کنترل کیفی در آزمایشگاه میکروب شناسی

کنترل کیفی در آزمایشگاه میکروب شناسی 

مریم ترابی رپو-کارشناس ارشد میکروب شناسی – بیمارستان شهید بهشتی شیراز

مواظبت کردن از وسایل آزمایشگاهی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. اگر وسایلی را که استفاده می‌کنیم از نظر کیفیت وضعیت خوبی نداشته باشند یا به طور مطلوب نگهداری نشوند کیفیت آزمایش‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد.

این گفتار دستگاه‌ها و وسایل کار را از دیدگاه کنترل کیفی مورد بررسی قرار می‌دهد.

 

انكوباتور

انكوباتور محفظه عايق بندي شده‌اي است كه دما و رطوبت را كنترل کرده و محيط را براي رشد ميكروارگانيسم‌ها فراهم می‌سازد. برخی از انكوباتورها براي نگهداري ميزان مطلوب از دی‌اکسیدکربنCo₂  براي ميكروب‌هايي كه برای رشد به CO2 نیاز دارند (Capnophilic) در دسترس هستند.

– انكوباتور بدون Co₂:

در این انکوباتور نمونه‌ها باید بطور مناسب روي سيني‌ها يا قفسه‌ها قرارگیرد.

مي‌توان با قرار دادن يك مخزن آب در كف انكوباتور، رطوبت مورد نیاز را حفظ کرد.

– انكوباتور Co₂دار:

دراین انکوباتور برای تأمین دی‌اکسید کربن مورد نیاز از کپسول گازCO2  استفاده می‌شود.

در صورت اتمام كپسول گاز Co₂، تا زمان شارژ مجدد مي‌توان جهت انكوباسيون نمونه‌هاي نيازمند Co₂ از جار بیهوازی یا کندل جار که از سوزاندن شمع به عنوان منبع CO2 استفاده می‌شود بصورت جايگزين استفاده کرد.

– مراقبت از انکوباتور:

• همه انكوباتورها بايد بطور ماهانه با محلول صابون ملايم تميز شوند.
• كپسول‌هاي Co₂ به منظور رعايت موارد ايمني، بايد به صورت ايستاده با زنجير سنگين به ديوار محكم شوند.

زماني كه از سيلندرها استفاده نمي‌شود، سوپاپ‌ها و درپوش‌ها بايد به طور محكم بسته شوند. سيلندرهاي خالي را روي حمل كننده سيلندر گاز به طور محكم با زنجير نگهداري كنيد. هرگز سيلندرهاي گاز را در دماي بالاتر از 52 درجه سانتیگراد یا 125 درجه فارنهایت نگهداري نكنيد. جهت جلوگیری از نشت، سيلندرها را در وضعيت افقي قرار ندهيد.

برای کنترل وضعیت CO2 انکوباتور، يك كشت از نيسريا گونوره در انكوباتور قرار دهيد، هر روز آن را پاساژ داده و رشدش را بررسي نماييد. اين ارگانيسم به  Co₂ نياز كامل دارد.

 

اتوكلاو

اگر چه اتو كلاو بهترين وسيله براي استريليزاسيون است، ولي طولاني شدن مرحله گرمايي، سبب كاهش كيفيت مواد مغذي در محيط‌هاي كشت كمپلكس محتوي قند، مواد معدني و فلزي مي‌شود و در نتيجه به محيط‌هاي كشت زيان وارد مي‌كند، بنابراين در چرخه‌ي استريليزاسيون بايد از زمان كوتاهتر و دماي بالاتر استفاده كنيم تا علاوه بر آنكه آسيب كمتري به محيط كشت وارد شود، براي ارگانيسم كشنده‌تر باشد.

– انواع استريليزاسيون

• استريليزاسيون محيط‌هاي كشت و محلول‌ها
• استريليزاسيون مواد مصرفي آلوده
• استريليزاسيون مواد خشك بسته بندي شده

نکات کاربردی:

• بهتر است از لوله و ارلن با در پيچ‌دار شل که بيشتر از آن پرنشده است استفاده کنید.
• جهت برقراری جریان مناسب سفارش می‌شود که از قرار دادن اشيا بر روي يكديگر بپرهيزيد و بايد فاصله اشيا از يكديگر و از ديواره‌هاي اتوكلاو حداقل 5 سانتيمتر باشد.
• چرخه‌ي استريليزاسيون بايد متناسب با زمان نفوذ گرما در نظر گرفته شود، براي مثال محتويات يك ظرف يك ليتري محيط كشت بايد طي 15 دقيقه از زمان رسيدن محفظه به دمايc ˚121، به اين دما برسد.

 

• استريليزاسيون مواد مصرفي آلوده
• مواد مصرفي آلوده را جدا نموده و در كيسه‌هاي قابل اتوكلاو قرار دهيد و بر روي آنها برچسب خطر بیولوژیک (Biohazard) نصب كنيد.
• براي اطمينان از نفوذ بخار به همه قسمت‌هاي كيسه، يا گره آن را شل كنيد يا قبل از محكم كردن گره، يك پيمانه (0.3 ليتر) آب به آن اضافه كنيد.
• براي جلوگيري از مسدود شدن آبگذر اتاقك اتوكلاو توسط آگار مذاب، كيسه‌ها را داخل سطل فلزی قرار دهيد.
• زمان لازم براي استريليزاسيون زباله، 60-30 دقيقه در 121 درجه سانتيگراد يا 30-15 دقيقه در 134 درجه سانتيگراد مي‌باشد.
• استريليزاسيون مواد خشك بسته بندي شده از قبیل سوآب و لوله آزمایش:
• بسته‌ها را طوري در اتوكلاو قرار دهيد كه حداكثر چرخش بخار در بين آنها ايجاد شود وبا ديواره‌هاي اتوكلاو نيز تماسي نداشته باشند.
• کنترل اتوکلاو با تست شيميايي:
• نوار كاغذي TST Tempreture ,Steam ,Time)): این نوار در هر سری کاری سه عامل زمان، بخار و دما را كنترل مي‌كند و از زرد به بنفش تغيير رنگ مي‌دهد.
• کنترل اتوکلاو با تست بيولوژيك:

