ حاوی DNA دو فرد هموزیگوت به تصویر کشیده شده است.

پیروسکوئنسینگ

شکل ۲: نمودار خط رگرسیون بین فراوانی آلل و ارتفاع قله پیروگرام حاصل از مطالعه بر روی دو فرد هموزیگوت برای یک SNP مشخص. هر نقطه میانگین دو آزمایش می‌باشد

 

تعیین هاپلوتیپ

قدرت و توانایی تعیین ژنوتیپ SNP در نقشه‌برداری ژنتیکی می‌تواند گسترده‌تر شده و به تعیین و ساخت هاپلوتیپ ارتقاء یابد. تکنیک‌های مولکولی از قبیل تعیین توالی Pyro برای ساخت هاپلوتیپ مناسب هستند، زیرا با استفاده از این تکنیک‌ها، می‌توان چندین SNP نزدیک به هم را به‌آسانی شناسایی کرد. یک روش تعیین هاپلوتیپ، استفاده از PCR اختصاصی آلل[۱۳] به همراه تکنیک تعیین توالی Pyro می‌باشد. در این موارد استخر DNA، تکثیر اختصاصی آلل هاپلوتیپ و تکنولوژی تعیین توالی pyro همه در کنار هم، برای تعیین دقیق فراوانی هاپلوتیپ بکار می‌روند. به‌طور مشابه از روش تعیین توالی pyro برای بررسی چندین SNP موجود بر روی قطعات تکثیرشده استفاده می‌شود. قرار دادن یک باز غیر مکمل[۱۴] در دومین باز انتهای ‘۳ موجب افزایش اختصاصیت PCR می‌شود. تعیین ژنوتیپ نمونه‌های هتروزیگوت، بعد از انجام AS-PCR، یک الگوی تک آللی از هر SNP ارائه می‌دهد. از آنجا که تعیین توالی pyro یک روش کمّی است، بنابراین هرگونه تکثیر غیراختصاصی آلل‌ها مشخص می‌شود. یکی از محدودیت‌های این تکنیک عدم شناسایی مستقیم هاپلوتیپ است. برای شناسایی هاپلوتیپ، ابتدا باید AS-PCR انجام شود. انتظار می‌رود که این مشکل نیز در آینده مرتفع گردد.

 

مواد لازم جهت اجرای پیروسکوئنسینگ:

آماده‌سازی نمونه:

  1. نمونۀ لازم برای واکنش پیروسکوئنسینگ به‌وسیلۀ PCR تولید می‌شود. یکی از پرایمرهای مورد استفاده در این PCR بیوتینیله می‌باشد.
  2. ذرات مغناطیسی پوشیده شده با استرپتاویدین
  3. بافر اتصال/شستشو:

۱۰ mM Tris-HCl, pH 8.0

۲ M NaCl

۰٫۱% Tween 20

این بافر برای اتصال و تثبیت محصول بیوتینیلۀ PCR به سطح ذرات مغناطیسی و شستشوی آن کاربرد دارد.

  1. پرایمر تعیین توالی (یکی از پرایمرهای PCR را می‌توان به‌عنوان پرایمر تعیین توالی بکار برد، البته این امر به شرطی امکان‌پذیر است که SNP در نزدیکی پرایمر قرار داشته باشد).

 

واکنش پیروسکوئنسینگ:

  1. محلول آنزیمی:

۵ U exonuclease-deficient Klenow DNA polymerase

۴۰ mU apyrase

۵۰۰ ng purified luciferase

۱۵ mU purified recombinant ATP sulfurylase

این مخلوط را می‌توان به‌صورت لیوفیلیزه به مدت طولانی ذخیره کرد و قبل از استفاده به‌صورت محلول درآورده و رقیق کرد.

  1. مخلوط سوبسترا:

۵ mM magnesium acetate

۰٫۱% bovine serum albumin (BSA)

۱ mM dithiothreitol (DTT)

۵µM adenosine 5′-phosphosulfate (APS)

۰٫۴ mg/mL polyvinylpyrrolidone (360,000)

۱۰۰ µg/mL D-luciferin

این مخلوط حساس به نور بوده و می‌توان آن را به‌صورت لیوفیلیزه و یا در دمای ۲۰- درجه سلسیوس به مدت حداقل یک سال نگهداری نمود.

