مقدمه‌ای بر تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع آن

PCR

مقدمه‌ای بر تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع آن

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا… (عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (استاد دانشگاه)

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[۱] روشی است که طی آن، قسمتی از توالی مولکول DNA که بین دو آغازگر[۲] قرار دارد، توسط آنزیم پلیمراز و به کمک چهار دزوکسی نوکلئوتید ‌تری‌فسفات، در آزمایشگاه تکثیر[۳] می‌شود. DNA الگو به صورت دو رشته‌ای[۴] و متشکل از دو رشته آنتی پارالل است که توسط اتصالات هیدروژنی و به صورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند. این DNA الگو حاوی قطعه هدف به طول ده‌ها نوکلئوتید تا ده‌ها هزار نوکلئوتید است.

همانندسازی DNA به کمک الیگونوکلئوتیدهایی به نام آغازگر انجام می‌گیرد. این الیگونوکلئوتیدها، مولکول‌های DNA تک رشته‌ای کوتاهی هستند که هر کدام از آن‌ها مکمل یک انتهای DNA هدف (الگو) می‌باشند.

روش PCR توسط کری مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن‌ماری با حرارت‌های مختلف انجام می‌گرفت و از آنزیم کلنو[۵] به عنوان DNA  پلیمراز استفاده می‌شد. این آنزیم در اثر حرارت واسرشت می‌شود و اجباراً باید دوباره در هر چرخه به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص می‌شود و اصطلاحاً به آن Taq polymerase DNA گفته می‌شود، استفاده کرد. امروزه واکنشPCR به صورت اتوماتیک انجام می‌گیرد. در این واکنش پلیمراز مقاوم به حرارت مثل Taq، با استفاده از الیگونوکلئوتید آغازگر و چهار نوع دزوکسی نوکلئوتید ‌تری‌فسفات (dNTP)[6] میلیون‌ها نسخه از توالی هدف را می‌سازد.

فرایند PCR

PCR یک فرایند سه مرحله‌ای تکراری است که تحت عنوان چرخه PCR شناخته می‌شود. این سه مرحله شامل واسرشت شدن[۷] و باز شدن دو رشته DNA، اتصال دو آغازگر اولیگونوکلئوتیدی به DNA الگوی تک رشته‌ای شده[۸] و طویل‌سازی[۹] آنزیمی آغازگر به‌منظور ساخت قطعه مورد نظر است. انتهای ‘۳ آغازگر باید دقیقاً مکمل رشته الگو باشد؛ اما درانتهای ‘۵ آغازگر می‌توان توالی‌های غیرمکمل مثل پروموتر، توالی شناسایی آنزیم‌های محدودگر و را … قرار داد. در طی چرخه‌های واکنش،  DNA الگو و قطعات تکثیرشده مراحل قبل به‌عنوان سوبسترای مراحل واسرشت شدن، اتصال آغازگر و طویل‌سازی مورد استفاده قرار می‌گیرند. برای انجام واکنش، آغازگر و dNTP را به بافر ۱۰mM Tris-HCl با pH=8.3 (در دمای اتاق) اضافه می‌کنند. علاوه بر این، ۵۰mM KCl به‌منظور تأمین قدرت یونی و یون منیزیم به عنوان کوفاکتور آنزیم پلیمراز به واکنش اضافه می‌شود.

مرحله واسرشت سازی به سرعت در دمای ۹۶-۹۴ درجه سلسیوس انجام می‌شود. اتصال آغازگر بستگی به Tm[10] یا دمای ذوب هیبرید آغازگر- الگو دارد. نرم افزارها با در نظر گرفتن توالی آغازگر و غلظت نمکی بافر، Tm را تعیین می‌کنند، اما بهترین دمای اتصال آغازگر را باید به‌صورت تجربی بدست آورد. دمای طویل‌سازی برای اکثر واکنش‌ها °۷۲ سلسیوس است، همچنین می‌توان PCR را دو مرحله‌ای نمود؛ دمایی برای واسرشت شدن الگو و دمای دیگر به عنوان دمای اتصال آغازگر/ طویل‌سازی.

مراحل یک چرخه PCR:

۱- مرحله تک‌رشته‌ای کردن یا Denaturation: در این مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک‌رشته‌ای می‌شود.

۲- مرحله اتصال یا Annealing: در این مرحله با کاهش حرارت، آغازگرها در محل مناسب روی رشته مکمل متصل می‌شوند.

۳- مرحله امتداد دادن یا Extension: دمای این مرحله برای آنزیم DNA پلیمراز مطلوب است، در نتیجه موجب طویل‌سازی آغازگرها شده و همانندسازی DNA هدف انجام می‌گیرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانندسازی‌ شده‌ای که دو طرف این قطعه، آغازگرها وجود دارند (شکل ۱).

شکل ۱: شمایی از PCR

در هر چرخه PCR تعداد مولکول‌های DNA دو برابر می‌شود. رشته‌های DNA توسط حرارت (۹۵-۹۳ درجه) از یکدیگر باز می‌شوند (Denaturing) و سپس در دور بعد که حرارت پایین می‌آید (۶۰-۵۰ درجه)، آغازگرها به‌صورت اختصاصی به ناحیه هدف متصل می‌شوند (Annealing). آنزیـــــــــــــم Taq DNA polymerase در دمای مطلوب (۷۲ درجه) و در بافر مخصـــــــــــــوص، چهار dNTP dATP, dTTP, (dCTP, dGTP) را طبق رشته الگو به هم متصل می‌کند (Extension). لازم به ذکر است که DNAهای کوتاه (Short target product)، یعنی رشته‌هایی که بین دو آغازگر محصور هستند، به‌صورت تصاعد هندسی (exponential) و DNAهای بلند (long target product) یعنی رشته‌هایی که از یک طرف توسط یک آغازگر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود می‌باشند، به‌صورت تصاعد حسابی (linearly) تکثیر می‌شوند.

کاربرد PCR

PCR به طور گسترده در زیست‌شناسی مولکولی و مطالعه بیماری‌های ژنتیکی به‌کار می‌رود. عوامل ویروسی از قبیل HIV و HCV را می‌توان با این روش شناسایی و اندازه گیری نمود. به کمک تکنیک RT-PCR محصولات ژن را شناسایی کرده و توسط Real time PCR این محصولات را اندازه‌گیری می‌کنند. در مطالعات باستان‌شناسی و تکامل، DNA قدیمی و خورد‌شده را PCR و تعیین توالی می‌نمایند. حساسیت و اختصاصیت بالای این تکنیک موجب شده است که از آن در پزشکی قانونی استفاده شود. در حوزه تولیدمثل گیاهان و جانوران، این تکنیک در غربالگری صفات ژنتیکی به‌کار می‌رود. پاتوژن‌های موجود در غذا و محیط به کمک PCR شناسایی و اندازه‌گیری می‌شوند. PCR شناسایی ژنوم‌ها را سرعت بخشید. به کمک این تکنیک، فراوانی کراسینگ اوور در یک اسپرم را می‌توان تعیین کرد. همچنین می‌توان جنین چهار سلولی را تعیین تایپ، جنسیت و … نمود. PCR در همسانه‌سازی و تعیین توالی DNA به‌کار می‌رود.