استفاده از ويال حاوي اسپور باسيلوس استئاروترموفيلوس ATCC 79 53 بطور هفتگي سفارش مي‌شود، زیرا اسپورهای این باکتری به عنوان مقاوم‌ترین اسپورها به حرارت در اتوکلاو با درجه حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه از بین می‌روند. پس از پایان استریلیزاسیون، ویال را خارج کرده و با فشار به جداره آن محوطه درونی حاوی اسپور را می‌شکنند تا اسپورها در محیط کشت آزاد شوند؛ سپس این محیط را در حرارت 55 درجه سانتیگراد قرار داده و در مدت یک هفته از نظر تغییر رنگ اندیکاتور موجود محیط کشت را کنترل می‌کنند. در صورتی که تغییر رنگ مشاهده نشد یعنی اسپورها در اثر استریلیزاسیون مرده‌اند و استریلیزاسیون کامل صورت گرفته است در صورت تغییر رنگ اندیکاتور محیط کشت یعنی اسپورها زنده مانده‌اند.

• راهبردهای ايمني هنگام کار با اتوکلاو:
• از دستكش مقاوم به حرارت و محافظ چشم استفاده كنيد.
• بعد از اتمام کار وقتي فشار اتاقك اتوكلاو به صفر رسيد درب آنرا باز كنيد. منتظر بمانيد تا ظروف كمي خنك شوند، سپس آنها را حمل كنيد.
• هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه اقدام به بارگذاري يا خارج نمودن وسايل و مواد ننماييد.
• هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه و اتصال الکتریکی آن به پريز، اقدام به تميز نمودن آن نكنيد.
• هرگز پيچ‌هاي محكم كننده‌ي درب را در هنگام كار دستگاه شل و سفت نكنيد.

 

 فور (OVEN):

فور براي استريل كردن وسایلی كه نبايد بطور كامل تحت نفوذ بخار قرار گيرند، اما مي‌توانند دماي بالاي مورد نياز مثـل 160-180˚c را تحــمل كنند، به كار مي‌رود. فور بويژه براي ظروف شيشه‌اي مثل لوله آزمايش، پتري‌ ديش، پيپت و نيز براي آلات فلزي مثل پنس، اسكالپل و قيچي به كار مي‌رود.

فور بايد داراي فن (جهت چرخش هواي متراكم در سراسر اتاقك)، نشانگر درجه حرارت، ترموستات و تايمر، طبقات مشبك، قفل داخلي درب و عايق بندي مناسب جداره‌ها باشد.

استريليزاسيون در فور:

• براي بسته بندي وسايل جهت استريل نمودن آنها در فور مي‌توان از فويل آلومينيومي يا كاغذ كرافت (کرافت به آلمانی معنی قدرت را می‌دهد و کاغذ کرافت از نظر مقاومت، ماده‌ای قوی محسوب می‌شود) استفاده نمود.
• حدود 2 سانتيمتر از انتهاي فوقاني پيپتها را با پنبه‌ي غير جاذب ببنديد و آنها را در ظروف فلزي قرار داده، درب آنها را ببنديد.
• در صورتي مي‌توان بطري‌هاي درپوش‌دار را در آون استريل كرد كه درپوش و آستري آنها از موادي مثل فلز، پلي‌پروپلين يا لاستيك سيليكون ساخته شده ‌باشد تا در دماي استريليزاسيون از شكل طبيعي خارج نشوند.
• پودر، چربي، روغن و گريس مثل پارافین را در ظرف شيشه‌اي يا فلزي استريل نماييد.
• قبل از قرار دادن ظروف شیشه‌اي در آون، از خشك بودن آنها مطمئن شويد. مواد را به گونه‌اي در آون قرار دهيد كه هواي داغ در اطراف و مابين آنها در جريان باشد.
• زمان استريليزاسيون از وقتي آغاز مي‌شود كه اتاقك به دماي استريل انتخابي برسد و نيز مدتي هم بيشتر در نظر گرفته مي‌شود تا همه قسمت‌هاي اتاقك و مواد داخل آن به دماي مورد نظر برسند (c˚180-160 به مدت 2 ساعت).
• به دليل عايق بودن دستگاه، چند ساعت طول مي‌كشد تا اشياء داخل آن خنك شود، مگر آن كه مجهز به فن باشد. درب آون را باز نكنيد تا اتاقك، ظروف و مواد داخل آن تا دماي حدود60 ˚c خنك شوند. اگر هواي سرد ناگهان وارد دستگاه شود ممكن است ظروف شيشه‌اي ترك بخورند.

کنترل فور با تست بيولوژيك:

استفاده از ويال حاوي اسپور باسيلوس استئاروترموفيلوس ATCC 7953

براي ارزيابي فور نوار بيولوژيك را در يك لوله آزمايش گذاشته و در محل‌هايي با تراكم بيش از حد وسايل و نقاط كور دستگاه قرار مي‌دهيم و پس از طي شدن فرايند استريليزاسيون آنها را براي كشت به آزمايشگاه ارسال مي‌كنيم، اگر كشت مثبت اعلام گرديد نشانه ناكارآمدي دستگاه است.