  1. µL20 از نوکلئوتیدهای dCTP, dGTP, dATP-αS و dTTP با غلظت M0/1. هر کدام از این نوکلئوتیدها با Lµ۱ از پیروفسفات mM100 تیمار می‌شوند تا پیغام‌های غیراختصاصی حاصل از آلودگی با PPi حذف شوند. این نوکلئوتیدها رقیق شده و به Lµ۱۰۰۰ می‌رسند و می‌توان آن‌ها را در دمای ۴ و یا ۲۰- درجه سلسیوس به مدت حداقل یک سال نگهداری نمود.
  2. پلیت‌های میکروتیتر: اگر از سیستم PSQ96 برای پیروسکوئنسینگ استفاده می‌شود، باید از پلیت‌های مخصوص استفاده کرد.
  3. Inkjet cassette: از این کاست برای انتقال آنزیم‌ها و سوبسترا استفاده می‌شود. همۀ مواد ذکرشدۀ فوق به‌صورت تجاری وجود دارند.

 

دستگاه موردنیاز:

  1. دستگاه پیروسکوئنسینگ: دو نوع دستگاه PSQ96 و PTP384 امروزه به‌صورت تجاری برای این کار وجود دارد.
  2. رک مغناطیسی برای رسوب ذرات مغناطیسی

 

روش کار:

آماده‌سازی نمونه:

  1. تثبیت Lµ۴۰-۵۰ از محصول بیوتینیلۀ PCR بر روی gµ۲۰۰ از ذرات مغناطیسی پوشیده از استرپتواویدین. قبل از تثبیت، این ذرات در Lµ۴۰-۵۰ از بافر اتصال/شستشو به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴۳ درجه سلسیوس قرار گرفته و به‌آرامی هم زده می‌شوند.
  2. ذرات را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را خارج نمایید. ذرات حاوی نمونه را در Lµ۲۰ از NaOH با غلظت M0/1 به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق و یا در دمای ۴۳ درجه سلسیوس انکوبه کنید تا DNA کاملاً تک‌رشته‌ای شود.
  3. بعد از شستشو، رشتۀ تثبیت‌شده را در بافر اتصال پرایمر به حالت سوسپانسیون درآورید.

 

بافر اتصال پرایمر:

۱۰ mM Tris-HCl

۲ mM MgAC2, pH 7.5

این بافر همچنین حاوی pmol10 پرایمر تعیین توالی است. حجم نهایی در این مرحله Lµ۱۰ می‌باشد.

  1. باید پرایمر تعیین توالی به DNA الگو متصل شود. بدین منظور محلول فــوق را در دمای ̊ ۹۴ سلسیوس به مدت ۲۰ ثانیه و  ̊ ۶۵ سلسیوس به مدت ۲ دقیقه انکوبه کنید. پس از آن محلول را در دمای اتاق سرد نمایید.

 

واکنش پیروسکوئنسینگ:

  1. DNA الگو حاوی پرایمر تعیین توالی را به یک پلیت میکروتیتر منتقل کرده و با بافر TEA حجم آن را به Lµ۵۰ برسانید.

بافر TEA:

۱۰۰ mM Tris-Acetate, pH 7.75

۰٫۵ mM EDTA

  1. مخلوط آنزیمی، مخلوط سوبسترا و نوکلئوتیدها را به درون کارتریج inkjet ریخته و درون دستگاه پیروسکوئنسینگ قرار دهید.
  2. دستگاه پیروسکوئنسینگ به‌طور اتوماتیک واکنش را آغاز کرده و مخلوط آنزیمی، سوبسترا و نوکلئوتیدها را طبق برنامه اختصاصی SNP به واکنش اضافه می‌کند. SNP به‌طور اتوماتیک مشخص خواهد شد.

 

دستگاه پیروسکوئنسینگ:

دستگاه پیروسکوئنسینگ اتوماتیک از یک کارتریج inkjet برای انتقال دقیق حجم‌های در حد کمتر از میکرولیتر استفاده می‌کند. این کارتریج توانایی انتقال شش ماده به درون پلیت میکروتیتر را دارد. این پلیت به‌طور مدام هم زده می‌شود تا سرعت واکنش افزایش یابد. یک سیستم لنزی نیز در دوربین CCD وجود دارد که به‌طور مؤثری لومینسانس تولیدشده در هر چاهک را پیگیری می‌کند. نوکلئوتیدها با تأخیر به درون چاهک بعدی ریخته می‌شود تا نور حاصل از چاهک قبلی اشکالی در آزمایش ایجاد نکند. دوربین CCD به‌طور منظم هر ثانیه یک عکس از پلیت می‌گیرد تا فرایند دقیق واکنش پیروسکوئنسینگ پیگیری شود. داده‌های حاصل توسط یک نرم‌افزار به کامپیوتر منتقل می‌شوند. توسط این نرم‌افزار میزان نوکلئوتیدهایی که به هر چاهک وارد می‌شود را می‌توان کنترل کرد.