پارامترهای مؤثر در PCR:

۱- زمان و دمای واسرشت‌سازی که بستگی به تعداد نوکلئوتیدهای G و C دارد.

۲- دمای اتصال آغازگرها که باید ۴-۳ درجه کمتر از دمای ذوب آغازگرها باشد.

۳- زمان طویل‌سازی که به تعداد بازهای بین دو آغازگر بستگی دارد.

۴- طول قطعه هدف: کارآیی PCR برای قطعات بزرگ‌تر از ۳kb پائین است. در این مواقع باید از تکنیک Long PCR استفاده شود.

۵- تعداد چرخه‌ها: بعد از ۲۵ تا ۳۰ چرخه به علت حرارت، آنزیم پلیمراز واسرشت و غیرفعال می‌شود.

۶- Ramping دستگاه (زمانی که طول می‌کشد تا دمای مبدأدستگاه به دمای مقصد برسد): هرچه این زمان کمتر باشد، نتیجه کار بهتر است و واکنش‌های غیراختصاصی کمتری در دمای ناخواسته انجام می‌شود.

۷- غلظت dNTPs و یون منیزیم: این دو مجموعه‌ای را تشکیل می‌دهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز می‌شود. غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر می‌باشند.

۸- غلظت DNA الگو: معمولا غلظت DNA الگو در حد یک دهم تا یک میکروگرم است. غلظت زیاد رشته‌های هدف موجباتصال مجدد رشته‌ها[۱۱] شده و با آغازگرها رقابت می‌کنند. چنانچه DNA هدف به تعداد چندین نسخه در ژنوم وجود داشته باشد، بهتر است.

۹- اضافه کردن تشدیدکننده‌های PCR

۱۰- حذف مهارکننده‌های آنزیم از محیط

۱۱- بهتر است نقطه ذوب آغازگرها شبیه هم باشد (Tm یکسان داشته باشند).

پیشگیری از آلودگی

PCR حساسیت بالقوه‌ای برای تکثیر تک مولکول‌ها دارد؛ بنابراین محصولات PCR می‌تواند به عنوان الگوی واکنش‌های بعدی مورد استفاده قرار گرفته و موجب آلودگی و اشتباه شود، به همین دلیل باید محصولات PCR را از محل انجام آزمایش جدا کرد. بدین منظور باید حداقل دو اتاق pre-PCR و post-PCR تعبیه گردد. در اتاق pre-PCR نمونه‌ها و مواد واکنش آماده شده و به اتاق post-PCR برده می‌شود. در اتاقpost-PCR  واکنش PCR و الکتروفورز انجام می‌شود. جریان مواد، وسایل و نمونه‌ها همیشه از pre-PCR به post-PCR است و برای جلوگیری از آلودگی نباید عکس این جریان اتفاق بیافتد. حتی کوچکترین آئروسل‌های ایجادشده می‌تواند حاوی هزار مولکول از محصول PCR باشد و یک نمونه منفی را به‌طور کاذب مثبت نشان دهد. این نوع از آلودگی به Carryover معروف است. برای جلوگیری از این نوع آلودگی باید از پیپت‌ها و سمپلرهای جداگانه، سرسمپلرهای فیلتردار، فضای کار مجزا برای تهیه نمونه، آماده‌سازی محلول‌های واکنش، انجام PCR و آنالیز محصولات استفاده نمود. همچنین همیشه استفاده از کنترل‌های مثبت و منفی الزامی است. استفاده از dUTP به جای dTTP در تمام واکنش‌های PCR این امکان را به وجود می‌آورد که بتوان با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی این مشکل را رفع نمود. محصول حاوی dU را می‌توان به طور معمول در همسانه‌سازی، تعیین توالی و آنالیز نمونه‌ها مورد استفاده قرار داد. در این روش قبل از هر واکنش، آنزیم یوراسیـــــــــــل N-گلیکوزیلاز[۱۲] (NGU) را به محلول واکنش اضافه می‌کنند. این آنزیم باز یوراسیل را ازDNA  تک‌رشته و دو رشته‌ای حذف کرده و محصولات PCR واکنش‌های قبلی را از بین می‌برد. 

آنزیم پلیمراز

انتخاب آنزیم پلیمراز برای انجام PCR بستگی به نوع کار و هدف آزمایش دارد. چندین آنزیم پلیمراز به‌صورت تجاری وجود دارد که بسته به پایداری در دمای بالا[۱۳]، سرعت و صحت فعالیت، می‌توان آنزیم موردنیاز را انتخاب کرد (جدول ۱). معمول‌ترین و بیشترین آنزیم مورد استفاده  Taqپلیمراز است. این آنزیم اکنون به‌صورت نوترکیب در باکتری E.coli تولید و تخلیص شده و با غلظت ۵U/µl در بافر (V/V) 50% گلیسرول عرضه می‌شود.

خصوصیات بیوفیزیکی:

این آنزیم ۹۴ کیلودالتون وزن داشته و فعالیت پلیمرازی ‘۵ به ‘۳ دارد. بهترین دما برای فعالیت این آنزیم °۸۰-°۷۰ سلسیوس است و پایداری خوبی در دمای بالا دارد. نیمه‌عمر آنزیم ۴۰-۳۵ دقیقه است. محصولاتی که با این آنزیم ساخته شده در انتهای ‘۳ خود دارای یک نوکلئوتید آزاد (بدون مکمل)[۱۴] از آدنین هستند که از آن می‌توان در همسانه‌سازی ژن درون ناقل[۱۵]T/A  استفاده نمود.

واکنش بیوشیمیایی:

این آنزیــم به یون منـــیزیم به عنوان کوفاکــــتور نیاز داشـــته و واکنش طویل‌ســــازی آغازگر را در دمای °۷۲ سلسیوس کاتالیز می‌کند. آنزیم پلیمراز از ۴ نوع dNTP (شامل dATP ,dCTP ,dGTP ,dTTP/dUTP) استفاده کرده و طبق قانـــــون مکمــــــلی بــــــازها، طویـــــــــل‌سازی را انجام می‌دهد. این آنــــزیم می‌تـــــــواند از بـــــازهای تغییــــــریافته (ddNTPs، biotin-11-dNTP، dUTP، deaza-dGTP و dNTPs نشاندارشده با فلورسنت) نیز استفاده کرده و طویل‌سازی را انجام دهد.

آنزیم  Taqپلیمراز در ساختار چنگالی[۱۶] فعالیت بیشتری از خود نشان می‌دهد. همچنین آنزیم فعالیت ‘۵ به ‘۳ نوکلئازی دارد که به کمک آن آغازگرهای پایین‌دست را تخریب می‌کنـــــــــــد. این فعالیت بخصوص در Real time PCR کاربرد داشته و موجب تولید سیگنال فلورسانس می‌شود. این آنزیم فاقد فعالیت ‘۳ به ‘۵ نوکلئازی و تصحیح اشتباه[۱۷] است.