• ايمني:

استفاده از دستكش مقاوم به حرارت و محافظ چشم

 

کنترل کیفی محیط‌های کشت:

محيط‌هاي كشت نقش اساسي را در آزمايشگاه ميكروب شناسي ايفا مي‌كنند و بطور گسترده‌اي جهت جدا‌سازي ارگانیزم‌ها، تعيين سوش و آنتي‌بيوگرام ميكروارگانيسم‌هاي بيماريزا بكار مي‌روند. بسياري از آزمايشگاه‌ها بطور روتين محيط‌هاي كشت مورد نياز براي مصارف تشخيصي و تحقيقاتي را خودشان تهيه مي‌نمايند؛ با اين همه اطمينان از اينكه محيط‌هاي كشت، كيفيت خوب و نتايج مطلوبي داشته باشند بايستي در تهيه و مصرف محيط‌هاي كشت معيارهاي زير را در نظر گرفت:

• مواد خام

كيفيت محيط‌ها بطور مستقيم بستگي به كيفيت مواد خام مورد استفاده در تهيه آنها دارد. آب يكي از مهم‌ترين مواردي است كه در تهيه محيط‌هاي كشت بكار مي‌رود. سه معيار مهم آب مورد استفاده در تهيه محيط‌هاي كشت شامل وجود يون‌هاي مس، قدرت هدايت الكتريكي وpH  مي‌باشد. در شرايط ايده‌آل نبايد يون‌هاي مس در آب مورد استفاده جهت تهيه محيط‌هاي كشت وجود داشته باشد چون خاصيت مهار كنندگي براي ميكرو‌ارگانيسم‌ها را دارد. pH آب مورد استفاده بهتر است كمي اسيدي باشد ولي در هر حال نبايد كمتر از 5/5 باشد.

• پتري ديش:

كيفيت پتري ديش‌هاي مورد استفاده در تهيه محيط نيز اهميت دارد. معمولأ پتري ديش‌ها را با اتيلن اكسايد و يا اشعه گاما استريل مي‌كنند. در صورت استفاده از پتري ديش‌هايي كه با اتيلن اكسايد استريل شده باشند بايستي به روش كروماتوگرافي وجود يا بقاياي اين ماده بررسي شود. اتيلن اكسايد داراي خاصيت مهار كنندگي براي ميكروارگانيسم‌ها مي‌باشد.

• استريل كردن محيط‌هاي كشت:

استريل كردن، يك مرحله اساسي در تهيه محيط‌هاي كشت است. معمولأ براي استريل كردن محيط‌هاي كشت از اتوكلاو استفاده مي‌كنند، با اين همه ارتباط نزديكي بين مدت زمان لازم جهت استريل كردن و حجم محيط وجود دارد. حرارت بيش از حد ممكن است منجر به تخريب محيط‌هاي كشت گردد، بنابراين تنظيم دما و مدت زمان آن اهميت ويژه‌اي دارد. در شرايط معمولي دماي 121 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه براي استريل كردن يك ليتر محيط كشت كافي است. در صورتيكه حجم محيط كشت بيش از يك ليتر باشد ممكن است مدت زمان بيشتري لازم باشد.

-پارامترهاي فيزيكي:

محيط كشت‌هاي تهيه شده بايد از لحاظ فيزيكي و ظاهري بررسي شوند. معيارهاي ظاهري قابل بررسي شامل وجود حباب، حفره، ناصافي سطح محيط، ترك خوردگي و يخ زدگي مي‌باشد. ضخامت محيط نيز اهميت دارد. ضخامت محيط كشت در پليت 4 ميليمتر است.

• نگهداري محيط‌هاي كشت تهيه شده:

طول عمر محيط‌هاي كشت بستگي به محتویات محیط کشت، نحوه نگهداري و انبار كردن آنها دارد. تمامي محيط‌هاي كشت بايد دور از نور آفتاب نگهداري شوند. تابش نور به محيط‌هاي كشت موجب تشكيل مواد باكتريواستاتيك و باكتريوسايد مانند پراكسيداز مي‌گردد. حداقل طول عمر پلیت‌های کشت در دماي 4 درجه سانتيگراد يك هفته مي‌باشد، ولي اگر در داخل كيسه‌هاي پلاستيكي بسته بندي شوند بطوريكه هوا داخل آنها نفوذ نكند 4-3 هفته قابل مصرف هستند. طول عمر محيط‌ كشت‌هاي حاوي آنتي‌بيوتيك بستگي به پايداري آنتي‌بيوتيك موجود در آن دارد. در مجموع محيط‌هاي حاوي آنتي‌بيوتيك را در عرض يك هفته بايد مصرف كرد.

از سوي ديگر با گذشت زمان اينگونه محيط‌هاي كشت رطوبت خود را از دست داده، بدليل افزايش غلظت آنتي‌بيوتيك قدرت انتخابي آنها افزايش مي‌يابد. دماي پليت‌ها را بايد قبل از مصرف به دماي اتاق رساند. اگر پليت محيط كشت بيش از 8 ساعت در دماي اتاق باقي بماند براي مصرف مناسب نيست. محيط‌هاي كشت تهيه شده در لوله در مقايسه با محيط‌هاي كشت پليتي عمر طولاني دارند. اگر اين محيط‌هاي كشت تهيه شده در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري شوند 6-3 ماه قابل مصرف مي‌باشند.

 

اشكالات رايج در محيط‌هاي كشت

اشكال	علت
نرم بودن آگار	حرارت بيش از حد، pH پايين كه موجب هيدروليز آگار مي‌گردد. اشتباه در وزن کردن، مخلوط نكردن خوب و عدم حل شدن
pH نامناسب	استفاده از شيشه‌هاي قليايي، آب ناخالص، حرارت بيش از حد، آلودگي شيميايي، اندازه‌گيريpH  در حرارت نامناسب، استفاده از pH متر استاندارد نشده و استفاده از پودرهاي محيط كشت خراب شده
رنگ نامناسب	ناخالص بودن آب، استفاده از شيشه آلات كثيف، استفاده از پودرهاي محيط كشت خراب شده، حرارت دادن بيش از حد و pH نامناسب
تيره شدن محيط	حرارت دادن بيش از حد، استفاده از پودرهاي محيط كشت خراب شده
رشد ضعيف ارگانيسم	استفاده از آب و يا شيشه آلات آلوده، استفاده از پودرهاي محيط كشت خراب شده، توزين غلط و عدم بهم زدن كافي محيط و حرارت بيش از حد.
افتراق رنگی ضعیف محیط کشت با رشد میکروب‌ها	استفاده از آب و يا شيشه آلات آلوده، استفاده از پودرهاي محيط كشت خراب شده، توزين غلط و عدم بهم زدن كافي محيط و حرارت بيش از حد.

 

 

نگهداري ديسك‌هاي آنتي بيوتيكي

• ديسك‌ها بايد در دمای-8 تا -14 درجه سانتیگراد نگهداري شوند.
• تمامي ديسك‌هاي آنتی‌بیوتیکی گروه بتالاكتام مانند پني‌سيلين، آمپي‌سيلين، كربني‌سيلين، تيكارسيلين، اگزاسيلين و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورين‌ها و… بايد در فريزر نگهداري شوند و فقط مي‌توان مقداري از آن را بر اساس كار روزانه آزمايشگاه حداكثر به مدت يك هفته در يخچال معمولی نگهداري نمود.
• ديسك‌ها بايد در ظروف داراي درپوش محكم و حاوي مواد جاذب رطوبت نگهداري شوند.
• ديسك‌هاي آنتي‌بيوتيكي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.

 

تست حساسیت:

تست حساسیت با توجه به رشد نمونه و اهمیت ارگانیسم توسط روش نیمه مک فارلند یا روش استاندارد دیسک دیفیوژن کربی‌بایر انجام می‌شود.

– نگهداري طولاني مدت

براي نگهداري سويه‌هاي باكتري مي‌توان از روش‌هاي طولاني و كوتاه مدت استفاده نمود.

بهترين روش‌هاي نگهداري طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze drying) و نگهداري در دماي 70- درجه سانتيگراد يا پايين‌تر (در ديپ‌فريز يا در نيتروژن مايع) مي‌باشد.

در صورت عدم دسترسي به فريزر 70- درجه مي‌توان سويه‌هاي با رشد سريع را در فريزر 20- درجه نيز نگهداري نمود. در اين شرايط توجه به نكات زير ضروري است:

سويه‌هاي سخت رشد مانند هموفيلوس آنفلوآنزا و نيسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نمي‌باشند و بايد در فريزر 70- درجه نگهداري شوند.

روش دیگر استفاده از روغن معدني در دماي اتاق می‌باشد که در این روش روغن معدني (يا پارافين مايع) را در حرارت خشك (170 درجه سانتيگراد به مدت يك ساعت) استريل می‌نمایند و سپس ميكروب مورد نظر را روي محيط كشت داده و بعد از بدست آوردن كشت كافي، روغن استريل را به مقدار cc 1 روي سطح محيط می‌ریزند.

 

کشت خون

بروز سپسیس در سراسر جهان دارای ابتلا و مرگ و میر در حال افزایشی است. آشکار سازی سریع و دقیق باکتریمی برای بهبود وضعیت بیمار ضروری است. مراقبین بهداشتی، پرستاران و احتمالاً بسیاری از کارکنان آزمایشگاهی آموزش لازم و کافی در تکنیک‌های صحیح کشت خون را فرا نگرفته‌اند. از دیرباز پزشکان و میکروبیولوژیست‌ها به اهمیت کشت خون بعنوان یکی از مهم‌ترین تست‌های آزمایشگاهی برای تشخیص بیماری‌های مهلک پی برده بودند. در سال‌های اخیر مشخص شده که کشت‌های خون آلوده شده (ورود و حضور یک پاتوژن از خارج از جریان خون) که منجر به نتایج مثبت کاذب می‌شوند شایع هستند. کشت‌های خون آلوده شده حدود نصف و یا بیشتر از نیمی از موارد تمام کشت‌های خون مثبت را در بعضی مراکز به خود اختصاص می‌دهند و این مسئله هم موجب تحمیل هزینه‌های بسیار برای بیماران و نیز سیستم مراقبت بهداشتی و درمانی شده و همچنین باعث سردرگمی تکنیسین‌ها شده است.

دلائل متعددی وجود دارد که چرا کشت‌های خون غالباً آلوده می‌شوند؛ احتمالاً مهم‌ترین فاکتور مربوط به نحوه‌ی نمونه‌گیری است که پرستار یا نمونه‌گیر از تکنیک مناسب آسپتیک استفاده نمی‌کند. مطالعات مختلف نشان می‌دهند که فلبوتومیست‌های آموزش‌دیده و یا تیم‌های کشت خون نسبت به سایرین دارای میزان کمتری از کشت‌های خون آلوده هستند. فاکتور دوم مربوط به ماده‌ی آسپتیک به تنهائی است، تنتور ید و کلرهگزیدین گلوکونات (chlorhexidine gluconate) برای استریلیزاسیون پوست نسبت به یدوفورها مثل پوویدون ایوداین (povidone iodine) بسیار مؤثرتر هستند. فاکتور سوم طریقه فراهم کردن نمونه‌ی خون برای کشت است.

در سالیان اخیر تمایلی برای بدست آوردن نمونه از طریق کاتترهای داخل رگی و یا از طریق دستگاه‌های دیگر مثل پورت‌ها پدید آمده و کشت‌های خون بدست آمده از این طریق بیشتر از نمونه‌هائی که از طریق خونگیری از عروق محیطی صورت گرفته آلودگی نشان داده‌اند. چهارمین علت سیستم‌های کشت خون مدرن و محیط‌های کشتی است که در آنها از رزین‌های باند شده به آنتی‌بیوتیک و یا ذغال فعال استفاده می‌کنند. این سیستم‌ها اگرچه پاتوژن‌های بیشتری را آشکار می‌کنند اما از طرف دیگر استافیلوکوک‌های کوآگولاز منفی را بعنوان شایع‌ترین آلوده‌کننده‌ی کشت خون افزایش داده‌اند.

برای کشت خون معمولاً یک ست نمونه به بطری کشت هوازی و دیگری به بطری کشت غیرهوازی اضافه می‌شود. نخست نمونه را با سرنگ به بطری بی‌هوازی اضافه کرده و چنانچه حباب هوا در سرنگ باشد ابتدا به بطری هوازی خون اضافه می‌شود. مقدار خون دريافتي لازم از بزرگسالان 10 الي 20 ميلي‌ليتر مي‌باشد. از كودكان و نوزادان 1 الي 5 ميلي‌ليتر خون دريافت مي‌شود. محيط‌هاي كشت خون در داخل بطري‌هاي شيشه‌اي در اندازه‌هاي متفاوت بصورت هوازي و ميكرو    آئروفيليك و بيهوازي توسط شركت‌هاي مختلف توليد مي‌شوند. مقدار تلقيح نمونه خون بايد به نسبت يك به پنج تا يك به ده در نظر گرفته شود.

آلوده كننده‌هاي كشت هاي خون:

با ضدعفوني كردن محل خونگيري، رعايت كامل شرايط ستروني و استاندارد در موقع خون‌گيري و تلقيح مستقيم خون به داخل بطري كشت خون مي‌توان تا حد زيادي از آلوده شدن كشت‌هاي خون جلوگيري نمود، هر چند حتي با رعايت اين موازين و در بهترين شرايط كاري حدود 3% تا 5% كشت‌هاي خون در معرض آلودگي قرار مي‌گيرند. اين آلودگي مي‌تواند منشأ پوستي يا محيطي داشته باشد. با اين حال، چنين ارگانيسم‌هايي گاهي به عنوان عامل بيماريزاي واقعي عمل نموده و مي‌توانند موجب اندوكارديت شوند. شرايطي كه يك عفونت واقعي را ترسيم مي‌كنند بدين شرح است:

– اگر يك ارگانيسم در هر دو بطري كشت رشد نمايد.

-اگر همان ارگانيسم در محيط‌هاي كشتي كه با بيش از يك نمونه بيمار كشت مجدد شده باشد، رشد نمايد.

– اگر رشد سريع باشد (در عرض 48 ساعت).

– اگر ايزوله‌هاي مختلف يك گونه عيناً همان الگوي بيوتيپ و حساسيت دارويي را نشان دهند.

احتياط‌هاي ايمني:

براي اجتناب از بروز عفونت نبايد از يك محل دو بار اقدام به خونگيري شود. در مورد خون اخذ شده از بيماران مبتلا به عفونت‌هاي جدي (هپاتيت و ایدز) هنگام تزريق خون به درون شيشه‌هاي كشت خون بايد دقت نمود تا سرسوزن در دست فرد خونگير فرو نرود. سر‌سوزن‌هاي استفاده شده بدون گذاشتن درپوش آن، در ظروف خاص قرار داده مي‌شود.

زمان نمونه‌گيري:

خونگيري از بيمار حتي‌المقدور قبل از تجويز آنتي‌بيوتيك بايد انجام گيرد، گرچه بهترين زمان خونگيري دقيقاً قبل از شروع تب و لرز بيمار است، ولي آنچه كه مهم است حجم خون كافي براي كشت است. توصيه مي‌شود 2 تا 3 نمونه خون به فاصله يك ساعت از بيمار گرفته و كشت داده شود. خونگيري بيش از 3 بار ندرتاً لازم مي‌شود. اگر فرصت كافي قبل از شروع درمان وجود نداشته باشد از دو ناحيه بطور جداگانه مقدار 30 ميلي‌ليتر خونگيري انجام مي‌گيرد. در موارد تب با علت ناشناخته FUO، انجام 4 كشت خون جداگانه (در دو روز و هر روز 2 كشت) مي‌تواند اكثر عوامل بيماريزا را مشخص سازد.

نگهداري و انتقال:

انتقال نمونه خون در عرض 2 ساعت در حرارت اتاق انجام می‌گیرد. در صورتی که تأخیر بین گرفتن نمونه و کشت بیشتر باشد باید نمونه در حرارت 37 درجه سانتیگراد گذاشته شود. شيشه‌هاي كشت خون تلقيح شده  نبايستي در يخچال نگهداري شود. محيط‌هاي كشت خون تهيه شده بلافاصله به آزمايشگاه منتقل شده و در انكوباتور (گرمخانه) قرار داده مي‌شود.

 

مایع نخاع

آزمایش مایع نخاع یک گام ضروری در تشخیص مننژیت باکتریال و قارچی است و CSF نمونه‌ای است که باید هرچه سریعتر آزمایش شود. مایع نخاع به طور طبیعی استریل و شفاف بوده و معمولاً حـــــاوی 5 لکوسیت تک هسته‌ای یا کمتر در میلی‌متر مکعب می‌باشد و هیچ گلبول قرمزی ندارد. ترکیب سلولی و شیمیایی مایع نخاع با التهاب مننژ یا مغز مانند مننژیت یا انسفالیت تغییر می‌کند.

اگر CSF خیلی کدر باشد می‌توان بدون سانتریفیوژ آزمایش کرد. در موارد دیگر CSF را در یک لوله استریل درپیچ‌دار به مدت 15-10 دقیقه سانتریفیوژ کرده و محلول روئی را با پیپت پاستور استریل خارج نموده و آن را در لوله استریل دیگری برای انجام تست‌های شیمی و سرولوژی می‌ریزیم و رسوب را برای میکروب شناسی نگه می‌داریم.

از رسوب تهیه شده حتماً یک لام گرم تهیه کرده و کاملاً بررسی می‌کنیم. حساسیت رنگ‌آمیزی گرم در تشخیص میکروب‌ها 90-60 درصد و وابسته به نوع و تراکم میکروب است. برای بیمارانی که در نمونه CSF تعداد زیادی گلبول سفید دارند ولی در رنگ گرم میکروبی مشاهده نمی‌شود، استفاده از رنگ‌آمیزی آکریدین نارنجی حساس‌تر است.

ممکن است در سطح نمونه CSF توبرکلوزی یا سلی یک لایه شبیه به رشته‌های تار عنکبوت (Cob-Web) مشاهده گردد که سفارش به کشت و رنگ‌آمیزی اسیدفست بر روی همین لایه می‌شود.

اگر در رنگ‌آمیزی گرم باکتری مشاهده شد باید روی محیط کشت مناسب برده شود، مثلاً برای جداسازی هموفیلوس آنفلوانزا از آگار خوندار، از یک کشت استافیلوکوک اورئوس که رشد آن را تحریک کند استفاده می‌کنیم. پلیت‌های آگار خوندار و شکلات آگار باید در 35 درجه سانتیگراد در اتمسفر غنی از CO2 کشت داده شود. همه محیط‌ها را باید به مدت 3 روز در اتو نگهداری کرد.

کریپتوکوکوس نئوفرمنس روی محیط آگار خوندار رشد می‌کند ولی باید محیط کشت را به مدت یک هفته در 35 درجه نگهداری کرد.

خلط

جهت تشخيص سل ريوي «خلط» بهترين نمونه است.

نمونه خلط خوب:

مواد ترشحي حاصل از ريه‌ها پس از سرفه عميق نمونه مناسبي براي آزمايش خلط مي‌باشد.

نمونه‌اي كه از حلق يا بيني ترشح مي‌شود فقط آب دهان بوده و نمونه خوبي نيست. تعداد باسيل‌ها در خلط‌هاي دفع شده در زمان‌هاي مختلف متفاوت مي‌باشد. آزمايش تنها يك نمونه خلط براي تشخيص كافي نيست؛ بنابراين بايد حتماً «سه نمونه از خلط» مورد آزمايش قرار گيرد.

سه نمونه خلط جهت آزمايش:

«نمونه اول» در اولين مراجعه بيمار به واحد بهداشتي دريافت مي‌شود.

«نمونه دوم» خلط صبحگاهي است، براي جمع‌آوري اين نمونه بيمار قبل از برخاستن از جاي خود، پس از يك نفس عميق، با سرفه، خلط خارج شده را در ظرف مي‌ريزد.

«نمونه سوم» همزمان با مراجعه بيمار براي تحويل نمونه دوم (خلط صبحگاهي) به واحد بهداشتي‌ـ درماني، دريافت مي‌شود.

بهتر است حجم خلط بين 3 تا 5 ميلي‌ليتر باشد.

تهیه نمونه خلط:

بیمار ابتدا دهان خود را شسته و دندان‌های خود را بدون خمیردندان مسواک کرده و دندان‌های مصنوعی را بردارد تا احتمال آلودگی نمونه کاهش پیدا کند و سرفه‌های عمیق انجام دهد و در صورت نداشتن سرفه چند بار نفس عمیق از بینی می‌تواند به ایجاد سرفه کمک کند. گاهی بخور آب در ابتدای صبح درست پس از بیدار شدن از خواب قبل از شستشوی صورت گرفتن نمونه را راحت‌تر می‌کند و شستشوی دهان با سرم فیزیولوژی یا حتی غرغره نمودن آب خالی قبل از نمونه‌گیری نیز به کم شدن فلور باکتری‌ها کمک می‌کند. خلط خارج شده در یک ظرف دهان گشاد دردار و دارای مشخصات که آزمایشگاه داده است ریخته شود. بهتر است نمونه خلط در سه ظرف جداگانه و در سه روز متوالی، صبح‌ها جمع‌آوری گردد. در روش‌های غربالگری جدید دو نمونه ابتدای صبح در دو روز متوالی پیشنهاد می‌شود.

 

نمونه‌گیری به وسیله سواب از حلق

از کشت حلق برای شناسایی عوامل باكتريايي فارنژيت استفاده می‌کنیم که مهم‌ترين عامل آن، استرپتوكك بتاهموليتيك گروه Aاست.كورينه باكتريوم ديفتريه هم معمولاً يك غشاء سفيد مايل به خاكستري در محل عفونت (حلق، لوزه و …) به وجود می‌آورد. همچنین فارنژيت گنوككي در برخي از كشورها ديده مي‌شود

آنژين ونسانت: عفونتي است كه توسط برخي باكتري‌هاي گرم منفي بيهوازي به ندرت در حلق ايجاد مي‌شود و ممكن است ايجاد غشاء كاذب نيز بنمايد. در رنگ‌آميزي گرم باسيل‌هاي گرم منفي Fusiform  و اسپيروكت‌ها ديده مي‌شوند كه بايد با عبارتFusospirochetal complex  گزارش شوند.

كانديدوز دهاني: كانديدا به تعداد كم جزء فلور طبيعي دهان است اما در افرادي كه از نظر ايمني ضعيف مي‌باشند باعث بیماری می‌شود.

بوسيله سواب استريل در حالي كه زبان با آبسلانگ نگه داشته شده است از لوزه‌ها و قسمت خلفي حلق و هر جايي كه التهاب و چرك باشد با كمي فشار نمونه برداري بعمل آيد.

كشت در محيط ژلوز خوندار انجام می‌شود و در تست آنتی‌بیوگرام هم يك ديسك كوتريموكسازول و يك ديسك باسيتراسين قرار می‌دهیم که لازم به ذکر است که استرپ گروه آ حساس به باسیتراسین و مقاوم به كوتريموكسازول است. همچنین قرار دادن پليت در جار شمع هموليز را واضح‌تر مي‌كند. پس از 18 ساعت و مجدداً پس از 48 ساعت بايد بدنبال كلني‌هاي ريز كه بوسيله يك هاله نسبتاً وسيع هموليز احاطه شده‌اند جستجو نمود.

 

نمونه برداری از ناحیه نازوفارنکس

نمونه برداری از حفره‌های بینی بیشتر برای مشخص کردن حاملین استافیلوکوک‌های آرئوس مقاوم به متی‌سیلین و مطالعات اپیدمیولوژیک برای کورینه باکتریوم دیفتری و مننگوکوک انجام می‌شود. در سایر موارد کشت حفره‌های بینی ارزش تعیین کننده‌ای ندارد.

نمونه‌گیری از نازوفارنکس روش انتخابی برای جداکردن بوردتلا پرتوسیس می‌باشد. یک اپلیکاتور کنار و داخل حفره‌های بینی کشیده و آن را در لوله کشت استریل قرار داده و به آزمایشگاه ارسال می‌شود. نمونه از پشت سوراخ‌های بینی در مواردی مثل بیماری سیاه سرفه بهتر است از یک اپلیکاتور فنری که از سوراخ‌های بینی وارد شود و پس از عبور از راه‌های هوایی از پشت سوراخ‌های بینی در ناحیه حلق وارد شود تهیه گردد. اپلیکاتور بهتر است 30 ثانیه در محل بماند تا ترشحات بر روی آن جمع شود. سپس آهسته اپلیکاتور را خارج کرده و در لوله کشت به آزمایشگاه منتقل ‌شود.

نکاتی در مورد جمع‌آوری نمونه‌های ژنیتال

برای جمع‌آوری این نمونه‌ها از یک سوآب با قطر کم یا یک لوپ استریل استفاده می‌کنیم. وضعیت سر و بدنه سوآب جهت اینکار مهم است. برای کشت نایسریا گنوره از سوآب‌هایی از جنس داکرون يا ريون استفاده می‌شود زیرا سواب‌های آلژينات کلسيم و بعضی سواب‌های پنبه‌اي مهار کننده نايسريا بوده، لذا بهتر است از سواب داکرون استفاده شود.

نمونه بعد از برداشت باید سریعاً کشت داده شود. اگر کشت فوری نمونه و انکوباسیون آن به به طور سریع امکان‌پذیر نباشد باید از یک محیط نگاهدارنده مانند آمیز (Amies) یا محیط استوآرت استفاده نموده و باید توجه داشت که نمونه را نباید در یخچال نگهداری کرد.

آسپيراسيون آبسه‌ها و کشت آنها:

آسپيراسيون آبسه فقط بايد توسط پزشک صورت گيرد.

پوست روی آبسه/ خيارک بوسيله ايزو پروپيل الکل 70% ضد عفونی شده و مايع به وسيله آسپيراسيون توسط سرنگ استريل جمع‌آوری می‌گردد.

نمونه را به طريق آسپتيک به لوله استريل حاوی محيط انتقالی منتقل کنيد. نمونه‌ها جهت بررسی باکتريولوژيک بايد در محيط استوارت يا آميس و سواب‌های مشکوک به عوامل ويروسی در محيط انتقالی ويروس منتقل گردد.

در صورتی که نتوان نمونه‌ها را تا مدت 2 ساعت بررسی نمود، نمونه‌هاي باکتريايي به مدت 24 ساعت در دماي محيط قابل نگهداری هستند. نمونه‌ها جهت جداسازی عوامل ويروسي در محيط انتقالي منــاسب در دمای °C8-4 قابل نگهداری بوده و در اسرع وقت بايد به آزمايشگاه منتقل گردد.

 

نمونه‌گيري جهت عوامل باکتريايي مولد اسهال

• نمونه مدفوع: حداقل 5 گرم مدفوع بايد در ظرف درپيچ‌دار تميز، عاري از مواد ضدعفوني کننده و يا شوينده جمع‌آوري گردد.
• سواب مقعدي: سواب را با فرو بردن در محيط انتقالي سترون، مرطوب کرده به اندازه 3-2 سانتيمتر در داخل اسفنكتر رکتوم فرو برده و بچرخانيد. سواب را بيرون کشيده پس از اطمينان از آغشتگي به مدفوع، سريعاً به داخل محيط انتقال (کري‌بلر) فرو بريد. سپس لوله‌هاي انتقال را در يخچال يا يخدان قرار دهيد.
• در موارد اسهال ناشي از باکتري‌هاي مهاجم مانند شيگلا، ساييدن سواب به مخاط انتهايي روده جهت جمع‌آوري نمونه بسيار مهم است.
• سواب مدفوع: در صورت لزوم به نگهداري نمونه مدفوع بيش از 2 ساعت، مقدار اندکي از مدفوع و هرگونه بلغم يا تکه‌هاي مخاط پوششي روده را با فرو کردن سواب سر پنبه‌اي يا سر پلي‌استري به‌ درون مدفوع سريعاً به لوله حاوي محيط انتقالي تلقيح کنيد و در يخچال يا يخدان قرار دهيد.

 

محيط‌هاي انتقالي

• کري‌بلر: این محیط براي انتقال بسياري از عوامل بيماريزا کاربرد دارد. اين محيط نيمه جامد بوده، حمل و نقل آن آسان و پس از تهيه تا يکسال در دماي اتاق قابل نگهداري است (به شرطي که حجم آن کاهش نيافته و علائم آلودگي و تغيير رنگ در آن مشاهده نگردد).

 

• آب پپتونه قليايي ((Alkalane Peptone Water=APW: این محیط را می‌توان براي انتقال ويبريو استفاده نمود ولي اين محيط نسبت به کري‌بلر برتري ندارد و فقط در صورت عدم دسترسی به محیط کری‌بلر بايد مورد استفاده قرار گيرد (در صورتي که کشت بيش از 6 ساعت از زمان نمونه‌گيري به تعويق بيافتد نبايد از اين محيط استفاده گردد). محيط فوق در دماي °C4 تا 6 ماه قابل نگهداري است.

 

• سالين گليسرول بافر (Buffered Glycerol Saline=BGS): این محیط براي شيگلا مورد استفاده قرار مي‌گيرد و براي انتقال ويبريو مناسب نيست. اين محيط مايع بوده، لذا در حمل آن بايد دقت شود. همچنين تا 1 ماه پس از تهيه قابل استفاده است.

 

نگهداري:

• نمونه‌هاي مدفوع حداکثر تا 2 ساعت در يخچال قابل نگهداري است. نمونه‌هايي را که نمی‌توان به فاصله 2 ساعت از نمونه‌گيري کشت داد، بايد در محيط انتقالي قرار داده و سريعاً در يخچال نگهداري نمود.
• محيط انتقالي حـاوي سـواب مـدفـوع يا مقعد را مي‌توان حداکثر 72-48 ساعت در دماي °C4 نگهداري کرد. در غير اين صورت اين محيط می‌بايست ترجيحاً در دماي (°C70-) و يا در صورت عدم دسترسي، در دماي (°C20-) قرار داد (يا حداقل در فريزرهاي خانگي نگهداري شود).
• نمونه‌هاي مدفوع که از بيماران مبتلا به وبا گرفته مي‌شود و در محيط انتقالي قرار مي‌گيرد نيازي به نگهداري در دماي يخچال ندارند، مگر آن که نمونه‌ها در معرض دماي بالا (بيش از °C40) قرار داشته باشند.

 

ادرار

نمونه ادرار براي بررسي‌هاي شيميايي، سلول شناسي و ميکروب شناسي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. نحوه نمونه‌گيري و ظروف جمع‌آوري ادرار از عوامل مهم در کيفيت نمونه مي‌باشد.

جهت بررسي‌هاي معمول و ميکروبيولوژيک نمونه ادرار بايد حداکثر تا دو ساعت پس از جمع‌آوري (در دماي اتاق) مورد بررسي قرار گيرد. پس از اين مدت ترکيبات شيميايي ادرار تغيير کرده و عناصر تشکيل دهنده آن شروع به تخريب مي‌کنند. سيلندرها، گلبول‌های قرمز و گلبول‌های سفيد در نمونه‌هاي با وزن مخصوص پایين و PH  قليايي بسيار مستعد ليز هستند.

جهت بررسي‌هاي باکتري شناسي از نمونه ادرار تميز استفاده مي‌شود؛ بدین صورت که بيمار ابتدا دست‌هاي خود را با آب و صابون شسته و سپس ناحيه تناسلي خود را با پنبه آغشته به آب و صابون تميز مي‌نمايد، بخش اول ادرار را دور ريخته و بخش مياني ادرار را با رعايت شرايط استريل در درون ظرف جمع‌آوري ادرار مي‌ريزد و سپس بقيه ادرار را دور مي‌ريزد.

نگهدارنده‌ها در خصوص نمونه‌های ادرار و مدفوع

انواع نگهدارنده‌ها در خصوص نمونه‌های ادرار و مدفوع به شرح زیر می‌باشد:

• جهت کشت ادرار و شمارش کلنی، اسيد بوريک مناسب است. با استفاده از نگهدارنده نمونه ادرار تا 24 ساعت در دمای اتاق جهت بررسی باکتريولوژيک قابل نگهداری است.
• نمونه مدفوع جهت کشت عوامل باکتريايی را در صورتی که نتوان سريعاً به آزمايشگاه ارسال نمود تا 2 ساعت در دمای °C4 قابل نگهداری است، در غير اين صورت نمونه‌ها را می‌توان در محيط‌های نگهدارنده و انتقالی نظير استوارت، آميس و کری‌بلر منتقل نمود. در بعضی مواقع می‌توان با اضافه نمودن زغال به محيط استوارت و آميس اسيدهای چرب موجود در سواب‌های پنبه‌اي، که بازدارنده ارگانيسم‌های سخت رشد نظير نايسريا گونوره و بوردتلا پرتوسيس می‌باشند را جذب نمود.

نگهداری نمونه:

در صورتی که نتوان نمونه‌ها را در اسرع وقت پس از دريافت مورد بررسی قرار داد، بايد آنها را در شرايط مناسب نگهداری کرد. دماهای متفاوت مورد استفاده، دمای اتاق (°C22)، دمای يخچال (°C4)، دمای بدن (°C37) و دمای فريزر (°C20- °C70-) می‌باشند که بسته به نوع محيط انتقالی (درصورت استفاده) و عامل اتيولوژيک عفونت متفاوت است.

بعضی نمونه‌ها نظير ادرار، مدفوع، نمونه جهت بررسی عوامل ويروسی، خلط، سواب‌ها (به غير از عوامل بیهوازی) و وسايل خارجی نظير کاتتر را مي‌توان در دمای °C4 نگهداری نمود.

• پاتوژن‌هايی که به سرما حساسند بايد در دمای اتاق نگهداری شوند. اين عوامل ممکن است در نمونه‌هايي که حاوی باکتری‌های بیهوازی بوده و همچنين در اکثر مايعات استريل بدن، نمونه‌های ژنيتال، سواب گوش و چشم نيز موجود باشند.
• نگهداری طولانی مدت بافت‌ها يا نمونه‌ها در دمای °C70- صورت می‌گيرد.
• مايع مغزی نخاعی در صورتی که سريعاً مورد بررسی قرار نگيرد تا 6 ساعت در دمای °C35 قابل نگهداری است.

 

رفرانس:

• Quality Assurance for commercially prepared Microbiological Culture Media-Second Edition ; Approved standard.- Third edition document M22-A3. Vol. 24 No.19; 2006.
• Oxoid company- General Guide to the use of Oxoid culture Media.
• تکنیک‌های عملی در آزمایشگاه میکروب شناسی، دکتر سیدعلی مهبد، انتشارات کتاب امیر، 1386
• نکاتی پیرامون آزمایشگاه میکروبیولوژی، مؤلف cappoccino& Sherman، مترجم مریم محمدی، انتشارات جنگل، 1380
• Diagnostic microbiology, Elmer W.Koneman,5^th edition, 2006: page 96
• Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Ninth Edition (2006).M2- A9.
• Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Seventh Edition (2006).M7-A7
• Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard— Third Edition (2004).M22-A3
• Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement (2006).M100-S16
• باکتری شناسی عملی، هادی صفدری، جهاد دانشگاهی مشهد، 1382

 

• National committee for clinical laboratory atandards: quality assurance for commercially prepared microbiology culture media ed2 Approved standards; (M22-A22) Wayne, pa 1996 NCCLS
• Mohon CR. Manuselis. Text book of diagnostic Microbiology ed2 –W.B Saunder Company. 2000: pag 257-298
• Clinical dignosis and management by laboratory method, henry, john Bernard, 21 th edition 2007: 154- 177
• Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. 2^nd edition, who, 2003
• مباحث عملی میکروبیولوژی عمومی، مجتبی محمدی، انتشارات مهدیس، 1381
• محيط‌هاي كشت آزمايشگاهي (موارد مصرف وكنترل كيفي) به انضمام اطلس رنگي محيط‌هاي كشت؛ گرد‌آوري و ترجمه مهناز صارمي– محمدعلي صارمي؛ آزمايشگاه مرجع سلامت، وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشكي؛ 1387

استريليزاسيون و ضد عفونی

نقش و اهميت آزمون استاندارد طلايي كشت در تشخيص بيماري مسري و مهلك سل

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17642701/

برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید