مروري بر مفاهيم و روش‌هاي مختلف اندازه‌گيري كيفي و كمي پروتئين ادرار
مراد رستمي: کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی، دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز
معصومه جرفي: کارشناس ارشد ميكروب شناسي، دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز
محمد علیمحمدی: کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی، دانشگاه آزاد اسلامي واحد اراک
در ميان آزمون‌هاي شيميايي كه به طور روزمره بر روي ادرار انجام مي‌شود، تعيين پروتئين ادرار، شاخص‌ترين آزمايش براي بررسي بيماري‌هاي كليوي است. اغلب مراحل اوليه بيماري‌هاي كليوي با پروتئينوري همراه بوده و همين مسئله باعث مي‌شود كه آزمايش پروتئين ادرار بخش مهمي از هر آزمايش ادرار را تشكيل دهد. البته شرايط فيزيولوژيكي هم از قبيل ورزش و تب وجود دارند كه بدون وجود بيماري كليوي باعث افزايش دفع پروتئين به داخل ادرار مي‌شوند. مواردي هم از بيماري‌هاي كليوي وجود دارد كه در آنها پروتئينوري وجود ندارد.
گلومرول‌ها همانند يك صافي براي پروتئين‌هاي پلاسما عمل مي‌كنند. به طور طبيعي، پالايش پروتئين‌ها از گلومرول‌ها به اندازه ملكول‌ها و غلظت پلاسمايي آنها بستگي دارد. عموماً انتقال ملكول‌هاي پروتئيني از طريق غشاء گلومرول‌ها با افزايش اندازه پروتئين كاهش مي‌يابد. به طور طبيعي پروتئين‌هاي با وزن ملكولي بالا مانند IgM (وزن ملكولي 970 كيلو دالتون) از گلومرول‌ها مگر به ميزان بسيار كم، پالايش نمي‌شوند. ساختمان غشاء گلومرولي از عبور آلبومين جلوگيري مي‌كند اما به خاطر غلظت پلاسمايي بالا و وزن ملكولي پايين آن (66/3 كيلو دالتون)، تا اندازه‌اي در ادرار وجود دارد.
پروتئين‌هاي با وزن ملكولي 40000-15000 دالتون به راحتي پالايش مي‌يابند اما به دليل غلظت پلاسمايي كم آنها، مقادير كمتري از آنها پالايش مي‌شوند. مقادير زيادي از پروتئين‌هاي پالايش شده به وسيله لوله‌هاي توبولي بازجذب مي‌شوند؛ به طور مثال حدود 60 درصد از كل آلبومين پالايش شده، بازجذب مي‌شود. بعد از فيلتراسيون، مقدار قابل توجهي از پروتئيني كه با سرعت كمتر از 150 ميليگرم در 24 ساعت يا 20 ميليگرم درصد ترشح شده است در توبول‌ها بازجذب مي‌شود. در يك بچه به طور طبيعي سرعت ترشح پروتئين كمتر از 100 ميليگرم در متر مربع در 24 ساعت است.
نشان دادن پروتئينوري در كامل ادرار هميشه بيانگر بيماري كليوي نيست، به هر حال در صورت وجود آن، براي تعيين حالت طبيعي يا پاتولوژيكي آن، آزمايش‌هاي اضافي لازم است. آسيب غشاء گلومرولي، اختلالات مؤثر بر بازجذب توبولي و افزايش سطح سرمي پروتئين‌هاي با وزن ملكولي پايين، اصلي‌ترين علل پاتولوژيكي پروتئينوري مي‌باشند. وقتي غشاء گلومرولي آسيب مي‌بيند، پالايش گلومرولي معيوب شده و مقادير زيادي آلبومين و … از غشاء عبور نموده و وارد ادرار مي‌شود.
افزايش آلبومين در اختلالاتي كه روي بازجذب توبولي اثر مي‌گذارد نيز وجود دارد ولي برخلاف آسيب غشاء گلومرولي، اين حالت با افزايش پروتئين‌هاي داراي وزن ملكولي پايين از هر دو منشأ سرمي و توبولي همراه مي‌باشد. ميزان پروتئيني كه متعاقب آسيب گلومرولي در ادرار ظاهر مي‌شود، از مقادير كمي بالاتر از طبيعي تا 40 گرم در روز متغير است، در حاليكه در اختلالات توبولي به ندرت افزايش واضحي در سطح پروتئين ديده مي‌شود.
دفع پروتئين بنس جونز در اشخاص داراي مولتيپل ميلوما مثالي ساده از پروتئينوري بر اثر افزايش پروتئين‌هاي سرم مي‌باشد.
غالباً در بالغين جوان پروتئينوري خوش‌خيمي به وجود مي‌آيد كه در اصطلاح به آن پروتئينوري ارتواستاتيك يا وضعيتي گفته مي‌شود. اين پروتئينوري پس از مدتي ايستادن به حالت عمودي ايجاد شده و بعد از خوابيدن به حالت افقي ناپديد مي‌شود. اعتقاد بر اين است كه در وضعيت عمودي، فشار وريد كليوي بالا مي‌رود. از بيماران مشكوك به پروتئينوري وضعيتي خواسته مي‌شود كه يك نمونه را صبح بلافاصله پس از بيدار شدن و نمونه دوم را بعد از چند ساعت ماندن به حالت عمودي جمع‌آوري نمايند. هر دو نمونه از نظر پروتئين آزمايش شده و اگر پروتئينوري ارتواستاتيك وجود داشته باشد بايستي در نمونه اول صبح، نتيجه منفي و در نمونه دوم، نتيجه مثبت از نظر وجود پروتئين وجود داشته باشد.
اگر مقدار پروتئين ادرار زياد باشد، كشش سطحي آن را تغيير مي‌دهد. تكان دادن ادرار باعث تشكيل كف سفيد رنگي در سطح آن مي‌شود. اين رويداد به عنوان انديكاتور مفيدي در پروتئينوري محسوب مي‌شود.
بيماريابي را بايستي با روش‌هاي كيفي و همچنين شناسايي و اندازه‌گيري پروتئين‌ها به وسيله روش‌هاي كمي، تأئيد و پيگيري نمود. نمونه ادرار اول صبح براي آزمايش پروتئين ادرار مناسب است زيرا تحت تأثير عوامل وضعيتي قرار نمي‌گيرد و تغليظ شده است.
روش‌های اندازه‌گیری پروتئین در ادرار معمولاً بر دو نوعند:
- تست‌هایی که بر مبنای استفاده از خطای پروتئین اندیکاتورهای PH استوارند. این روش در معرف‌های نواری مختلفی به کار گرفته شده است. این نوارها نسبت به آلبومین در قیاس با سایر پروتئین‌ها از حساسیت بیشتری برخوردار هستند.
- تست‌هایی که بر مبنای رسوب پروتئین‌ها به وسیله مواد شیمیایی یا ایجاد انعقاد به وسیله حرارت استوارند. این تست‌ها قابلیت شناسایی همه پروتئین‌هاي ادرار از جمله آلبومین، گلیکوپروتئین‌ها، گلبولین‌ها (زنجیره سبک ایمونوگلبولین یا پروتئین بنس جونس) و هموگلوبین را دارا می‌باشند.
براي تعيين وجود و يا تعيين مقدار پروتئين ادرار روش‌هاي متعدد و مختلفي وجود دارد كه در زير به آنها مي‌پردازيم:
استفاده از معرف نواري (نوار ادرار):
تشخيص كيفي افزايش مقادير پروتئين‌ها در ادرار به طور گسترده‌اي با استفاده از تست‌هاي نواري (Dipstick tests) صورت مي‌گيرد. قسمت واكنشگر نوار ادراري با بافر انديكاتور كه در حضور پروتئين، تغيير رنگ مي‌دهد، بر سطح نوار كاشته شــــــــــــــــــــــــــــــده است. يك مثال بارز، Albustix (Bayer Corporation, Diagnostics Division, Tarrytown, NY) در بروموفنل بلو مي‌باشـد كه در PH برابر 3 با سيترات بافر شــده است و عمومــاً در فرم پروتونه زرد رنگ قرار دارد. هنگامي كه پروتئين افزوده مي‌گــردد، تمايل فرم آنيونيك رنگ انديكــاتور براي پروتئين، موجب شيفت تعادل بيــن فــرم‌هاي آنيونيك و پروتونه انديكاتور به سمت تشكيل گونه‌هـــاي آبي رنگ آنيونيك مي‌گردد. تغييرات شدت رنگ متـنــــــــــاسب با مقــدار پروتــــــئين نمــونه ادرار مي‌باشد. Combur 8 strips (Roche Diagnostics, Inc, Indianapolis,IN) ظاهراً به تداخلات دارويي كمتر حساس است و محدوده تشخيصي آن حدود 7 ميليگرم در دسي‌ليتر مي‌باشد.
اين روش رنگ سنجي بر اساس مفهوم خطاي پروتئيني شناساگرها- پديده‌اي كه نقطه تغيير رنگ بعضي از معرف‌هاي PH را در حضور پروتئين نشان مي‌دهد- استوار مي‌باشد. معمولاً در PH بين 4-3، رنگ معرف‌ها از زرد تا آبي يا سبز تغيير مي‌كند، اما در حضور پروتئين، يك اشتباه در رفتار معرف رخ مي‌دهد. به عنوان مثــال، معــرف به كار رفته در N-Multistix
شامل: 3′,3′′,5′,5′′-Tetra bromophenol sulfophthalein و معرف به كار رفته در Chemstrip-8 عبارتست از:3′,3′′,5′,5′′-Tetra chlorophenol-3,4,5,6-tetra bromo sulfophthalein.، همچنين همراه اين معرف، يك بافر اسيدي به منطقه واكنش بالشتك پروتئين اضافه شده است كه PH آن را تا حد 3 نگه مي‌دارد و در صورت عدم حضور پروتئين در ادرار، ايجاد رنگ زرد مي‌نمايد. شدت رنگ متناسب با مقدار پروتئين موجود در نمونه مي‌باشد. نتيجه به صورت منفي تا 3 و يا 4 مثبت گزارش مي‌شود.
حساسیت این روش برای آلبومین نسبت به سایر پروتئین‌ها بیشتر است. اگر پروتئین‌هایی بجز آلبومین در ادرار وجود داشته باشند ممکن است با این روش جواب منفی کاذب داشته باشیم. به عبارتی دیگر، جواب پروتئین منفی نوار ادراری، الزاماً حضور پروتئین را در ادرار رد نمی‌کند، بنابراین ممکن است ضروری باشد که همه یا حداقل در جمعیت بیماران خاص، همه نمونه‌های ادراری را هم با نوار ادراری و هم با تست‌های رسوبی از نظر وجود پروتئین بررسی نماییم.
| همانند بقيه روش‌هاي اتصال رنگ، تست‌هاي نواري به آلبومين بيشتر از بقيه پروتئين‌ها حساس هستند. در نتيجه آنها روش مناسبي براي اسكرينينگ پروتئيني گلومرولار بوده در حاليكه براي بررسي پروتئينوري توبولار و بنس جونس، مفيد نمي‌باشند.
آلبومين، پروتئيني است كه به طور اوليه در نتيجه ضايعه يا بيماري گلومرولي ترشح مي‌شود. ديگر پروتئـــين‌هاي ادراري از قبيل گاماگلبولين، گليكوپروتئين، ريبونوكلئاز، ليزوزيم، هموگلوبيــن، موكوپروتئين تام-هورسفال و پروتئين بنس جونز با اين روش به خوبي آلبومين جواب نمي‌دهند، بنابراين نتيجه منفي پروتئين با روش نوار ادراري، ضرورتاً حضور ديگر پروتئين‌ها را رد نمي‌كند. |
ناحيه پروتئين نوار ادرار يكي از مشكل‌ترين نواحي از نظر تفسير بويژه در مورد قرائت مقدار Trace مي‌باشد. به اين دليل از آنجائيكه نوارهاي ادراري در درجه اول آلبومين را اندازه مي‌گيرند و ممكن است پروتئين‌هاي توبولي و پروتئين بنس جونز را آشكار نكنند، اغلب آزمايشگاه‌ها همه نتايج مثبت يا مشكوك را به وسيله روش‌هاي رسوب دادن اسيدي يا حرارتي تأئيد مي‌نمايند.
آزمايش مثبت پروتئين ادرار اغلب با واكنش مثبتي در قسمت خون نوار ادرار و پيدايش سيلندرها، گلبول‌هاي قرمز و سفيد يا باكتري‌ها در آزمايش ميكروسكوپي همراه است، در حاليكه امكان دارد در حضور تعداد كمي سيلندر يا گلبول قرمز، آزمايش پروتئين منفي شود.
مقدار تقريبي كمي پروتئين با شدت رنگ نوار ادرار
|
Chemstrip |
Multistix/Albustix
|
اسید سولفوسالیسیلیک |
Test strip
Protein |
| منفی | منفی | منفی | منفی |
| 6-20 mg/dl | 5-20 mg/dl | 5-20 mg/dl | Trace |
| 30 mg/dl | 30 mg/dl | 30 mg/dl | 1+ |
| 200 mg/dl | 100 mg/dl | 100 mg/dl | 2+ |
| 500 mg/dl≤ | 300 mg/dl | 300-500 mg/dl | 3+ |
| 2000 mg/dl< | 500 mg/dl< | 4+ |
مقایسه حساسیت (حداقل سطح تشخیصی) نوارهای ادراری شرکت‌های مختلف
| حداقل سطح تشخیصی | نام شركت |
| 5-20 mg/dl Alb | Multistix/Albustix |
| 4-8 mg/dl Alb | Micro-Bumintest |
| 6 mg/dl Alb | Chemstrip |
مداخله‌گرها:
اگر ادرار به شدت پیگمانته باشد، ممکن است با واکنش رنگی تداخل نماید. بیلیروبین یا داروهایی از قبیل فنازوپیریدین و سایر ترکیبات حاوی آزو، ایجاد رنگ نارنجی درخشان نموده و تداخل ایجاد می‌نمایند.
| نتايج مثبت كاذب:
– زماني كه PH ادرار بالاي 9 باشد و يا در نتيجه ماندن ادرار، PH آن افزايش يابد، سبب مي‌شود كه بافر اسيدي در بالشتك پروتئين از بين رفته و در عدم حضور پروتئين، تغيير رنگ دهد. – اگر نوار ادرار به مدت زيادي در ادرار باقي بماند، بافر موجود در بالشتك شسته شده و PH بالشتك افزايش مي‌يابد، در اين صورت، بدون اينكه پروتئيني در كار باشد، نوار ادراري آبي يا سبز خواهد شد و در نتیجه در حضور و یا عدم حضور پروتئین، جواب مثبت ایجاد می‌نماید. – تركيبات چهار ظرفيتي آمونيوم یا کلر هگزیدین كه براي تميز كردن ظرف ادرار به كار مي‌روند موجب تغيير PH شده و تتيجه مثبت كاذب مي‌دهند (با استفاده از ليوان‌هاي يكبار مصرف اين مشكل حل شده است). – نتايج مثبت كاذب با نوار Chemstrip در طــول درمــان با فنازو پيريـــــــدين و بعد از تزريق پلي وينيل پيروليدون كه به عنوان افزايش دهنده حجم خون به كار مي‌رود، ملاحظه مي‌گردد. |
| نتايج منفي كاذب:
– در ادرار رقيق – در پروتئينوري غير از آلبومينوري
|
توضیحات بیشتر:
نوار ادراری از نظر بررسی پروتئین، تحت تأثیر کدورت، ترکیبات رادیوگرافیک، اغلب داروها و متابولیت‌های آنها و مواد نگهدارنده ادرار که گاهی روي سایر آزمایش‌هاي پروتئین‌های ادرار اثر مي‌كنند، قرار نمی‌گیرد.
برای مقایسه رنگ ایجاد شده روی ناحیه پروتئینی نوار ادراری، بایستی آن را با رنگ روی جعبه نوار ادراری و از نزدیک مقایسه نمود، زیرا تشخيص تغییر رنگ در این ناحیه و بویژه در مقدار Trace، بسیار مشکل است. در موارد مشکوک، تست‌های تأییدی با حساسیت مختصری بیشتر، از قبیل تست اسید سولفوسالیسیلیک باید انجام شود.
| نسبت آلبومین/ کراتینین باید گزارش گردد.
تفسیرغلظت آلبومین به تنهایی مشکل بوده و نباید به تنهایی گزارش گردد. نمونه ادرار اول صبح دارای نوسانات بیولوژیک کمتری بوده و نسبت به نمونه راندوم ارجح است. مقدار آلبومین باید در نمونه ادرار تازه و نه نمونه ادرار منجمد شده انجام شود. اندازه‌گیری‌های آلبومین ادرار نسبت به اندازه‌گیری‌های مربوط به پروتئین تام ادرار نوسانات کمتری دارند. |
استفاده از اسيد سولفوساليسيليك:
چندين اسيد مي‌توانند براي رسوب دادن پروتئين ادرار به كار روند كه شامل اسيد سولفوساليسيليك، اسيد تري‌كلرو استيك، اسيد نيتريك و اسيد استيك مي‌باشند. اسيد سولفوساليسيليك بيشترين كاربرد را دارد و احتياج به حرارت هم ندارد. غلظت‌ها و نسبت‌هاي مختلف از اين اسيد به كار مي‌رود و هر كدام از اين غلظت‌ها محدوده طبيعي متفاوتي براي پروتئين ادرار دارند كه مي‌بايست مقدار طبيعي پروتئين ادرار را با روشي كه مورد استفاده قرار مي‌گيرد ذكر نمود.
| كدورت حاصل با آلبومين با روش با اسيد سولفوساليسيليك، 214 مرتبه بيشتر از كدورت حاصل با گلبولين‌هاست. پلي‌پپتيدها، گليكوپروتئين‌ها و پروتئين بنس جونز نيز توسط اين روش رسوب داده مي‌شوند. |
اصول آزمایش:
این تست بر مبنای رسوب پروتئین با یک اسید قوی به نام اسید سولفوسالیسیلیک می‌باشد. غلظت‌های مختلفی از این اسید در کتب مختلف توضیح داده شده است. اسید سولفوسالیسیلیک آزاد موجود در معرف کاری موجب رسوب هر نوع پروتئین در نمونه می‌گردد. این روش قادر به تشخیص آلبومین، گلبولین‌ها، گلیکوپروتئین‌ها و زنجیره سبک ایمونوگلبولین‌ها از قبیل پروتئین بنس جونس می‌باشد. از آنجائی که این روش بر مبنای حرارت نمونه‌ها نيست پروتئین بنس جونس نیز مانند سایر پروتئین‌ها رسوب خواهد نمود. از این رو، برای تشخیص دقیق نوع پروتئین، بررسی‌های بیشتر از قبیل الکتروفورز، ایمونو الکتروفورز، ایمونودیفیوژن یا اولتراسانتریفوژ ممکن است ضروری باشد.
روش كار:
به حدود 3 ميلي‌ليتر از ادرار، حجم مساوي از اسيد سولفوساليسيليك 3 درصد اضافه نموده و به وسيله سر و ته نمودن مخلوط مي‌نماييم. به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق رها نموده و سپس مجدداً مخلوط مي‌نماييم. آنگاه در نور اتاق (نه نور لامپ) به بررسي آن مي‌پردازيم.
معرف اسید سولفوسالیسیلیک 3 درصد:
3 گرم از اسید-5-سولفوسالیسیلیک (C7H6O6S. 2H2O) را در مقداری آب مقطر حل نموده و حجم نهایی آن را به یک لیتر می‌رسانیم.
| گاهي از معرف اگزتون (Exton) كه عبارت از اسيد سولفوساليسيليك 5 درصد و محلول سولفات سديم مي‌باشد، استفاده مي‌شود. اگزتون در سال 1925 دريافت كه اضافه نمودن سولفات سديم به اسيد سولفوساليسيليك، سبب ايجاد رسوب يكدست و يكسان بيشتري مي‌شود.
طرز تهيه معرف اگزتون: 88 گرم سولفات سديم را در 600 ميلي‌ليتر آب مقطر به كمك حرارت حل مي‌نماييم. پس از حل شدن و خنك شدن محلول، 50 گرم اسيد سولفوساليسيليك به آن اضافه نموده و حجم نهايي را با آب مقطر به يك ليتر مي‌رسانيم.
روش كار: ابتدا نمونه ادرار را سانتريفوژ نموده و سپس حجم‌هاي مساوي از ادرار و محلول اگزتون را با هم مخلوط مي‌نماييم و سپس درجه كدورت ايجاد شده به صورت زير قرائت مي‌شود: بدون كدورت: منفي ديدن كدورت در زمينه سياه: Trace كدورت مشخص و بدون دانه: +1 كدورت مشخص و دانه‌دار: +2 كدورت خيلي شديد، همراه با مجتمع‌هاي قابل تشخيص: +3 كدورت شديد و متراكم، همراه با مجتمع‌هاي بزرگ كه ممكن است رسوب نمايند: +4 (اگر پس از حرارت دادن لوله، محيط شفاف شود، كدورت حاصله مربوط به پروتئين نبوده است). |
| Concentration of protein | Explantation | Results |
| 5 mg/dl> | No turbidity, or no increase in turbidity. clear ring is visible at bottom of tube when viewed from above (top to bottom). | Negative |
| 5-20 mg/dl | Barely perceptible turbidity in ordinary room light. Printed material distorted but readable through the tube. Can not see a ring at bottom of tube when viewed from above. | Trace |
| 30 mg/dl | Distinct turbidity but no distinct granulation. | 1+ |
| 100 mg/dl | Turbidity with granulation but no flocculation. | 2+ |
| 300-500 mg/dl | Turbidity with granulation and flocculation. | 3+ |
| 500 mg/dl> | Clumps of precipitated protein or solid precipitate. | 4+ |
نتايج مثبت كاذب:
- در بيماران تحت درمان با داروهاي تولبوتاميد (داروی خوراکی در درمان دیابت)
- دوزهای بالای پني‌سيلين، سولفوناميدها یا سفالوسپورین‌ها و داروی ضد التهاب غیر استروئیدی Tolmetin. این ترکیبات، تست پروتئین نوار ادراری را تحت تأثیر قرار می‌دهند و در نتیجه، آزمایش بررسی پروتئین با نوار ادراری در مقایسه با روش اسید سولفوسالیسیلیک، منفی و یا کمتر نشان داده خواهد شد. برای تأیید تداخلات دارویی، سابقه بیمار و (یا) رسوب ایجاد شده با اسید سولفوسالیسیلیک را با کمک بررسی میکروسکوپی برای حضور پروتئین‌ها می‌توان تأیید نمود.
- پس از تزريق رنگ‌هاي راديوگرافي: حضور یدیدهای آلی (Organic iodides) در ترکیبات رادیوگرافیک از قبیل مگلومین دیاتـــــــــــــــــــــری زوآت (Meglumine diatrizoate) (Renografin, Hypaque) که ممکن است در محلول آزمایش اسید، رسوب نمایند، این عوامل معمولاً با تأخیر تست را مثبت می‌نمایند. در صورتیکه در حضور پروتئین، پس از ریختن اسید سولفوسالیسیلیک، بلافاصله رسوب ایجاد می‌گردد. در این موارد، کریستال‌های غیر معمول رادیوگرافیک ممکن است در بررسی میکروسکپی ادرار دیده شوند. هنگامی که وزن مخصوص ادرار با استفاده از رفراکتومتر بیشتر از 035/1 شود و تست پروتئین با استفاده از نوار ادراری منفی گردد، باید به حضور ترکیبات رادیوگرافیک مشکوک شویم. همچنین از طریق سؤال در مورد سابقه انجام رادیوگرافی از بیمار می‌توانیم این مورد را تأیید نماییم.
رسوب ایجاد شده در حضور پروتئین‌ها یا ترکیبات رادیوگرافیک ممکن است در آزمایش میکروسکوپی ادرار نیز دیده شود. کریستال‌های مواد رادیوگرافیک به صورت سوزن‌های با شکست نوری بالا (highly refractile needless) در مقابل نور پلاریزه دیده می‌شوند، در حالیکه، رسوب ناشی از حضور پروتئین‌ها در بررسی میکروسکپی ادرار به صورت رسوب‌های آمورف (amorphous precipitate) که نور پلاریزه ایجاد نمی‌کنند، دیده مي‌شوند.
- کدورت ادرار: (نمونه باید قبل از انجام آزمایش شفاف گردد که معمولاً این کار با سانتریفوژ کردن انجام می‌شود).
نتايج منفي كاذب و یا کاهش یافته (Reduced Results):
- در ادرار كاملاً قليايي: این نمونه‌ها موجب خنثی شدن اسید سولفوسالیسیلیک می‌گردند که البته این مورد بسیار به ندرت رخ می‌دهد. این نمونه‌ها با روش نواری، جواب مثبت کاذب ایجاد می‌نمایند. برای حل این دوگانگی می‌توان PH ادرار را تا حدود 5 یا 6، اسیدی نمود و مجدداً تست را با نوار و روش اسید سولفوسالیسیلیک تکرار نمود. نتایج به دست آمده با روش نواری و اسید سولفوسالیسیلیک در ادرار اسیدی باید مشابه باشند.
- در نمونه‌هاي ادرار خيلي رقيق
- ميزان بالاي دترجنت موجب كاهش نتايج مي‌شود.
توضیحات بیشتر:
در مورد نمونه‌هایی که پروتئین آنها با روش اسید سولفوسالیسیلیک، مثبت و با روش نوار، منفی می‌باشند و یا نتیجه بررسی پروتئین آنها با اسید سولفوسالیسیلیک نسبت به روش نواری، بیشتر از یک پلاس (1+) افزایش داشته باشد، باید به حضور پروتئین‌های دیگری بجز آلبومین مشکوک شد. مثلاً ممکن است این مورد با حضور پروتئین بنس جونس که در مولتیپل میلوما دیده می‌شود، اتفاق بیفتد. این موارد را باید با الکتروفورز و یا ایمون الکتروفورز تأیید نمود. پروتئین‌های غیر آلبومینی شیره پانکراس
(Non albumin pancreatic fluid)، نیز ممکن است در ادرار افرادی که پیوند پانکراس دریافت نموده‌اند و دچار anastomosis هستند، ترشح شود. در این موارد نیز نتیجه بررسی پروتئین آنها با نوار ادراری، منفی و با روش اسید، مثبت خواهد شد. این مورد را با سؤال از بیمار در مورد سابقه پیوند پانکراس می‌توان حل نمود.
همچنین جواب منفی حضور پروتئين با نوار ادراری و جواب مثبت با اسيد، مي‌تواند به دلايل زير نیز باشد:
- وجود رنگ‌هاي راديوگرافي
- پني‌سيلين
- به ندرت وجود گلبولين‌ها
واکنش‌های مثبت و منفی کاذب در آزمایش پروتئین ادرار
| False negative or decreased results | False positive or masng of results | Method |
| – Presence of protein other than albumin | – Highly colored urine bilirubin or bile pigments
Azo-containing drugs or compounds-phenazopyridine – Loss of buffer on strip-overwetting – Exceptionally alkaline or highly buffered specimen – Residues of quarternary ammonium compounds or chlorhexidine (disinfectant contamination) – Chemstrip: polyvinylpyrolidone (blood substitutes)
|
Reagent strip |
| – Highly buffered alkaline urine (acid in sulfosalicylic acid is neutralized) | – Turbidity in specimen not cleared before testing
– Radiographic contrast media such as meglumine diatrizoate (Renografin, Hypaque) – delayed positive reaction – Metabolites of tolbutamide – Massive doses of : Penicillin Sulfonamides Cephalosporin Tolmetin |
Sulfosalicylic acid |
به لحاظ فقدان حساسيت نوار جهت گلبولين، بر حسب نوع بيماران و بيماري‌هاي مورد بررسي، شايد لازم باشــد كه از روش اسيد براي همه نمونه‌ها استفاده شود. با روش اسيد سولفوساليسيليك مي‌توان حدود 10-5 ميليگرم پروتئين را اندازه‌گيري نمود؛ یعنی حساسیت این روش 10-5 میلیگرم پروتئین در دسی‌لیتر است. چنانچه رنگ‌هاي راديوگرافي موجود باشند، وزن مخصوص ادرار به طور معمول بيشتر از 035/1 بوده و رسوب با اسيد سولفوساليسيليك با ماندن ادرار افزايش يافته و در آزمايش ميكروسكپي ادرار، كريستال‌هاي آنها مشاهده مي‌شوند. اثرات ناشي از رنگ‌هاي راديوگرافي ممكن است تا سه روز در ادرار باقي بمانند. در اين موارد مي‌توان تست نوار معرف يا تست حرارت و اسيد استيك را جانشين ساخت. رنگ راديوگرافي در تست اسيد استيك با حرارت روشن شده در حاليكه پروتئين، كدورتش افزايش مي‌يابد.
| مقايسه نوارهاي معرف با روش اسيد سولفوساليسيليك نشان مي‌دهد كه نتايج دقيق با نوارهاي معرف، زماني به دست مي‌آيد كه فقط آلبومين اندازه‌گيري شود. تغيير غلظت مواد ادرار روي نتايج نوار معرف اثر گذاشته، در حالیکه روي روش اسيد سولفوساليسيليك اثر ندارد. همچنین ميزان بالاي نمك، موجب كاهش نتايج نوار معرف مي‌گردد. |
استفاده از حرارت و اسيد استيك:
پس از سانتريفوژ ادرار، PH آن را به كمك تامپون اسيد استيك و استات سديم به حدود 5-4 مي‌رسانيم، زيرا پروتئين‌ها در محيط اسيد، بهتر فلوكوله مي‌شوند. PH پايين‌تر از PH ايزوالكتريك پروتئين، پروتئين‌هاي موجود در ادرار را مستعد رسوب كردن مي‌نمايد و در صورت رسوب، با استفاده از حرارت، پروتئين‌هاي غير محلول منعقد مي‌شوند. وجود الكتروليت‌ها در تامپون، عمل انعقاد پروتئين‌ها را سرعت مي‌بخشد.
روش كار:
حدود 10 ميلي‌ليتر ادرار را سانتريفوژ نموده و آن را صاف مي‌نماييم. دو سوم مايع رويي را به داخل لوله پيركس مي‌ريزيم. ته لوله آزمايش را با يك گيره نگه مي‌داريم و قسمت فوقاني آن را به مدت دو دقيقه مي‌جوشانيم (لوله را بايد به صورت مورب روي شعله نگه داشت و دهانه آن دور از سمت افراد باشد). اگر در اين مرحله كدورتي ظاهر شد مي‌تواند به پروتئين‌ها، فسفات‌ها و كربنات‌ها مربوط باشد. سپس 5-3 قطره اسيد استيك 10-5 درصد اضافه مي‌كنيم و دوباره مي‌جوشانيم.
اسيد استيك موجب حل شدن فسفات‌ها و كربنات‌ها شده كه در مرحله قبل ممكن است سبب كدورت شده باشند. همچنين اسيد استيك PH را پايين‌تر برده و آن را به PH ايزوالكتريك نزديكتر مي‌كند، بنابراين كدورت پس از افزودن اسيد استيك، مربوط به افزايش رسوب پروتئين‌ها است. در مرحله آخر نيز، درجه كدورت ايجاد شده را در قسمت بالاي لوله حرارت داده شده مانند روش اسيد سولفوساليسيليك گزارش مي‌نماييم.
با اين روش، آلبومين، گلبولين‌ها، موكوپروتئين‌ها و همچنين پروتئين بنس جونز را مشخص مي‌نمايند. اين آزمايش خيلي حساس بوده و حتي مقادير 5 ميليگرم در دسي‌ليتر پروتئين ادرار را نشان مي‌دهد. رسوب ندادن هموگلوبين و ميوگلوبين از معايب اين روش به حساب مي‌آيند.
نتايج مثبت كاذب:
در بيماران تحت درمان با داروهاي تولبوتاميد
مقدار زياد پني‌سيلين و سولفوناميدها
بعد از تزريق رنگ‌هاي راديوگرافي
نتايج منفي كاذب:
وجود هموگلوبين و ميوگلوبين در ادرار
ادرارهاي خيلي قليايي
ادرارهاي خيلي رقيق
استفاده از قرص اسيد:
اين قرص‌ها حاوي اسيد سولفوساليسيليك و بيكربنات سديم مي‌باشند. قرص‌ها را در آب مقطر حل نموده تا محلول 5 درصد پايدار آن ساخته شود.
آزمايش حلقه هلر :(Heller,s Ring)
هنگامي كه نمونه ادرار خيلي كم باشد روش مناسبي محسوب مي‌شود اما حساسيت آن از ساير تست‌هاي رسوبي كمتر است.
روش انجام آزمايش:
چند ميلي‌ليتر اسيد نيتريك غليظ را در ته لوله آزمايش مي‌ريزيم. به آرامي و از كنار لوله بر روي آن ادرار سانتريفوژ شده اضافه مي‌نماييم كه موجب ايجاد دو لايه مي‌شود. تشكيل رسوب سفيد رنگ در محل تلاقي ادرار با اسيد در مدت سه دقيقه دلالت بر وجود پروتئين دارد.
نتايج مثبت كاذب:
در بيماران تحت درمان با داروهاي تولبوتاميد
مقدار زياد پني‌سيلين و سولفوناميدها
بعد از تزريق رنگ‌هاي راديوگرافي
غلظت‌هاي بالاي اسيد اوريك و اوره (كه اين‌ها را مي‌توان با رقيق نمودن ادرار و تكرار آزمايش حذف نمود).
نتايج منفي كاذب:
– ادرارهاي خيلي رقيق
آزمايش حلقه روبرت (Robert,s Ring):
شبيه آزمايش حلقه هلر بوده ولي تفاوت آن در معرف شيميايي آن است كه شامل يك قسمت اسيد نيتريك و پنج قسمت سولفات منيزيوم اشباع مي‌باشد.
آزمايش تري‌كلرو استيك اسيد:
در اين روش پروتئين ادرار توسط تري‌كلرو استيك اسيد 5/12 درصد رسوب داده مي‌شود. كدورت ايجاد شده متناسب با مقدار پروتئين (آلبومين و گلبولين) موجود در ادرار مي‌باشد. غلظت پروتئين رسوب داده شده با در نظر گرفتن غلظت اسيد، دما و زمان سپري شدن بين اضافه كردن اسيد تا ايجاد رسوب پروتئين محاسبه مي‌گردد.
روش ايمونوشيمي به دليل نياز به ابزار و مواد اختصاصي و هزينه نسبتاً بالا رايج نبوده و روش نواري به دليل كيفي بودن نتايج حاصله براي ادرار 24 ساعته مورد استفاده قرار نمي‌گيرد.
| روش‌هاي مورد استفاده در آزمايشگاه‌هاي تشخيص طبي ايران عبارتند از:
1- روش اسيد تري‌كلرو استيك (TCA) (كدورت سنجي در طول موج 405 نانومتر): اين روش براي اندازه‌گيري غلظت‌هاي 700-25 ميليگرم در ليتر پروتئين مناسب بوده و حداقل تأثير پذيري در استفاده از مواد كاليبراسيون متفاوت را دارا است. 2-روش اسيد تري‌كلرو استيك (TCA) (كدورت سنجي در طول موج 620 نانومتر): اين روش داراي كيفيت مناسبي در اندازه‌گيري غلظت‌هاي 1000-100 ميليگرم در ليتر پروتئين مي‌باشد، اما در استفاده از مواد كاليبراسيون مختلف، تأثير پذيري بيشتري نسبت به روش كدورت سنجي با استفاده از TCA در طول موج 405 نانومتر از خود نشان مي‌دهد. 3-روش اسيد سولفوساليسيليك (SSA) (كدورت سنجي در طول موج 620 نانومتر): اين روش پايين‌ترين كيفيت در سنجش مقادير كمتر از 200 ميليگرم در ليتر پروتئين را داشته و در استفاده از مواد كاليبراسيون مختلف، تأثير پذيري قابل توجهي دارد. |
| با توجه به تحقيقات انجام شده در آزمايشگاه رفرانس، روش TCA با استفاده از طول موج 405 نانومتر براي سنجش مقادير كم پروتئين به عنوان روش انتخابي معرفي شده است. |
جمع‌آوري نمونه:
به دلیل تغییرات طبیعی بدن که در طول روز رخ می‌دهند ممکن است نیاز باشد تا تست‌های آزمایشگاهی در زمان مشخصی از روز انجام شوند. در طی زمان جمع‌آوری نمونه ادرار 24 ساعته، باید رژیم غذایی و دریافت مایعات شخص مانند روزهای قبل باشد (مگر نظر پزشک معالج و یا آزمایشگاه غیر از این باشد). باید قبل و در طی زمان جمع‌آوری نمونه ادرار 24 ساعته از مصرف الکل اجتناب نمود.
در اين آزمايش مي‌توان از ادرار به صورت انتخابي (راندوم) استفاده نمود ولي ادرار 12 يا 24 ساعته ارجح است. لازم به ذكر است كه نمونه ادرار 12 يا 24 ساعته بايد بدون افزودن ماده نگهدارنده جمع‌آوري شده و در تمام مدت نمونه‌گيري، ظرف حاوي نمونه در محل خنك و ترجيحاً در يخچال 4-2 درجه سانتيگراد نگهداري شود. براي اين كار بايد از ظرف تميز و عاري از آلودگي استفاده نمود و به بيمار دستورالعمل جمع‌آوري ادرار 24 ساعته داده شود. به اين صورت كه از ساعت 8 صبح تا 8 صبح روز بعد تمام نمونه‌هاي پس از ساعت 8 به طور كامل جمع‌آوري شده ولي ادرار ساعت 8 روز اول دور ريخته شود.
در صورت تأخير در انجام آزمايش مي‌توان پس از اندازه‌گيري حجم ادرار، نمونه را خوب مخلوط نموده و قسمتي از آن را تا روز انجام آزمايش نگهداري نمود. بهتر است قبل از انجام آزمايش، نمونه ادرار به مدت 10 دقيقه در دور rpm 3000 سانتريفوژ شده و از محلول رويي براي اندازه‌گيري ميزان غلظت پروتئين استفاده گردد.
نمونه ادرار را نباید با دستمال کاغذی، مدفوع و یا هر چیز دیگری آلوده نمود. ممکن است لازم باشد ظرف ادرار در محلی سرد نگهداری شود.
| دفع پروتئين در ادرار به طور دائم، ثابت و مشخص نبوده و در دوره‌هاي 24 ساعته تغيير قابل ملاحظه‌اي دارد، بنابراين براي اندازه‌گيري پروتئين دفع شده بهتر است از ادرار 24 ساعته استفاده شود. |
روش تهيه TCA 100 درصد ذخيره:
175 ميلي‌ليتر آب مقطر ديونيزه شده را به يك ظرف حاوي 500 گرم از TCA اضافه مي‌نماييم. درب ظرف را بسته و به آرامي تكان مي‌دهيم تا كاملاً حل شود. سپس تمام مواد را به طور كامل به يك بالن 500 ميلي‌ليتري حجمي منتقل نموده و حجم كل را به 500 ميلي‌ليتر مي‌رسانيم. براي انحلال كامل طي مدت 24 ساعت، گاهگاه محلول را با عمل چرخش مخلوط مي‌نماييم.
محلول TCA 100 درصد ذخيره را در يك ظرف تيره و در دماي اتاق نگهداري مي‌نماييم. اين محلول به مدت 12 ماه پايدار مي‌باشد.
| به علت خورندگي TCA بايد تهيه محلول با احتياط و با محافظت از چشم‌ها و دست‌ها انجام گرفته و پس از پايان كار ظروف مورد استفاده كاملاً شسته شوند. |
روش تهيه TCA 5/12 درصد (765 ميلي مول در ليتر):
با استفاده از پيپت حجمي 25 ميلي‌ليتري، مقدار 25 ميلي‌ليتر از محلول TCA 100 درصد ذخيره را به يك بالن ژوژه 200 ميلي‌ليتري منتقل مي‌نماييم و با استفاده از آب مقطر حجم آن را به 200 ميلي‌ليتر مي‌رسانيم. محلول حاصله را كاملاً مخلوط نموده و در ظرف شيشه‌اي تيره و در دماي اتاق نگهداري مي‌نماييم. اين محلول در دماي اتاق به مدت يك ماه و در صورت نگهداري در يخچال تا مدت‌هاي خيلي طولاني پايدار مي‌باشد.
همچنين مي‌توان به طور مستقيم 5/12 گرم پودر TCA را در مقدار كمي آب مقطر حل كرده و سپس حجم را به 100 ميلي‌ليتر رسانيد.
كنترل:
از سرم كنترل‌هاي تجاري به عنوان كنترل استفاده مي‌گردد و رقتي برابر 1 به 300 با استفاده از سرم فيزيولوژي تهيه مي‌شود.
استاندارد:
براي آزمايش‌هاي روتين از سرم كنترل‌هايي ترجيحاً با ارزش مرجع استفاده مي‌شود. براي انجام كار ابتدا غلظت پروتئين اين سرم كنترل‌ها را به مقداري كه امكان وجود آن در ادرار است مي‌رسانيم. (براي رقيق كردن از سرم فيزيولوژي استفاده مي‌كنيم). لازم به ذكر است كه اين روش تا 500 ميليگرم در ليتر خطي است، بنابراين نمونه‌ها اعم از ادرار و استاندارد بايد طوري رقيق شوند كه غلظت پروتئين موجود در آنها حداكثر 500 ميليگرم در ليتر باشد.
| از يك نوع نمونه كنترل نمي‌توان همزمان به عنوان كنترل و استاندارد استفاده نمود. |
روش كار:
- 10 ميلي‌ليتر از ادرار را سانتريفوژ نموده و سپس با استفاده از نوار ادراري پروتئين آن را بررسي نموده و نتيجه آن را ثبت مي‌نماييم. در صورتي كه پروتئين آن بيش از يك پلاس (+1) بود بايد ابتدا نمونه ادرار را قبل از شروع آزمايش با استفاده از سرم فيزيولوژي رقيق نمود. اگر نيتريت بيمار مثبت باشد بايد بيمار را براي نمونه‌گيري مجدد با رعايت شرايط نمونه‌گيري راهنمايي نمود و در صورت تكرار آلودگي نمونه، بيمار را جهت مشاوره و لزوم بررسي نتايج كامل ادرار و احتمالاً درخواست كشت ادرار به پزشك معرفي نمود.
| نمونه‌هايي كه پروتئين آنها با استفاده از روش نواري 1، 2 و 3 پلاس مي‌شوند را بايد به ترتيب به نسبت‌هاي 1 به 5، 1 به 10 و 1 به 15 رقيق نمود. |
- براي هر آزمايش (نمونه، كنترل و استاندارد) دو لوله، يكي به عنوان بلانك و ديگري به عنوان تست در نظر مي‌گيريم.
- 1/6 ميلي‌ليتر از نمونه ادرار، استاندارد و كنترل را در لوله‌هاي مربوطه ريخته و سپس 0/4 ميلي‌ليتر از محلول TCA 12/5 درصد به همه لوله‌ها اضافه مي‌نماييم. سپس به آرامي لوله را مخلوط مي‌نماييم. براي مخلوط نمودن لوله‌ها بهتر است سر لوله‌ها را با استفاده از پارافيلم مسدود نموده و با واژگون نمودن لوله‌ها آنها را مخلوط نماييم. دما در اين مرحله مؤثر بوده و بايستي در محدوده 27-23 درجه سانتيگراد باشد. لوله‌هاي بلانك را پس از 20 دقيقه با دور 1500 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ مي‌نماييم. سپس لوله‌هاي آزمايش را پس از 35 دقيقه كاملاً مخلوط نموده و جذب نوري آنها را در طول موج 405 يا 420 نانومتر در مقابل محلول رويي لوله‌هاي بلانك قرائت مي‌نماييم. رعايت زمان 35 دقيقه در اين آزمايش كاملاً ضروري است.
| هر نمونه بايد در مقابل بلانك مربوط به خود اندازه‌گيري شود. |
| لوله بلانك
(ميلي ليتر) |
لوله استاندارد
(ميلي ليتر) |
لوله تست
(ميلي ليتر) |
لوله‌ها
محلول |
| 1/6 | نمونه ادرار سانتريفوژ شده | ||
| 1/6 | استاندارد | ||
| 1/6 | سرم فيزيولوژي | ||
| 0/4 | 0/4 | 0/4 | TCA 5/12 درصد |
| به آرامي لوله را مخلوط مي‌نماييم (دماي 27-23 درجه).
لوله‌هاي بلانك را پس از 20 دقيقه با دور 1500 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ مي‌نماييم. لوله‌هاي آزمايش را پس از 35 دقيقه كاملاً مخلوط نموده و جذب نوري آنها را در طول موج 405 يا 420 نانومتر در مقابل محلول رويي لوله‌هاي بلانك قرائت مي‌نماييم. |
|||
| كدورت حاصل از اضافه شدن TCA به ادرار به دليل وجود آلبومين و گلبولين مي‌باشد. |
محاسبه:
ميليگرم پروتئين در ادرار 24 ساعته = حجم ادرار 24 ساعته (ميلي ليتر) × ( ) × جذب نوري آزمايش
دامنه مرجع:
با توجه به توانايي اين روش براي سنجش مقادير كم پروتئين (حدود 25 ميليگرم در ليتر پروتئين و بيشتر)، از اين روش مي‌توان براي غربالگري وضعيت كليوي جمعيت‌هاي مستعد به بيماري كليوي مانند مبتلايان به ديابت در راستاي بررسي ميكروپروتئينوري استفاده نمود. در افراد سالم مقدار دفع پروتئين تام تا 150 ميليگرم در 24 ساعت (150 mg/24 hours) و در بچه‌ها کمتر از 4 میلیگرم به ازای هر متر مربع سطح بدن در هر ساعت (< 4 mg/m2/hour) در ادرار طبيعي مي‌باشد.
نتايج مثبت و منفي كاذب:
PH قليايي و پيگمان‌هاي ادرار باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب مي‌شوند.
ممكن است بين نتايج به دست آمده از روش كدورت سنجي TCA و بررسي ادرار توسط نوارهاي ادراري تفاوت وجود داشته باشد. مشاهده نتايج منفي يا مقادير كمي پروتئين با نوار ادراري و نتيجه مثبت با روش TCA به طور همزمان ممكن است به دلايل زير باشد:
وجود پروتئين ميلوما (گاما گلبولين و پروتئين بنس جونز) در ادرار
نمونه‌هاي غير هموژن به علت استفاده از داروهاي خاص مانند Tolmetin و داروهاي ضد التهاب كه در درمان آرتريت روماتوئيد استفاده مي‌شود. متابوليت‌هاي اين داروها مي‌توانند باعث ايجاد نتايج مثبت كاذب شوند.
| تري‌كلرو استيك اسيد، ماده رسوب دهنده‌اي است كه باعث رسوب گاما گلبولين‌ها با كدورت بيشتر از آلبومين مي‌شود، اما در مجموع اين اختلاف زياد نيست. |
پروتئين بنس جونز:
پروتئين بنس جونز شامل دايمرهاي زنجير سبك كاپا يا لامبداي ايمونوگلبولين‌ها است. اين پروتئين نخستين بار به دليل خواص حلاليت غير عادي‌اش توسط هنري بنس جونز در سال 1846 شناخته شد. زماني كه پروتئين بنس جونز به حرارت 60-40 درجه سانتيگراد برسد رسوب كرده، اما زماني كه به جوش مي‌آيد مجدداً حل مي‌شود. پروتئين بنس جونز داراي وزن ملكولي 44000 دالتون است و به آساني از طريق گلومرول‌هاي سالم پالايش مي‌شود.
انجام آزمايش پروتئين بنس جونز، قسمتي از آزمايش ادرار نيست، اما اين پروتئين را شايد بتوان به طور اتفاقي در روش حرارتي اندازه‌گيري پروتئين تشخيص داد. اگر درخواست براي پروتئين بنس جونز باشد، ابتدا به عنوان آزمايش بيماريابي براي تمام پروتئين‌ها، آزمايش اسيد سولفوساليسيليك انجام مي‌شود. اگر نتيجه منفي شد، هيچ پروتئيني از جمله پروتئين بنس جونز وجود ندارد و اگر نتيجه آزمايش مثبت شد، آزمايشات بيشتري لازم است تا مشخص شود كه اين رسوب ايجاد شده مربوط به پروتئين بنس جونز يا ديگر پروتئين‌هاست.
بهترين روش براي مشخص كردن حضور پروتئين‌هاي بنس جونز، روش الكتروفورز و ايمونوالكتروفورز با استفاده از آنتي‌سرم‌هاي اختصاصي روي نمونه ادرار تغليظ شده مي‌باشد.
روش اسباخ:
در لوله اسباخ كه يك لوله مدرج است، تا خط نشانه اول از معرف اسباخ مي‌ريزيم، سپس تا خط نشانه دوم به آن ادرار اضافه كرده و خوب بهم مي‌زنيم. به مدت 24 ساعت آن را به صورت عمودي و بدون حركت روي سطح صاف قرار مي‌دهيم. پس از آن، ميزان رسوب ايجاد شده را از روي درجه‌هاي لوله اسباخ قرائت مي‌كنيم و مقدار آن را كه معرف مقدار پروتئين در ادرار 24 ساعته است ثبت مي‌نماييم.؟
روش‌هاي تشخيص پروتئين بنس جونز:
1- روش رسوب با استفاده از حرارت (Heat Percipitation Test):
پروتئين بنس جونز در دماي 60-40 درجه سانتيگراد (دماي اپتيمم 56 درجه سانتيگراد) رسوب نموده اما مجدداً در دماي 100 درجه سانتيگراد حل مي‌گردد. با سرد شدن دوباره در حدود دماي 60 درجه سانتيگراد رسوب نموده و دوباره در دماي زير 40 درجه سانتيگراد حل مي‌شود.
روش انجام آزمايش:
چند ميلي‌ليتر از ادرار سانتريفوژ شده را در يك لوله آزمايش مي‌ريزيم و با استفاده از اسيد استيك 10 درصد، PH آن را به 5/5-5 مي‌رسانيم. سپس به مدت 15 دقيقه در آب گرم 56 درجه سانتيگراد قرار مي‌دهيم. اگر رسوبي تشكيل شد مي‌تواند دلالت بر حضور پروتئين بنس جونز داشته باشد.
چنانچه رسوب تشكيل شد، لوله آزمايش را در آب جوش قرار داده و اجازه مي‌دهيم به مدت سه دقيقه بجوشد. كاهش و حل شدن رسوب مربوط به پروتئين بنس جونز است، در حاليكه افزايش رسوب مربوط به ساير پروتئين‌هاست.
اگر در حرارت 100 درجه سانتيگراد رسوب زيادتري تشكيل شد، ادرار را صاف مي‌كنيم تا اثر افزايش رسوب مربوط به ساير پروتئين‌ها حذف شود. پروتئين بنس جونز در اين دما به صورت محلول بوده و در مايع صاف شده باقي مي‌ماند.
با سرد كردن مايع صاف شده از حرارت 100 درجه سانتيگراد به پايين‌تر، پروتئين بنس جونز در حدود دماي 60 درجه سانتيگراد رسوب مي‌نمايد و در دماي زير 40 درجه سانتيگراد، رسوب حاصله حل مي‌گردد.
2- آزمايش تولوئن سولفونيك اسيد:
معرف Toluence Sulfonic Acid (TSA)، پروتئين بنس جونز را رسوب مي‌دهد و با اين روش مي‌توان مقادير حدود 03/0 ميليگرم در ميلي‌ليتر را تشخيص داد. در اين روش، آلبومين رسوب داده نمي‌شود اما گلبولين‌ها در غلظت بالاي 500 ميليگرم در ميلي‌ليتر جواب مثبت مي‌دهند.
معرف TSA:
شامل 12 گرم پاراتولوئن سولفونيك اسيد در 100 ميلي‌ليتر اسيد استيك گلاسيال مي‌باشد.
روش انجام آزمايش:
ابتدا 2 ميلي‌ليتر از ادرار تميز و شفاف را در لوله آزمايش مي‌ريزيم. سپس يك ميلي‌ليتر از معرف TSA را به آرامي از كنار لوله به آن اضافه مي‌نماييم (به مدت 30-15 ثانيه، اضافه كردن معرف را طول مي‌دهيم). با انگشت ضربه‌اي آهسته به لوله مي‌زنيم تا محتويات آن مخلوط شوند. تشكيل رسوب در مدت 5 دقيقه، دلالت بر حضور زنجيره‌هاي سبك آزاد در ادرار مي‌نمايد.
در جدول زير، دلايل ايجاد پروتئينوري به صورت كلي آورده شده است.
| Outline of causes of proteinuria | ||
| Albumin up to 35 mg/24 hrs | Normal proteinuria | |
| Tomm-Horsfall up to 50 mg/24 hrs | ||
| Congestive heart failure |
Prerenal proteinuria
|
|
| Orthostatic proteinuria | ||
| Transient, associated with febrile illness, surgery, anemia, hyperthyroidism, stroke, exercise, seizures | ||
| Bence jones proteinuria associated with myeloma, Waldenstrom,s macroglobulinemia, amyloidosis | ||
| Lysozyme associated with myelocytic leukemia | ||
| Renovascular hypertension |
Renal proteinuria
|
|
| Malignant hypertension of any cause | ||
| Membranous nephropathy and proliferative glomerulonephritis |
Glomerular
|
|
| Chronic pyelonephritis | ||
| Polycystic disease | ||
| Diabetic nephropathy | ||
| Amyloidosis | ||
| Lupus erythematosus | ||
| Goodpasture,s syndrome | ||
| Renal vein thrombosis | ||
| Minimal change nephropathy | ||
| Proteinuria > 3.5 g/24 hrs
Usually reflects a glomerular lesion |
||
| High molecular weight proteinuria | ||
| Fanconi syndrome |
Tubular |
|
| Wilson,s disease | ||
| Renal tubular acidosis | ||
| Heavy metal poisoning:
Lead Mercury Cadmium |
||
| Galactosemia | ||
| Low molecular weight < 6000 proteinuria | ||
| Beta-2-microglobulinemia (Mw 11800) | ||
| < 1 g/24 hrs | ||
| Bacterial pyelonephritis |
Intrstital
|
|
| Uric acid, urate or calcium deposition | ||
| Idiosyncratic drug reaction:
Methicillin Phenindione Sulfonamides Phenytoin Others |
||
| Interstitial diseases generally
Reflected as tubular defects Or mixed tubular interstitial |
||
References:
1- Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diadnosis. 2006; 4th Edition.
2- Henrys Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 2007; 21st Edition.
3-Bernard JH. Clinical diagnosis and management by laboratory Methods. 19th Edition. New York. W.B.Saunders Company. 1996; PP: 142-147, 164-165, 241-243.
4-Ginsberg JM, Chang BS, Matarese RA, et al: Use of single voided urine samples to estimate quantitative proteinuria.. N Engl J Med 1983; 309:1543-1546.
5- Lawrence A. Kaplan and Amadeo J. Clinical chemistry. 5th Edition.1989.
6-Pagana KD and Pagana TJ. Diagnostic and laboratory test refrence. 2005; 7th Edition. 7-Your Kidneys and How They Work. National kidney and Urological Disease Information Clearing house. 2007.
- رستمي م. و جرفي م. تست‌هاي جايگزين اندازه‌گيري پروتئين در ادرار 24 ساعته. پزشك و آزمايشگاه. بهار 1388. سال هشتم. شماره 38-37. صفحات 8-7.
- علي‌محمدي م. و رستمي م. بيوشيمي عملي با تكيه بر نكات باليني. انتشارات راز نهان. تهران. 1390. چاپ اول.
- مراد رستمي، معصومه جرفي و محمد علي‌محمدي. اندازه‌گيري پروتئين ادرار 24 ساعته. مجله تشخيص آزمايشگاهي، آذر و دي 1391، سال پانزدهم، شماره 83-84، صفحات 29-26.
- لورين گراف س. (ترجمه اكبرزاده خياوي ع. و فتح‌اله‌زاده ف.). بيوشيمي ادرار. انتشارات نور دانش. تهران. 1380. چاپ اول.
-
کاهش 70 درصدی خطاهای آزمایشگاهی با دانستنی‌های قبل از آنالیز 8
- https://medlineplus.gov/lab-tests/protein-in-urine/
- https://www.healthline.com/health/urine-protein-test
-
برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام
بسیار مفید بود ممنون از شما
شما در مورد انجام تست ها و اساس آنها هم مطلب دارید اگه بذارید ممنون بازم