نوع تغییریافته این آنزیم نیز تولید شده که حاوی تغییرات شیمیایی قابل برگشت است (AmpliTaq Gold). آنزیم تغییریافته در دمای اتاق غیرفعال است. دمای بالا و pH پایین موجب برگشت تغییر و فعال شدن آنزیم می‌شود. بافر تریس و دمای °۹۵-°۹۲ سلسیوس این شرایط برگشت را بوجود می‌آورند. pH بافر تریس در دمای°۲۵ معادل ۸/۳ بوده و در دمای بالای °۹۰ به ۷ می‌رسد. هنگام استفاده از این آنزیم و به منظور فعال نمودن آن، یک مرحله Pre-PCR به مدت ۱۰ دقیقه در دمای°۹۵ به واکنش اضافه می‌شود، همچنین به جای این مرحله می‌توان ۱۰ سیکل به PCR اضافه نمود که نتیجه مشابهی حاصل می‌شود.

جدول ۱: خصوصیات آنزیم‌های پلیمراز که به‌صورت تجاری موجود است

        

آغازگر

آغازگرهای مورد استفاده در PCR عبارتند از الیگودزوکسی ریبونوکلئوتیدهایی که به‌صورت کاملاً اختصاصی و مکمل ناحیه مد نظر از  DNAهدف طراحی می‌گردند. این قطعه از DNA مصنوعی ۳۰-۱۵ نوکلئوتید طول داشته و حاوی ۶۰-۵۰% نوکلئوتیدهای G+C است. آغازگرهای حاوی بیش از ۳۰ نوکلئوتید اختصاصیت خوبی ندارند، همچنین دمای اتصال آغازگر باید مناسب باشد. بهتر است تعداد نوکلئوتیدهای دو آغازگر مساوی بوده و پلی‌پورین یا پلی‌پیریمیدین نباشند. همچنین نواحی تکرارشونده نداشته باشند. چنانچه نوکلئوتیدهای G یا C به صورت تکراری و پشت سرهم باشند، آغازگر به‌صورت حلقه در آمده و عملاً سیستم کار نمی‌کند. در طراحی آغازگر باید دقت شود که دو آغازگر تشکیل دایمر و ساختار سنجاق‌سر[۱۸] ندهند، بخصوص انتهای ‘۳ دو آغازگر به هیچ عنوان نباید مکمل هم باشد؛ زیرا این آغازگر دایمر به شدت مشکل‌آفرین خواهد بود.

انتهای ‘۳ آغازگر باید دقیقاً مکمل DNA هدف باشد تا PCR به‌طور کارآمد انجام شود. از این خصوصیت در طراحی PCR اختصاصی آلل[۱۹] یا ARMS-PCR استفاده می‌شود. انتهای ‘۵ آغازگر الزاماً مکمل رشته الگو نیست. در این انتها می‌توان توالی‌های فاقد مکمل از قبیل سایت برش آنزیم محدودگر و پروموتر را قرار داد. برای تکثیر قطعاتی که فقط توالی اسید آمینه آن مشخص است و اطلاعاتی از توالی اسید نوکلئیک آن در دسترس نیست، می‌توان با توجه به کدون‌های هر یک از اسید آمینه‌ها، آغازگر را طراحی کرد. از آن جا که هر اسید آمینه ممکن است چند کدون داشته باشد، این آغازگر حاوی نوکلئوتیدهای بدون مکمل[۲۰] خواهد بود. هنگام کار با این آغازگرها، دمای اتصال آغازگر در چرخه‌های اول را پایین در نظر می‌گیرند تا آغازگرهای حاوی نوکلئوتید بدون مکمل نیز به DNA الگو متصل شود، سپس در چرخه‌های بعدی دمای اتصال بالا رفته و شرایط سخت‌تر می‌شود تا تکثیر از توالی‌های غیر اختصاصی انجام نشود.

آغازگر می‌تواند به صورت هموپلیمرهایی مثل اولیگوdT باشد که در RT-PCR مورد استفاده قرار می‌گیرد. در تکنیک دیگری تحت عنوان RAPD[21]، از تک‌آغازگر کوچک (در حدود ۱۰ نوکلئوتید) استفاده می‌شود. این آغازگر دارای توالی تصادفی بوده و موجب تکثیر از هر دو رشته شده و مجموعه‌ای از انواع محصولات PCR را تولید می‌کند که در انگشت‌نگاری ژنوم کاربرد دارد.

امروزه نرم‌افزارهایی وجود دارد که طراحی آغازگر را انجام می‌دهند. بعد از طراحی آغازگر، حتماً باید توسط نرم‌افزارهایی مانندBlast  آن‌ها را چک نمود تا مشخص شود که به چه نواحی دیگری از ژنوم می‌توانند متصل شوند. نرم افزار Blast مشابهت بین توالی آغازگر با تمام توالی‌های موجود در بانک اطلاعاتی اسید نوکلئیک را چک می‌کند. آغازگر نباید غیر از توالی هدف به دیگر توالی‌ها متصل شود، در غیر این صورت قطعات ناخواسته تکثیر خواهند شد. این نرم‌افزار به صورت On Line به نشانی www.ncbi.nlm.nih.gov/blast در دسترس عموم کاربران قرار دارد.

مواقعی که آغازگرها کاملاً مکمل DNA هدف (الگو) نیستند:

  • آغازگرهایی که برایایجاد جهش در یک ژن طراحی می‌گردند.
  • آغازگرهایی که در سمت ‘۵ آن‌ها جایگاه شناسایی آنزیم محدودگر تعبیه می‌شود تا بتوانمحصول PCR را توسط آن آنزیم برش داد. این کار برای همسانه‌سازی محصول PCR انجام می‌شود.
  • آغازگرهایی که لازم است محصول PCR آن‌ها دارای پروموتر باشد و برای بیان ژن کاربرد دارند.
  • آغازگرهایی که در طراحی آنها به جای استفاده از توالی اسید نوکلئیک از توالی پروتئینی آن استفاده می‌شود.

دمای Tm

DNA دو رشته‌ای از قبیل کمپلکس آغازگر- الگو دارای سطحی از پایداری است که این پایداری وابسته به نوع و طول توالی دو رشته، غلظت این دو جزء و غلظت نمک بافر است. حرارت می‌تواند این دو رشته را از هم گسسته و باز کند. دمایی که در آن نصف مولکول‌ها تک‌رشته شده و نصف دیگر هنوز به‌صورت دو رشته‌ای باقی مانده‌اند را Tm کمپلکس می‌خوانند. به علت وجود پیوندهای هیدروژنی بیشتر بین نوکلئوتیدهای G و C، Tm توالی‌هایی با نسبت GC بالا، بیشتر است. اغلب از روی میزان CG یک توالی Tm آن را محاسبه می‌کنند، اما توالی‌هایی که میزان CG آن‌ها یکسان است نیز Tm متفاوتی از خود نشان داده‌اند.

یک فرمول ساده برای محاسبه Tm عبارت است از:

Tm = 4(G+C) + 2(A+T) °C

امروزه نرم افزارهای متعددی طراحی شده‌اند که به طور دقیق‌تر Tm را محاسبه می‌کنند.

از آن جا که اختصاصیت فرایند PCR وابسته به اتصال دقیق آغازگر به الگو است، دمای اتصال آغازگر بر اساس دمای ذوب[۲۲] آغازگرها (Tm) محاسبه می‌شود. دمای اتصال آغازگر معمولا °۴-۲ سلسیوس کمتر از دمای Tm است.

نمونه مورد آزمایش

نمونه‌هایی که در فرایند PCR مورد آزمایش قرار می‌گیرد شامل DNA تک رشته‌ای و دو رشته‌ای جانوران، باکتری‌ها، گیاهان و ویروس‌ها است. انواع mRNA، tRNA، rRNA و RNA ویروسی نیز بعد از تبدیل شدن به cDNA[23]  توسط آنزیم رونویس معکوس[۲۴] می‌توانند در فرایند PCR به‌کار روند.

میزان نمونه‌ لازم برای انجام PCR می‌تواند بسیار کم و در حد یک مولکول باشد. برای انجام PCR در شرایط معمول، اگر نمونه شامل DNA همسانه‌سازی شده باشد در حد نانوگرم و اگر DNA ژنومیک باشد در حد میکروگرم کافی است. به‌طور کلی تعداد ۱۰۵ مولکول از نمونه هدف باید به محلول واکنش افزوده شود.

نمونه DNA که برای انجام PCR به‌کار می‌رود نیازی به خلوص بالا ندارد. تک سلول، لیز سلولی و یا حتی نمونه کوچکی از DNA تخریب‌شده نیز می‌تواند به عنوان الگو برای PCR به‌کار رود. برای انجام PCR، خلوص نمونه باید در حدی باشد که حداقل یک مولکول DNA حاوی توالی هدف سالم و یکپارچه در نمونه وجود داشته و ناخالصی‌های همراه نمونه رقیق شده و مانع فعالیت آنزیم پلیمراز نشوند، البته در بعضی از مواقع از جمله در انجام Long PCR کیفیت و کمّیت نمونه باید بالاتر باشد. اگر مقدار نمونه زیاد باشد می‌تواند موجب آلودگی نمونه‌ها با هم و یا با محصولات PCR قبلی شده و مثبت کاذب پدید آید.

در مواقعی که نمونه الگو کم باشد، حساسیت و کارآیی واکنش کم شده و جواب منفی کاذب خواهد بود. اگر کیفیت نمونه پایین و مقدار DNA خوردشده زیاد باشد، تعیین میزان دقیق DNA الگو در واکنش مشکل خواهد شد.

کوفاکتورهای فلزی

کلرید منیزیم یک کوفاکتور اصلی برای آنزیم پلیمراز است و مقدار مناسب آن برای هر سیستم آغازگر- الگو باید محاسبه شود. بسیاری از اجزای PCR از قبیل آغازگر، الگو، محصول PCR و dNTP به یون منیزیم متصل می‌شوند. مهم‌ترین جزء PCR که به صورت ۱:۱  به یون منیزیم متصل می‌شود dNTP است. از آن جا که یون منیزیم به عنوان کوفاکتور پلیمراز ضروری است، بنابراین میزان منیزیم باید بیشتر از dNTP باشد. برای شروع PCR به طور معمول mM1/5 از یون منیزیم را در حضورmM 0/8 dNTP به واکنش اضافه می‌کنیم. در این شرایط حدود mM0/7 از منیزیم برای پلیمراز باقی خواهد ماند. برای بهینه سازی شرایط PCR، غلظت منیزیم را در ۶ واکنش مجزا، از ۱/۵ تا mM4 تغییر داده تا بهترین غلظت تعیین شود.

سوبسترا

آنزیم DNA پلیمراز dNTP را با کارآیی بالا درون رشته در حال ساخت قرار می‌دهد، همچنین این آنزیم می‌تواند همراه با dNTP، از سوبسترای تغییریافته نیز استفاده کند.

Digoxigenin-dUTP، biotin-11-dUTP، dUTP، c7deaza-dGTP و dNTP نشاندارشده با فلورسنت می‌توانند به عنوان سوبسترای آنزیم پلیمراز مورد استفاده قرار گیرند. در PCR معمولی نسبت هر کدام از dNTPها یکسان در نظر گرفته شده و mM200 از هر کدام به واکنش اضافه می‌شود، اما در بعضی شرایط انحراف از این حالت استاندارد می‌تواند مفید واقع شود، به عنوان مثال در مواقعی که هدف از PCR جهش‌زایی تصادفی[۲۵] است، بر هم زدن این نسبت، الحاق بازهای اشتباه[۲۶] به درون رشته‌های در حال ساخت را تشدید می‌کند.

بافر و نمک‌ها

غلظت مناسب بافر، نمک و pH بافر بستگی به آنزیم پلیمراز مورد استفاده در PCR دارد. بافر مورد استفاده برای DNA پلیمراز Taq حاوی mM50 کلرید پتاسیم (KCl) و mM 10 از Tris-HCl بوده و pH آن در دمای اتاق ۸/۳ است. این بافر قدرت یونی و ظرفیت بافری لازم برای واکنش را فراهم می‌سازد. غلظت نمک بر روی Tm دو رشته آغازگر- الگو و در نتیجه دمای اتصال آغازگر مؤثر است.

مواد دیگر

ترکیبات متعددی همراه با محلول PCR به‌کار می‌روند که تحت عنوان Cosolvent شناخته شده و موجب افزایش محصول، کارآیی واکنش و اختصاصیت PCR می‌شوند. اگرچه این مواد موجب بهبود شرایط واکنش می‌شوند، اما پیش‌بینی تأثیر مثبت یک ماده بر روی هر سیستم آغازگر- الگو تقریباً غیرممکن است؛ بنابراین تأثیر هر کدام از این مواد افزودنی بر روی هر سیستم آغازگر- الگو باید به‌صورت تجربی بدست آید. تعدادی از این مواد در جدول زیر ذکر شده‌اند.

جدول ۲: برخی از Cosolvent‌ها که موجب افزایش محصول، کارآیی واکنش و اختصاصیت PCR می‌شوند

میکروتیوب‌های PCR

PCR باید درون لوله‌هایی انجام شود که برای حداقل میزان آنزیم و DNA طراحی شده و خصوصیات انتقال گرمایی مناسبی داشته باشند. معمولاً این لوله‌ها از جنس پلی‌پروپیلن بوده و دارای دیواره نازک هستند. به‌منظور جلوگیری از تبخیر محلول واکنش می‌توان روغن معدنی و موم بر روی نمونه‌ها قرار داد. البته امروزه لوله‌ها طوری طراحی شده‌اند که مانع تبخیر محلول می‌شوند، همچنین درب دستگاه‌های ترموسیکلر موجود دمایی بالاتر از دمای واسرشت‌سازی (در حدود °۱۰۵-۱۰۰ سلسیوس) را ایجاد کرده که مانع تبخیر محلول درون لوله شود.

تعداد چرخه‌های PCR

تعداد چرخه‌های PCR با توجه به غلظت DNA اولیه تعیین می‌شود. اگر غلظت الگوی اولیه حدود ۵۰ مولکول باشد، ۴۵-۴۰ چرخه و اگر غلظت آن۱۰۵× ۳ مولکول باشد ۳۰-۲۵ چرخه کافی است. این عدم تناسب به علت وجود پدیده‌ای تحت عنوان اثر پلاتو[۲۷] است. در اثر این پدیده در مراحل انتهایی PCR، سرعت تکثیر و تولید محصول کاهش می‌یاید. این پدیده ممکن است به علت تخریب و از بین رفتن مواد (مثل آنزیم پلیمراز و dNTP)، اتمام مواد (مثل آغازگر و dNTP)، مهار واکنش توسط محصولات جانبی[۲۸] (پیروفسفات)، رقابت برای مصرف مواد توسط محصولات غیر اختصاصی یا رقابت بین آغازگر و محصولات تجمع‌یافته برای اتصال به هدف[۲۹] اتفاق بیفتد.

بایدها و نبایدها در PCR

۱- هنگام تهیه محلول واکنش، نمونه کنترل مثبت را در آخر کار تهیه کنید.

۲- اعمال قبل و بعد از PCR، جدا از یکدیگر انجام گیرند.

۳- برای استفاده از هر ماده، از پیپت جداگانه و اختصاصی استفاده کنید.

۴- از پیپت‌های با قابلیت اتوکلاو و یا از پیپت‌های یکبار مصرف استفاده کنید.

۵- مواد ذخیره‌ای آزمایشگاه را تقسیم کرده و فریز کنید و هرچند وقت صحت و سلامت آن‌ها را کنترل نمایید.

۶- هنگام استفاده، هر لوله را میکروفیوژ کنید تا موادی که به اطراف درب لوله چسبیده‌اند، رسوب کنند.

۷- حتماً کنترل منفی نیز در کنار نمونه‌ها قرار دهید.

۸- برای انجام آزمایش‌های تأییدی از مواد فریز شده استفاده کنید.

۹- همیشه محصول PCR را خارج از محل آماده‌سازی نمونه نگهداری کنید.

۱۰- هنگام کار با PCR product، مقداری از آن را جداگانه نگهداری کنید.

انجام واکنش  PCR

توجه: آزمایش باید در محلی بدون رفت و آمد انجام گیرد. سمپلرهای مورد استفاده نباید برای کارهای دیگر استفاده شوند. ظروف، لوله‌ها و سر سمپلرها اتوکلاو شده و هنگام کار از دستکش استفاده شود.

مواد زیر را داخل لوله مخصوص واکنش PCR بریزید:

۱۰ mMdNTP                            ۰٫۵ μl (0.1 mM)

۱۰x PCR buffer                       ۵ μl

MgCl2                                     ۱٫۵ μl (1.5 mM)

Primer -1                                 ۲۰ pmmol

Primer -2                                 ۲۰ pmol

Taq DNA polymerase            ۰٫۲۵ μl (1.25 U)

Template DNA                       ۰٫۱- ۱ μg

dH2O                                      up to 50μl

لوله‌ها را داخل Block دستگاه ترموسایکلر قرار داده و دستگاه را روشن کنید. مقدار ۱۰۰μl روغن معدنی روی محلول بریزید تا از بخار شدن مواد ممانعت به‌عمل آورد. لازم به ذکر است که دستگاه‌های ترموسایکلر جدید به صورت Heated lid ساخته شده‌اند؛ یعنی درب دستگاه که روی لوله‌های واکنش قرار می‌گیرد، حدود ۱۰۵ درجه سلسیوس گرم می‌شود، در نتیجه بالای لوله گرم‌تر از پایین آن است و از بخار شدن مواد داخل لوله جلوگیری می‌شود. پس از اتمام کار چگونگی ردیابی (detect) محصول PCR مطرح می‌شود. دو روش بدین منظور وجود دارد:

  • دورگه‌گیری محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (کاوشگر)
  • الکتروفورز روی ژل آگاروز یا پلی‌اکریلامید

انواع PCR:

Hot start PCR:

دمایAnnealing  تعیین‌کننده اختصاصیت PCR است. هر چه این دما کمتر باشد، اتصال آغازگر به توالی‌های غیراختصاصی بیشتر است. هنگام تهیه محلول واکنش در دمای اتاق یا روی یخ، تمام مواد موردنیاز در لوله وجود دارد. پس در این دما آغازگرها به‌راحتی اتصالات غیراختصاصی، آغازگر دایمر و حلقه[۳۰] را تشکیل می‌دهند. آنزیم پلیمراز در این دما به میزان کمی فعال بوده و از روی هیبریدهای حاصل واکنش را کاتالیز می‌کند. آغازگری که به‌طور اشتباه به نقاط غیراختصاصی متصل شده، در این شرایط طویل شده و توالی آن تغییر می‌کند. هنگامی که دما افزایش یابد، دیگر این آغازگر به جای توالی اختصاصی خود به توالی غیراختصاصی متصل می‌شود، زیرا ‘۳ این آغازگر حاوی مکمل توالی غیراختصاصی است. به‌منظور جلوگیری از وقوع این مشکل، استراتژی‌های مختلفی تحت عنوان Hot start توسعه یافته است. در این تکنیک یک یا چند ترکیب مهم PCR (ترجیحاً آنزیم پلیمراز) از محلول واکنش جدا شده و زمانی که دما افزایش یافت، به واکنش اضافه می‌شود. استراتژی‌های زیر برای این جداسازی به‌کار گرفته شده است:

  • روش دستی

در روش دستی، یکی از اجزای کلیدی واکنش مثل پلیمراز یا کلرید منیزیم در محلول اولیه وجود ندارد و زمانی به واکنش اضافه می‌شود که دمای محلول به دمای Annealing رسیده باشد. از آن جا که در این روش دوباره درب لوله واکنش باز می‌شود، مقداری از محلول تبخیر شده، غلظت یونی تغییر می‌کند. همچنین احتمال آلودگی واکنش وجود دارد.

  • روش انسداد فیزیکی۱

دیواره لوله‌های مخصوص این کار به نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی واکنش را می‌پوشاند. آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار می‌دهند. در دمای ۹۴ درجه این واکس بخار می‌شود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا می‌کند. این تکنیک تحت عنوان Hot start به کمک Ampliwax نیز شناخته می شود.

  • به کمک آنتی‌بادی

منوکلونال آنتی‌بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه می‌کنند؛ درنتیجه فعالیت پلیمرازی آنزیم مهار می‌شود. هنگامی‌که دمای واکنش به ۹۴ درجه می‌رسد، آنتی‌بادی واسرشت می‌شود و دوباره پلیمراز فعال می‌گردد.

  • پلیمراز تغییریافته۲

در این روش آنزیم DNA پلیمراز را به‌صورت شیمیایی تغییر داده‌اند. این تغییر شیمیایی فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار می‌کند تا هنگامی که دما افزایش یابد. در این روش یک مرحله Pre-PCR وجود دارد تا این ممانعت شیمیایی رفع شود. در این مرحله محلول به مدت ۱۰ دقیقه در دمای °۹۵ سلسیوس قرار می‌گیرد؛ بنابراین محلول واکنش تا زمانی که به طور دقیق به دمای Annealing نرسیده است، هیچگونه واکنش پلیمرازی نخواهد داشت. اگر این مرحله Pre-PCR حذف شود، تغییر شیمیایی به‌تدریج طی مراحل واسرشت سازی PCR از بین رفته و آنزیم کم‌کم فعال می‌شود. دراین صورت نه‌تنها PCR به صورت Hot start انجام می‌شود، بلکه اثر آزادسازی وابسته به زمان[۳۱]  آنزیم را نیز به همراه دارد. با پیشرفت واکنش، سوبسترای آنزیم (محصولات PCR که خود به‌عنوان الگو استفاده می‌شود) بیشتر شده و نیاز به پلیمراز بیشتری هست. طبق این اثر، طی PCR، پلیمراز نیز رفته‌رفته بیشتر شده و تعادل بین سوبسترا و آنزیم حفظ می‌شود.

  • اولیگونوکلئوتید مهارکننده پلیمراز

در این تکنیک اولیگونوکلئوتیدهای دارای قابلیت اتصال به پلیمراز، به واکنش اضافه می‌شوند. این اولیگونوکلئوتید به پلیمراز متصل شده و آنزیم را در دمای محیط غیرفعال نگه می‌دارد. با افزایش دما، این مهارکننده از آنزیم جدا می‌شود. در این حالت آنزیم شروع به پلیمریزاسیون می‌کند.

 Touch down PCR

در این روش دمای اتصال آغازگر از دمای بالاتر از Tm شروع شده و بندرت کاهش می‌یابد و موجب کاهش محصول کاذب و آغازگر دایمر می‌شود.

PCR آشیانه‌ای یا داخلی[۳۲]

مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد، برای جلوگیری از بالابردن مقدار DNA و مهار واکنش، توسط آغازگرهای خارجی، قطعه طویل‌تری همانندسازی می‌شود و از محصول PCR اول یک واکنش دیگر با آغازگرهای داخلی انجام می‌گیرد. در این روش اختصاصیت و حساسیت PCR بالا می‌رود. این تکنیک یک روش سریع و قابل اطمینان برای تأیید محصول PCR است. در این روش اغلب از دو آغازگر استفاده می‌شود که نسبت به محصول PCR اول، داخلی هستند. محصول PCR واکنش اول به عنوان الگو برای یک PCR دوم حاوی این آغازگرهای داخلی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این واکنش دوم باید محصول PCR کوچکتری درمقایسه با محصول اولیه ایجاد کند.

طبق محاسبات انجام شده، Nested PCR باعث افزایش حساسیت تشخیص محصول صحیح، به میزان ۴۱۰ برابر می‌گردد. حتی اگر محصول PCR واکنش اول در بین پس‌زمینۀ محصولات غیراختصاصی محو شده باشد، با استفاده از آغازگرهای PCR داخلی امکان تکثیر مؤثر و اختصاصی را خواهد داشت؛ از طرف دیگر احتمال این که محصولات PCR غیراختصاصی، توالی مشابه آغازگر داخلی را داشته باشند، بسیار کم است و به همین دلیل معمولاً بعد از Nested PCR نباید محصولات غیراختصاصی وجود داشته باشد. حتی اگر طراحی دو آغازگر داخلی، به دلیل عدم دسترسی به توالی کامل ممکن نباشد؛ مثلاً هنگامی که توالی پپتیدی محدودی در دست است، باز هم استفاده از این روش امکان‌پذیر است. یک آغازگر داخلی جدید را می‌توان همراه با یکی از آغازگرهای اولیه استفاده کرد و همچنین استفاده از توالی همان آغازگرهای اولیه با افزودن فقط دو یا سه نوکلئوتید به انتهای ‘۳ برای بالا بردن ویژگی در Nested PCR کافی است. در واقع انتهای ‘۳ آغازگر است که در تعیین ویژگی واکنش PCR نقش اصلی را به‌عهده دارد. در صورتی که نوکلئوتید انتهای ‘۳ با DNA جفت نشود، واکنش باعث تکثیر اختصاصی توالی هدف و حذف محصولات غیراختصاصی خواهد شد. با این که آغازگرهای داخلی همپوشانی قابل‌توجهی با آغازگرهای اولیه دارند، باز این سطح از اختصاصیت بدست می‌آید، البته در این حالت نباید از آنزیم‌های پلی‌مراز دارای فعالیت تصحیح اشتباه اگزونوکلئازی استفاده کرد تا انتهای ‘۳ تعیین کننده حفظ شود.

برای کاهش دستکاری و جلوگیری از مشکلات آلودگی هر دو واکنش PCR اولیه و Nested را می‌توان در یک لوله انجام داد. برای این کار هر دو جفت آغازگر در آغاز واکنش افزوده می‌شوند، ولی آغازگرهای داخلی طوری طراحی شده‌اند که دمای ذوب پایین‌تری نسبت به جفت آغازگر اولیه دارند. این کار اجازه می‌دهد که تکثیر توالی هدف اولیه در دمای اتصال بالاتری نسبت به آغازگرهای داخلی صورت گیرد، سپس یک برنامۀ PCR دوم اجرا می‌شود که دمای اتصال پایین‌تری دارد و اجازه می‌دهد که جفت آغازگر داخلی، محصول PCR اختصاصی را از روی محصول اولیه تکثیر نمایند. محصولات PCR را می‌توان بر روی ژل آگارز بررسی کرد و در واقع باید محصولات تکثیر اولیه به همراه قطعه کوچکتر تکثیرشده در Nested PCR مشاهده شوند. بهتر است که از محصول PCR اول برای آزمایشات بعدی استفاده نشود، زیرا بالا بردن تعداد چرخه‌های PCR احتمال وقوع جهش‌های ناشی از PCR را افزایش می‌دهد.

یک مشکل اصلی بالقوه در هنگام تأیید صحت محصولات PCR اولیه با استفاده از Nested PCR وجود DNA الگوی اولیه است. اگرچه محصول اولیه غیراختصاصی است، ولی مقدار الگوی اولیه باید به حدی باشد که امکان تکثیر مستقیم توسط آغازگرهای داخلی فراهم باشد. نتیجه مثبت ممکن است باعث این اشتباه شود که محصول PCR اولیه در واقع همانند توالی صحیح هدف است. برای جلوگیری از هرگونه تکثیر از روی DNA الگوی اولیه محصول PCR اول را می‌توان رقیق کرد. به‌طوری‌که مقدار کل الگوی اولیه در PCR دوم قابل اغماض باشد. در مواردی که یک محصول PCR اولیه مشخص وجود دارد، راه مطمئن‌تر، خالص‌سازی فیزیکی محصول PCR از DNA الگوی اولیه است. برای مثال می‌توان از الکتروفورز روی ژل آگارز و خالص‌سازی از ژل استفاده کرد.

در هر واکنش PCR قرار دادن کنترل‌های مناسب اهمیت فوق‌العاده دارد تا دقت و ویژگی PCR قابل اطمینان باشد. در Nested PCR به دلیل افزایش حساسیت، وجود کنترل‌ها اهمیت بیشتری دارد، زیرا هرگونه آلودگی جزئی نیز تکثیر خواهد شد. انجام واکنش‌های تک‌آغازگری برای اطمینان از ویژگی آغازگرها و همچنین کنترل‌های بدون DNA و بدون ‌آغازگر ضروری است. به طور خلاصه Nested PCR یک روش حساس و سریع برای تأیید واکنش‌های تکثیری PCR است، با وجود این اگر داده‌های لکه‌گذاری ساترن همراه با هضم به کمک آنزیم‌های محدودالاثر در شرایط اتصال سخت[۳۳] به‌دست آمده باشد، روش گویاتری برای تأیید صحت محصول است. بعضی از روش‌های ترکیبی ممکن است در موارد خاص موردنیاز باشد، البته بهترین روش تأیید صحت محصول PCR تعیین توالی DNA است که این روش در صورت کم بودن تعداد نمونه‌ها می‌تواند حتی سریع‌تر از لکه‌گذاری ساترن نیز باشد.

روش انجام کار:

مواد موردنیاز این مرحله را به صورت زیر آماده کنید:

  • مواد مورد نیاز را از فریزر ۲۰- بیرون آورده و بر روی یخ قرار دهید تاذوب شود.
  • مواد را طبق جدول فوق آماده کنید. دقت کنید که حجم نهایی هر واکنش ۲۵ میکرولیتر باشد.
  • در نمونه کنترل منفی به جای DNA آب مقطر اضافه کنید.
  • یک قطره روغن معدنی مخصوص PCR اضافه نمایید تا از تبخیر محلول طی واکنش جلوگیری شود.

نمونه‌ها را در دستگاه قرار داده و برنامۀ PCR را به صورت زیر تنظیم کنید:

  • واسرشت سازی اولیه در دمای ْ۹۴ به مدت ۲ دقیقه
  • واسرشت سازی در دمای ْ۹۴ به مدت ۱ دقیقه
  • اتصال آغازگر در دمای ْ۵۷ به مدت ۱/۵ دقیقه
  • طویل‌سازی به مدت ۱ دقیقه در دمای ْ۷۲ سانتی‌گراد
  • تکرار این سه مرحله به مدت ۳۰ چرخه
  • طویل‌سازی نهایی در دمای ْ۷۲ به مدت ۵ دقیقه

بعد از اتمام مرحله اول PCR از محصول به‌دست‌آمده جهت مرحله دوم PCR استفاده کرده و به صورت زیر عمل کنید:

مواد مورد نیاز این مرحله را به صورت زیر آماده کنید:

پس از مخلوط کردن محلول‌های فوق، یک قطره روغن معدنی به میکروتیوب اضافه کرده و در دستگاه ترموسیکلر قرار دهید. دستگاه را طبق برنامۀ زیر تنظیم کنید:

  • واسرشت‌سازی اولیه در دمای ْ۹۴ به مدت ۲ دقیقه
  • واسرشت‌سازی در دمای ْ۹۴ به مدت ۱ دقیقه
  • اتصال آغازگر در دمای ْ۵۸ به مدت ۱ دقیقه
  • طویل‌سازی به مدت ۱ دقیقه در دمای ْ۷۲ سلسیوس
  • تکرار این سه مرحله به مدت ۳۰ چرخه
  • طویل‌سازی نهایی در دمای ْ۷۲ به مدت ۱۰ دقیقه

Long distance PCR 

با این روش قطعات ببیش از ۲۰ kb همانندسازی می‌شوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشد و آغازگرها به‌دقت طراحی شوند، بدین منظور از کلنو Taq استفاده می‌شود. این آنزیم نسخه‌ای از DNA پلیمراز است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و باpfu  پلیمراز به نسبت ۱۸۰ به ۱ مخلوط می‌شود و فاقد فعالیت ‘۵ اگزو نوکلئازی است.

Reverse Transcriptase PCR (RT- PCR)

تعدادی از آنزیم‌های پلیمراز به جایDNA  ازRNA  بعنوان سوبسترا استفاده کرده و از روی RNA یک رشته DNA سنتز می‌کنند. رشته جدید سنتزشده، cDNA نامیــده شده و به واکنش، نسخه‌برداری معکوس Reverse transcription)) گفته می‌شود. آنزیم‌هایی که از RNA بعنوان سوبسترا استفاده می‌کنند، بهReverse transcriptase  معروف هستند.

آنزیم Tth که از باکتری ترموس ترموفیلوس به‌دست می‌آید، در حضور یون منگنز فعالیت رونویسی معکوس و در حضور یون منیزیم، فعالیتDNA  پلیمرازی دارد. آنزیم AMV که از یک نوع ویـروس پرندگان به نام Avian Myeloblastosis Virus transcriptase استخراج می‌گردد، فعالیت RNase H هم دارد. دمای مطلوب برای فعالیت این آنزیم ۴۲ درجه سلسیوس بوده و برای تهیه cDNA با طول کمتر از ۵۰۰ b استفاده می‌گردد. آنزیم MMLV ازیک نوع ویروس جوندگان به نامMouse Molony Leukemia Virus  استخراج شده و فعالیت RNase H آن کمتر از آنزیم قبلی است. این آنزیم در ۳۷ درجه سلسیوس فعالیت می‌کند. آنزیم Superscript، آنزیم MMLV مهندسی‌شده است که ژن قسمت حاوی فعالیت RNAse H را از آن حذف کرده‌اند و برای تهیه cDNA بزرگ استفاده می‌گردد.

روش انجام RT-PCR:

۱- مقدار ۱۰ میکرولیتر از محلول حاویRNA  را برای انجام RT-PCR استفاده کنید.

RNA                                   ۱۰ μl

RT buffer                           ۴ μl

RT enzyme                        ۰٫۵ μl

RNasine                             ۰٫۳ μl

dNTP                                  ۱ μl

Primer (1&2)                    ۲۰ pmol

DEPC water                      up to 20 μl

قبل از اضافه کردن RNA، به مدت ۱۰ دقیقه RNA را در ۷۰ درجه قرار دهید تا از تشکیل حلقه جلوگیری شود. محلول واکنش را یک ساعت در ۴۲ درجه و سپس ۵ دقیقه در ۹۴ درجه سانتی‌گراد قرار دهید تاRT  غیر‌فعال شده و آنزیم پلیمراز را مهار نکند، سپس به هر لوله مقدار ۰٫۲۵ μl آنزیم پلیمراز اضافه کنید و با برنامه زیر واکنش را برای ۳۰ چرخه ادامه دهید:

Denaturation                   ۹۴o                     ۳۰ sec

Annealing                         ۵۵o                     ۳۰ sec

Extension                          ۷۲o                     ۳۰ sec

PCR با آغازگرهای احتمالی[۳۴]

این آغازگرها بر اساس اطلاعات حاصل از توالی آمینو اسیدی پروتئین یک ژن طراحی می‌شوند. از آن‌جا که بعضی از اسیدآمینه‌ها بیش از یک کدون دارند، بنابراین چندین آغازگر متفاوت برای یک ناحیه از ژن طراحی و ساخته می‌شود. این نوع PCR در مواردی انجام می‌شود که توالی ژن مورد نظر در دسترس نیست ولی توالی پروتئین آن ژن شناسایی شده است.

ARMS- PCR

روشARMS  روش سریعی برای تعیین جهش‌های نقطه‌ای و حذف و اضافه‌ها است. این روش اولین بار توسط Newton وGroham  در سال ۱۹۹۴ برای آنالیز بازهای متفاوت در والدین دچار‌ کمبود آنتی‌ترپیسین و همچنین برای تشخیص والدین ناقل بیماری سیستیک فیبروزیس و بتا تالاسمی به‌کار گرفته شد.

این تکنیک بر اساس طراحی آغازگرهای اختصاصی آلل‌ها در PCR است. برای‌ تشخیص یک جهش ویژه، دو آغازگر کنترل در نزدیکی محل موتاسیون برای اطمینان از عمل صحیح PCR طراحی می‌شوند. برای تکثیر منطقه حاوی جهش نیز یک آغازگر مشترک برای آلل موتانت و وحشی طراحی می‌گردد. دو آغازگر باقی‌مانده همان‌ آغازگرهای ARMS است که باز′۳ آن‌ها به ترتیب مکمل توالی آلل موتانت و آلل وحشی هستند. چنانچه آغازگر ARMS دارای ′۳ مکمل DNA الگو بود، همراه با آغازگر مشترک قطعه ما بین دو آغازگر تکثیر می‌گردد و در روی ژل دو باند مشاهده می‌شود.

اگر آغازگر ARMS دارای′۳ مکمل DNA الگو نبود، فقط یک باند در روی ژل که حاصل تکثیر منطقه بین دو آغازگر کنترل است، مشاهده می‌گردد، زیرا انتهای′۳ ناجور جفت‌شدگی دارد و باعث جلوگیری از عمل پلیمراز به جهت دور شدن ′۳ آغازگر از DNA می‌شود.

شکل ۳: شکل شماتیک ARMS-PCR

جهش R (G/A) در این قطعه فرضی مورد بررسی قرار گرفته است. در این واکنش یک جفت آغازگر داخلی اختصاصی آلل و یک جفت آغازگر خارجی استاندارد به‌کار می‌رود. پس از اتمام واکنش، دو نوع محصول شامل آلل A و آلل G بوجود خواهد آمد. به‌منظور افزایش اختصاصیت واکنش، یک باز ناجور در موقعیت سوم آغازگر (از سمت ‘۳) قرار می‌گیرد که در این شکل با علامت * نشان داده شده است. آغازگرهای خارجی موجب می‌شوند تا محصولات واکنش بر حسب نوع آلل، از لحاظ اندازه متفاوت بوده و با الکتروفورز آگارز قابل تمیز باشند.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز معکوس

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز معکوس[۳۵] نوعی از PCR است که در آن فقط از یک توالی شناخته‌شده برای تکثیر DNA استفاده می‌شود. یکی از محدودیت‌های PCR معمولی این است که در آن از دو آغازگر به عنوان مکمل دو انتهای توالی مدنظر استفاده می‌شود، اما در این تکنیک از یک آغازگر به عنوان مکمل یک انتهای توالی هدف استفاده می‌گردد. PCR معکوس به‌خصوص برای تعیین محل یک قطعه DNA کاربرد دارد؛ به عنوان نمونه، رتروویروس و ترانسپوزون‌ها به طور تصادفی درون هر نقطه از ژنوم انسان قرار می‌گیرند. بدین منظور با استفاده از توالی شناخته‌شده رتروویروس یا ترانسپوزون، یک آغازگر طراحی شده و پس از انجام واکنش PCR بخش کوچکی از DNA ژنومی نیز تکثیر می‌شود. در ادامه این قطعه کوچک جدا شده و توالی آن تعیین می‌شود. نتایج حاصل از تعیین توالی با بانک‌های مربوط به توالی ژنوم انسان مقایسه شده و محل الحاق این عناصر مشخص می‌شود. این تکنیک حاوی مراحل برش آنزیمی با آنزیم‌های محدودگر و اتصال با لیگاز است. نتیجه این مراحل ایجاد قطعه حلقوی حاوی توالی شناخته‌شده است که از توالی می‌توان به عنوان مکمل آغازگر و شروع PCR استفاده نمود.

این مراحل به صورت زیر انجام می‌پذیرد:

ابتدا DNA ژنومی را با استفاده از آنزیم‌های محدودگر با فراوانی محل شناسایی پایین تا متوسط هضم نمایید. نتیجه این امر ایجاد قطعات چند کیلوبازی است. در ادامه غلظت پایینی از DNA هضم‌شده را در شرایطی قرار دهید تا این قطعات به صورت DNA حلقوی درآیند (self-ligation). حال از آنجا که این محصول حلقوی است، با یک آغازگر نیز می‌توان آن را تکثیر نمود.

[۱] Polymerase Chain Reaction (PCR)

[۲] primer

[۳] Amplify

[۴] dsDNA

[۵] Klenow

[۶] deoxynucleoside triphosphates

[۷] Denaturation

[۸] Annealing

[۹] Extension

[۱۰] Melting temperature,

[۱۱] Reannealing

[۱۲] Uracil-N glycosylase

[۱۳] Thermal stability

[۱۴] Overhang

[۱۵] Vector

[۱۶] Fork-like structure-dependent

[۱۷] Proofreading activity

[۱۸] Hairpin

[۱۹]  Allele-specific PCR

[۲۰] Mismatch

[۲۱] Randomly amplified polymorphic DNA

[۲۲] Melting temperature

[۲۳] Complementary DNA

[۲۴] Reverse transcriptase

[۲۵] Random mutagenesis

[۲۶] Misincorporations

[۲۷] Plateau effect

[۲۸] End-product inhibition

[۲۹] Reannealing

[۳۰] Loop

[۳۱] Time release effect

[۳۲] Nested PCR

[۳۳] High stringency

[۳۴] Degeneracy primer

[۳۵] Inverse PCR

روش‌های عملی در Time PCR – Real (قسمت ۵)

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • PCR
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی
  • واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

ویژه ها
آب مقطر گیری / اتوکلاو / اسپکتروفتومتر / انکوباتور / بن ماری / پی اچ متر / دیسپنسر / دیونایزر / روتاتور / سانتریفیوژ / سمپلر / فتومتر / شیکر / فور / میکروتوم / میکروسکوپ / هات پلیت / هود / محلولها / محیط کشت / مواد شیمیایی / پرینتر / یو پی اس/ استابلایزر / آموزش / اتوآنلایزر بیوشیمی / اسپرم آنالایزر / الایزا پروسسور / الایزا ریدر / الایزا واشر / الکتروفورز / الکترولیت آنالایزر / ایمونوآنالایزر / بلاد گس / پی سی آر / سل کانتر / سدیمان آنالایزر / کمی لومینه سانس / کیتها: بیوشیمی، سرولوژی، الایزا و ... / وسائل یک بار مصرف / نرم افزار / تعمیرات و نگهداری / کابینت و سکوبندی / شیشه آلات / جویای کار / فرصت شغلی / فروش ویژه اتوکلاو / تعمیرات و تامین قطعات و کالیبراسیون سیستم های الایزا ریدر و الایزا واشر اتوماتیک و فتومتر / یخچال و فریزرهای آزمایشگاهی / میکسر ESR / پیوند دستگاههای مدرن و کیتهای تولید داخل / تولید کننده سانتریفیوژ آزمایشگاهی / کیتهای الایزای قیمت مناسب / محصولات اسکلاو / فروش آزمایشگاه /