 

آنالیز داده‌ها:

داده‌های خام توسط دستگاه پیروسکوئنسینگ گردآوری می‌شود. این داده‌ها به‌صورت کمّی است، زیرا میزان نور حاصل از واکنش، نسبت مستقیمی با تعداد مولکول PPi دارد. تعداد مولکول PPi نیز نشان‌دهندۀ تعداد نوکلئوتید متصل‌شده به رشتۀ در حال ساخت می‌باشد، بنابراین پیغام نوری حاصل، نشان‌دهندۀ تعداد نوکلئوتید متصل‌شده به رشتۀ در حال ساخت می‌باشد. هم‌اکنون نرم‌افزارهای متفاوتی برای آنالیز انواع پلی‌مورفیسم‌ها وجود دارد که بسته به نوع مطالعه می‌توان از آن‌ها استفاده کرد.

 

نکات قابل‌توجه در این تکنیک:

  1. میزان DNA الگو برای انجام یک واکنش پیروسکوئنسینگ موفق، حیاتی است. برای انجام پیروسکوئنسینگ با سیستم PSQ96، حداقل یک پیکومول از DNA الگو موردنیاز می‌باشد.
  2. خلوص نوکلئوتیدها از اهمیت خاصی برخوردار است. اگر نوکلئوتیدها خالص باشند، تعیین توالی به‌درستی و با صحت بالا انجام خواهد شد. قبل از استفادۀ نوکلئوتیدها در واکنش پیروسکوئنسینگ، باید آلودگی‌های آن از قبیل PPi، حذف شوند. باید دقت شود که در این تکنیک به‌جای ATP از dATP-αS استفاده می‌شود، زیرا dATP-αs توسط لوسیفراز مصرف نمی‌شود؛ ولی به کمک آنزیم پلی‌مراز می‌تواند به رشتۀ الگو متصل شود.
  3. از آنجا که آنزیم‌های مورد استفاده در این تکنیک به‌خصوص لوسیفراز حساس به گرما می‌باشند، دمای طویل‌سازی رشتۀ در حال ساخت باید روی ̊ ۲۸ سلسیوس تنظیم شود. در این شرایط دمای اتصال پرایمر به الگو و همچنین اتصال پرایمرها به یکدیگر افزایش می‌یابد، به همین دلیل در طراحی این پرایمرها باید نهایت دقت را بکار گرفت تا به نقاط غیراختصاصی متصل نشود. در غیر این صورت، این نقاط غیراختصاصی است که تعیین توالی می‌شوند. البته با افزودن پروتئین متصل به DNA تک‌رشته‌ای، قسمت عمدۀ پیغام‌های غیراختصاصی و ناخواسته حذف می‌شود.
  4. مشکل عمدۀ این تکنیک عدم توانایی تعیین توالی دقیق نقاط هموپلیمر می‌باشد. اگر بیش از ۶-۵ نوکلئوتید یکسان پشت سر هم قرار بگیرند، پاسخ نوری غیرخطی شده و تعیین توالی دچار اشکال خواهد شد.
  5. در هنگام تعیین توالی مناطق هتروزیگوت، ممکن است پیغام‌های خارج از فاز ایجاد شود. با تغییر الگوهای توزیع نوکلئوتید، ممکن است این مشکل مرتفع شده و توالی این نقاط راحت‌تر تعیین شود.
  6. در هر آزمایش به‌طور معمول توالی ۵۰-۴۰ نوکلئوتید تعیین خواهد شد. این امر یکی از محدودیت‌های این تکنیک می‌باشد.

[۱] Pyrosequencing

[۲] Indirect bioluminometric assay

[۳] Real time

[۴] Luminometer

[۵] Apyrase

[۶] Chain termination

[۷] Single stranded DNA binding protein

[۸] Rapid

[۹] Multiplexing of SNP or mutation detection

[۱۰] DNA pool

[۱۱] Peak

[۱۲]Pyrogram

[۱۳] Allele-specific polymerase chain reaction (AS-PCR)

[۱۴] mismatch

تشخیص مولکولی بیماری‌های ارثی و استفاده از آن در تشخیص قبل از تولد و تشخیص پیش‌کاشتی استفاده از روش‌های نوین تعیین توالی

نشانگرهای مولکولی و تکنیک‌های نقشه‌برداری ژنومی و انگشت‌نگاری DNA

پلی‌مورفیسم‌های تک‌نوکلئوتیدی در درمان و تحقیقات سرطان

طیف‌سنجی جرمی

تکنیک واکنش ‘‍‍۵ نوکلئاز

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • پيروسكوئنسينگ
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *