میکروسپوریدیوزیس و روش‌های تشخیص

 اهمیت میکروسپوریدیوزیس و روش‌های تشخیص آزمایشگاهی آن

 اهمیت میکروسپوریدیوزیس و روش‌های تشخیص آزمایشگاهی آن

ابراهیم کاظمی، دکترای انگل‌شناسی، دانشگاه علوم پزشکی جندی‌شاپور اهواز

ibrahimkazemi54@gmail.com

حسین هوشیار، دکتری انگل‌شناسی گروه انگل‌شناسی، دانشگاه علوم پزشکی کاشان

hooshyar4@yahoo.com

 

چکیده:

میکروسپوریدیاها انگل‌های داخل سلولی اجباری تک‌یاخته‌ای هستند. این تک‌یاخته‌ها به‌عنوان عوامل عفونی فرصت‌طلب و نوپدید در سراسر دنیا گستردگی دارند و طیف وسیعی از میزبانان مهره‌دار و بی‌مهره را آلوده می‌کنند. سیستم ایمنی نقش اساسی را در پاسخ‌های سیستمیک و موضعی علیه انگل، تثبیت، شدت و گسترش بیماری دارد، بطوریکه همزمان با پاندمی ویروس ایدز و افزایش تعداد افراد دارای سرکوب ایمنی در سراسر جهان به دلیل مداخله پزشکی، تعداد مبتلایان رو به افزایش است. میکروسپوریدیا عامل شایع بیماری‌های سیستمیک و غیر سیستمیک و عفونت‌های منتشر در افراد دارای نقص ایمنی می‌باشد. بیشتر موارد ابتلای انسانی با اسهال، کاهش وزن و سوءهاضمه همراه است. با توجه به افزایش روزافزون جداسازی و شناسایی این انگل در افراد مختلف از جمله بیماران دارای نقص سیستم ایمنی، اهمیت بررسی این تک‌یاخته بیشتر شده است، هنگامی که سایر عوامل اتیولوژیک در بروز اسهال در این بیماران دخالتی نداشته باشند، میکروسپوریدیاها می‌توانند به‌عنوان عامل پاتوژن مورد ظن قرار گیرند. در این مقاله اهمیت شناسایی میکروسپوریدیا به‌عنوان انگل نوپدید و لزوم تشخیص به‌موقع آن با روش‌های مختلف موردبحث قرار گرفته است.

 

مقدمه:

میکروسپوریدیاها انگل‌های تک‌یاخته‌ای داخل سلولی اجباری هستند که طیف وسیعی از میزبانان مهره‌دار و بی‌مهره را آلوده می‌کنند. این گروه از تک‌یاخته‌ها به روش تقسیم دوتایی در درون سلول و داخل  به نام واکوئول پارازیتوفوروس و یا به‌طور مستقیم در داخل سیتوپلاسم سلول میزبان تکثیر می‌یابند. تکثیر این ارگانیسم درون بدن باعث ایجاد بیماری در انسان، پستانداران، حشرات و ماهی‌ها می‌شود و ضررهای اقتصادی زیادی را برای صنعت شیلات و کرم ابریشم ایجاد می‌کند (۱, ۲).

اسپور گونه‌های آلوده‌کننده انسان، کوچک بوده و اندازه آنها ۳-۱ میکرون است. اسپوروپلاسم عفونی انگل از اسپور به سلول میزبان از طریق فیلامنت قطبی تزریق می‌شود. تا به امروز بیش از ۱۳۰۰ گونه از میکروسپوریدیا که متعلق به ۱۶۰ جنس می‌باشند شناسایی شده‌اند، ولی فقط ۱۴ گونه مختلف که متعلق به ۸ جنس انتروسیتوزون، انسفالیتوزون، پلیستوفورا، تراکی‌پلیستوفورا، آنکالیا، ویتافورما، نوزوما و میکروسپوریدیوم می‌باشند، به‌عنوان عامل پاتوژن در انسان مطرح هستند (۳). گونه‌های بسیار شایع انسانی، انتروسیتوزون بینوئوسی و انسفالیتوزون اینتستینالیس هستند که باعث بیماری معده‌ای- روده‌ای می‌شوند. انتروسیتوزون بینئوسی شایع‌ترین میکروسپوریدیای جدا شده از بیماران مبتلا به ایدز می‌باشد، با این حال عفونت‌های نادر انسفالیتوزون هلم و انسفالیتوزون کانیکولی هم در انسان گزارش شده است (۴).

در ابتلا به بیماری‌های میکروسپوریدیایی، سیستم ایمنی نقش اساسی را در پاسخ‌های سیستمیک و موضعی علیه انگل، تثبیت، شدت و گسترش بیماری دارد (۳). راه‌های انتقال انگل شامل انتقال انسان به انسان از طریق مدفوعی- دهانی (خصوصاً از افراد دارای اسهال مزمن، ذخایر آب آلوده، شنا کردن در آب‌های سطحی، مصرف غذاهای با خطر آلودگی بالا مانند میوه تازه و خام، سبزیجات آلوده و خام، خرید مواد غذایی از دستفروش‌های خیابانی، و فعالیت‌های همجنس‌بازی) (۵) و انتقال از حیوانات اهلی خانگی و یا وحشی به انسان از قبیل سگ، خوک و جوجه، از طریق تماس با ترشحات دهان یا مدفوع آنها به طریق بلع و یا استنشاق اسپور می‌باشد (۶). میکروسپوریدیاها به‌عنوان عوامل عفونی فرصت‌طلب و نوپدید در سراسر دنیا از جمله در کشورهای توسعه‌یافته و درحال‌توسعه شناخته می‌شوند و یکی از عوامل ایجاد اسهال مزمن در بیماران دارای سرکوب ایمنی مخصوصاً بیماران مبتلا به HIV که دارای شمارش سلول‌های +CD4 کمتر از ۱۰۰ عدد در میلی‌متر مکعب هستند، می‌باشند (۲, ۳, ۷). اولین مورد انسانی عفونت میکروسپوریدیایی در سال ۱۹۵۹ در یک فرد مبتلا به ایدز در فرانسه گزارش گردید. از سال ۱۹۸۵ همزمان با پاندمی ویروس ایدز، تعداد افراد دارای سرکوب ایمنی در سراسر جهان هرساله در حال افزایش و گسترش است (۸)، بعلاوه تعداد افراد دارای سرکوب ایمنی به دلیل مداخله پزشکی با درمان‌های تهاجمی سرکوب ایمنی در ناهنجاریهای وابسته به ایمنی، بدخیمی‌های خونی و پیوند اعضا رو به افزایش است (۹). در مطالعات اخیر یافت شده که آلودگی به میکروسپوریدیا در افراد دارای نقص ایمنی بدون اینکه علائم معدی- روده‌ای از خود نشان دهند شایع‌تر از افراد مبتلا به ایدز است (۱۰).

شیوع میکروسپوریدیای روده‌ای در بیماران آلوده به HIV به‌طور وسیعی از ۵۰-۱ درصد متغیر است، از زمان معرفی و ورود درمان‌های ضدویروسی قوی در کشورهای توسعه‌یافته، شیوع همه عفونت‌های فرصت‌طلب از جمله میکروسپوریدیا کاهش یافته است (۱۱, ۱۲)، ولی در مناطقی از آمریکای جنوبی، آفریقا و آسیا که دسترسی به درمان‌های ضدویروسی کمتر است و به دلیل وجود ریسک فاکتورها از قبیل پایین بودن بهداشت فردی و عمومی و نیز تماس مستقیم با حیوانات، میزان شیوع میکروسپوریدیا همچنان بالاست، بنابراین نیاز به تشخیص سریع و اختصاصی این تک‌یاخته بیشتر می‌گردد (۱۱-۱۳).

تاکنون بیش از ۱۰۰۰ مورد میکروسپوریدیازیس در بیماران HIV مثبت گزارش شده که عمدتاً ناشی از انتروسیتوزون بینئوسی بوده است. گونه‌های مختلف میکروسپوریدیا که در عفونت‌های انسانی نقش دارند در سایر حیوانات از قبیل سگ‌های خانگی، خوک، خرگوش، میمون و غیره نیز باعث آلودگی می‌شوند و عقیده بر این است که میکروسپوریدیازیس انسانی منشأ زئونوتیک دارد (۱۴) و بسیاری از عفونت‌های میکروسپوریدیازیس انسانی منشأ زئونوز داشته و از طریق آب آلوده به فضولات حیوانی منتقل می‌شوند، بااین‌وجود انتقال انسان به انسان نیز توصیف شده است. اگرچه عفونت‌های میکروسپوریدیایی در میزبانان با ایمنی سالم به‌صورت خودمحدودشونده می‌باشند، ولی در افراد مبتلا به نارسایی و یا سرکوب سیستم ایمنی به‌خصوص بیماران ایدزی می‌تواند تهدیدکننده حیات باشد. از نظر اپیدمیولوژی، میکروسپوریدیازیس انسانی به‌طور کامل بررسی نشده است و بیشتر مطالعات در مورد شیوع میکروسپوریدیا در جوامع پیشرفته صورت می‌گیرد (۷, ۸, ۱۵, ۱۶).

 

عوارض بیماری و اهمیت تشخیص آن

میکروسپوریدیازیس یک بیماری عفونی با یک سری تظاهرات بالینی است که به‌سرعت گسترش می‌یابند. ظهور علائم کلینیکی میکروسپوریدیاها بستگی به وضیعت سیستم ایمنی میزبان، محل عفونت و گونه انگل دارد (۱۷). افراد دارای سیستم ایمنی سالم ممکن است هیچگونه علائمی از ابتلا را از خود نشان ندهند. در افراد دارای نقص سیستم ایمنی، این تک‌یاخته عامل شایع بیماری‌های سیستمیک و موضعی مثل هپاتیت، میوزیت، کراتوکانژکتیویت، سینوزیت، میوزیت، پریتونیت، نفریتیس، پنومونی و عفونت‌های تنفسی، کلیوی و عفونت سیستم اعصاب مرکزی، انسفالیت، اسهال مزمن، اسهال مسافرین و عفونت‌های منتشر می‌باشد. موارد انسانی عمدتاً با اسهال، کاهش وزن و سوءهاضمه همراه هستند (۱۸, ۱۹).

میکروسپوریدیوزیس در بچه‌های دارای نقص سیستم ایمنی که مبتلا به ایدز نبوده‌اند (۲۰)، استفاده‌کنندگان از لنزهای چشمی، افراد مسن، بیماران روماتیسمی و نیز در افراد دارای ایمنی کارآمد گزارش شده است (۲۳-۲۱)، همچنین این انگل از بیماران دریافت‌کننده داروهای سرکوب‌کننده سیستم ایمنی مثل دریافت‌کنندگان پیوند کلیه، کبد، قلب، پانکراس، ریه و مغز استخوان که HIV منفی هم بوده‌اند گزارش شده است (۲۷-۲۴). تظاهرات بالینی بیماری در این افراد شامل عفونت‌های معدی- روده‌ای، ریوی، تنفسی، چشمی، عضلانی، مغزی و عفونت‌های سیستمیک می‌باشد. افزایش روزافزون جداسازی این انگل در افراد مختلف از جمله بیماران دارای نقص سیستم ایمنی، اهمیت بررسی این تک‌یاخته را در این افراد بیشتر کرده است.

 

روش‌های تشخیص میکروسپوریدیوزیس

میکروسپوریدیوزیس به چند دلیل در انسان‌ها تشخیص داده نمی‌شود:

۱- مشکل بودن تشخیص به خاطر اندازه کوچک آنها و امکان اشتباه با ارگانیسم‌های ریز دیگر

۲- کمبود روش‌های تشخیص اختصاصی

۳- ایجاد علائم غیراختصاصی بالینی

۴- عدم انجام رنگ‌آمیزی و یا انجام تست به‌صورت روتین در آزمایشگاه‌های تشخیصی جهت تشخیص میکروسپوریدیا مگر در صورت درخواست (۲۸).

معمول‌ترین روش‌های تشخیص این ارگانیسم‌ها در نمونه‌های مختلف بدن مثل بیوپسی، مایعات و مدفوع شامل استفاده از میکروسکوپ نوری، میکروسکوپ الکترونی و فلورسنت، تســــــت‌های سرولوژیکی مختلف

(ELISA و IFA، کمپلمان فیکساسیون، کانترایمونوالکتروفورز و وسترن‌بلات) جهت تشخیص آنتی‌بادی‌هایIgM  وIgG  علیه میکروسپوریدیا، کشت سلولی، رنگ‌آمیزی اختصاصی وبر (Weber’s) و یا  Uvtex 2B و تکنیک‌های مولکولی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی می‌باشد.

روش رنگ‌آمیزی برای تشخیص اولیه و روش‌های مولکولی برای تائید نهایی و افتراق گونه‌های این انگل‌ها استفاده می‌شود، هرکدام از روش‌های فوق مزایا و محدودیت‌های کاربردی دارند که جداگانه مورد بحث قرار می‌گیرند (۲۹, ۳۰).

 

میکروسکوپ نوری

آزمایشات سیتولوژیک مایعات بدن بطور مستقیم به‌وسیله میکروسکوپ نوری امکان تشخیص عفونت‌های میکروسپوریدیایی را ایجاد می‌کند، ولی تمایز جنس و گونه ممکن نیست. اندازه اسپورها و الگوی انتشار عفونت می‌تواند کمک‌کننده باشد، ولی افتراق دقیق گونه‌ها امکان‌پذیر نیست (۳۱, ۳۲). تشخیص با میکروسکوپ نوری نیز به خاطر اندازه کوچک، شکل و مشخصه‌های مشابه سایر ارگانیسم‌ها، احتیاج به مهارت بسیار زیاد دارد و پرسنل آزمایشگاه را با مشکل مواجه می‌سازد (۱).

 

رنگ‌آمیزی، تشخیص سیتولوژیک و آزمایش مدفوع

اسپورهای میکروسپوریدیایی در مایعات بدن و نمونه مدفوع قابل شناسایی می‌باشند، با توجه به اینکه لایه خارجی دیواره اسپور (اگزوسپور) پروتئینی بوده و لایه داخلی (اندوسپور) کیتینی است (۸, ۳۳)، بنابراین رنگ‌آمیزی‌های گرم، گیمسا و تریکروم به مانند رنگ‌های فلورسنت جهت رنگ‌آمیزی اسپورهای میکروسپوریدیایی می‌توانند بکار گرفته شوند. البته رنگ‌های گرم و گیمسا برخلاف رنگ‌آمیزی تری‌کروم برای تشخیص سیتولوژیک مناسب نیستند، زیرا قادر به افتراق بین میکروسپوریدیا و سایر عوامل موجود در نمونه‌های مدفوع و مایعات بدن نمی‌باشند (۸, ۳۴). با پیشرفت رنگ‌آمیزی‌های فلورسنت و تری‌کروم اختصاصی  تشخیص میکروسکوپیک میکروسپوریدیا در مایعات بدن سهل‌تر شده است. امروزه تغییراتی در این رنگ‌آمیزی‌ها صورت گرفته است و کاربرد بیشتری یافته‌اند. اساس رنگ‌آمیزی کروموتروپ به‌وسیله وبر پایه‌ریزی شد (۳۱, ۳۵)، که در آن اسپورها به‌طور چشمگیری در نمونه‌های مدفوع و مایعات بدن مشخص می‌شود. در این تکنیک که اصلاحاتی نیز در آن صورت گرفته، اسپورهای میکروسپوریدیایی به رنگ
صورتی-قرمز درمی‌آیند. دیواره اسپور رنگ قرمز می‌گیرد و در بعضی از اسپورها نوار کمربند مانند مشخصی دیده می‌شود که وجه تشخیصی است. این تکنیک زمان‌بر بوده و زمانی که تعداد اسپورها در نمونه کم باشد تشخیص را با مشکل مواجه می‌سازد (۳۵, ۳۶)، ازاین‌رو تغییرات مختلفی مثل تغییر دما و زمان رنگ‌آمیزی (۳۵, ۳۷)، کاهش میزان اسید فسفوتنگستیک (بهتر شدن رنگ زمینه) و جایگزین کردن یک رنگ زمینه پایدار(آنیلین بلو) (۳۸) در رنگ‌آمیزی کرموتروپ صورت گرفته، تا سرعت فرایند تشخیص بالاتر رفته و تمایز بهتری بین اسپورها و سایر عوامل باکتریایی و قارچی محیط اطراف صورت گیرد (۳۹).

تکنیک کروموتروپ-گرم جهت تشخیص میکروسپوریدیازیس دارای مزایای زیادی است؛ در این فرایند نمونه‌ها در محلول‌های کریستال ویوله و ید که در رنگ‌آمیزی گرم بکار می‌روند، قرار می‌گیرند، سپس در یک محلول کروموتروپ اصلاح شده در دمای ۵۵ درجه قرار می‌گیرند. در این روش اسپورهای میکروسپوریدیایی به رنگ سیاه درآمده و محیط اطراف سبز روشن می‌شود و زمان رنگ‌آمیزی تا ۵ دقیقه کاهش می‌یابد (۴۰).

از میان رنگ‌های فلورسانت، کالکوفلور سفید، Uvitex-2B و Fungifluor  (ترکیبی از کالکوفلور سفید و پتاس ۱۰%) بهترین گزینه رنگ‌آمیزی می‌باشند، البته کالکوفلور سفید، رنگ زمینه بهتری نسبت به سایرین دارد. این روش آسان و سریع بوده ولی نیاز به میکروسکوپ فلورسنت دارد. فلوکروم‌ها با کیتین اندوسپور باند شده و زیر نور UV دیده می‌شوند. اگرچه به نظر می‌رسد رنگ‌های فلورسنت در مقایسه با رنگ کروموتروپ از حساسیت بالاتری برخوردار باشند، ولی به دلیل رنگ‌آمیزی سلول‌های مخمری کوچک به نتایج مثبت کاذب منتهی می‌شوند (۳۴, ۳۷)، علاوه بر این در برخی از مطالعات دیده شده که حساسیت رنگ‌های فلورسنت و رنگ کروموتروپ برابر است. به عقیده اغلب محققان بایستی هر دو تکنیک با هم استفاده شوند تا نتایج صحیح‌تری حاصل شود، مخصوصاً در بیمارانی که عفونت‌های خفیف دارند(۴۰).

با توجه به اینکه تعداد اسپورها در نمونه‌های بالینی می‌تواند کم باشد، شاید سانتریفوژ مایعات بدن ضروری به نظر برسد. با این وجود، مفید واقع شدن تکنیک‌های تغلیظ برای تشخیص اسپورها در نمونه مدفوع مورد بحث می‌باشد. برخی از گزارش‌های محققان نشان می‌دهد تکنیک‌های تغلیظ می‌تواند منجر به کاهش اسپورهای میکروسپوریدیایی شده و ایجاد نتایج منفی کاذب کند (۳۱).

اسمیرهای سیتولوژی، برش‌های بافتی و رنگ‌آمیزی بافتی برای تشخیص عفونت‌های میکروسپوریدیا، به خاطر اندازه کوچک انگل و عدم پاسخ التهابی بافتی قابل‌توجه، تشخیص آنها را با مشکل روبرو می‌سازد و حساسیت و ویژگی این روش‌ها به‌خوبی بررسی نشده است.

 

میکروسکوپ الکترونی

به‌طور کلی به دلیل اندازه کوچک ارگانیسم و خصوصیات رنگ‌پذیری مختلف آنها، تشخیص نهایی میکروسپوریدیازیس نیاز به آزمایشات فوق ساختاری نمونه‌های بافتی، مایعات بدن یا نمونه مدفوع به‌وسیله میکروسکوپ الکترونی دارد. مشخصات ساختار منحصربه‌فرد اسپورها و مشخصات حلقه‌های قطبی آنها ارزش تشخیصی دارد. بر پایه مشخصات ساختاری اسپورها می‌توان جنس‌ها و حتی گونه‌های میکروسپوریدیایی را تشخیص داد، همچنین می‌توان فرم‌های تکثیری، روش تقسیم و بلوغ سلول‌ها را در ارتباط انگل- سلول در میزبان مشاهده کرد. در بافت تمام سیکل زندگی قابل مشاهده است، درحالی‌که در مایعات بدنی یا نمونه مدفوع تنها اسپورها قابل مشاهده می‌باشند. تشخیص میکروسپوریدیا با استفاده از سیستم TM میکروسکوپ الکترونی اختصاصی می‌باشد، استفاده از میکروسکوپ الکترونی SEM فاقد حساسیت در نمونه‌های مایعات و مدفوع می‌باشد و در تفریق گونه‌ها گاهی اشتباه رخ می‌دهد. در کل با توجه به هزینه بالا، وقت‌گیر بودن و روش‌های دشوار آماده‌سازی نمونه، استفاده از میکروسکوپ الکترونی نمی‌تواند کاربرد روتین در تشخیص داشته باشد (۴, ۸, ۱۵).

 

کشت سلولی

چندین گونه از میکروسپوریدیا که پستانداران را آلوده می‌کنند قادرند در محیط خارج و شرایط آزمایشگاهی نیز رشد نمایند. انسفالیتوزون کانیکولی اولین میکروسپوریدیای پستانداران است که در محیط کشت رشد داده شد، چندین استرین انسفالیتوزون کانیکولی که در محیط کشت رشد داده شدند، تعیین هویت گردیدند. میکروسپوریدیا در رده سلولی برخی از پستانداران قابل کشت می‌باشند، از جمله سلول‌های کلیه خرگوش (RK13) و میمون (Vero)، فیبروبلاست‌های ریه جنین انسان (MRC-5)، سلول‌های MDCK و غیره. تلاش جهت کشت انتروسیتوزون بینئوسی در رده‌های سلولی مختلف پیشرفت چندانی نداشته و تنها مدت کوتاهی، حدود ۶ ماه در محیط کشت دوام داشته‌اند. به نظر می‌رسد انتروسیتوزون بینئوسی در سیستم‌های کشت سلولی، اثرات سیتوتوکسیک ایجاد می‌کند، درحالی‌که این اثرات در محیط کشت گونه‌های انسفالیتوزون دیده نمی‌شود (۱, ۸, ۴۱). در بیشتر بیماران با بیماری‌های عفونی، تکنیک‌های شناسایی و جداسازی اختصاصی و سریع عوامل اتیولوژیک مدنظر می‌باشد ولی این روش‌های کشت میکروسپوریدیاها به خاطر اینکه انگل‌های داخل سلولی اجباری هستند و نیاز به سیستم کشت سلولی برای رشد دارند مناسب برای تشخیص سریع نیست، کشت سلولی میکروسپوریدیا ضمن اینکه نیاز به زمان طولانی ۱۰-۳ هفته‌ای داشته، جداسازی و تشخیص آنها مشکل و اغلب با شکست مواجه می‌شود، بنابراین به‌عنوان یک تکنیک روتین آزمایشگاهی برای تشخیص میکروسپوریدیوزیس توصیه نمی‌شود (۴۲).

 

روش‌های تشخیص آنتی‌ژنی

آنتی‌بادی‌های اختصاصی میکروسپوریدیایی جهت تشخیص و تفریق گونه‌ها در تست‌های ایمنوفلورسنت کاربرد دارد، همچنین از آنتی‌بادی‌های منوکلونال و پلی‌کلونال جهت تست وسترن‌بلات برای چندین گونه میکروسپوریدیا استفاده شده است. آنتی‌بادی‌های منوکلونال و پلی‌کلونال ابزار مفیدی برای تفریق گونه‌های میکروسپوریدیا هستند ولی احتمالاً تکنیک‌های رنگ‌آمیزی با آنتی‌بادی حساسیت پایین‌تری نسبت به سایر تکنیک‌ها دارند. Didier مقایسه‌ای بین رنگ‌آمیزی‌های کروموتروپ، فلورسنت حاوی کالکوفلور سفید و پلی‌کلونال آنتی‌بادی فلورسنت صورت داد. در این بررسی دیده شده، رنگ‌آمیزی پلی‌کلونال آنتی‌بادی فلورسنت دارای حساسیت پایین‌تری نسبت به روش‌های دیگر است، بنابراین تنها زمانی باید از آنتی‌بادی‌ها در تفریق گونه‌ها استفاده کرد که تشخیص اولیه میکروسپوریدیا به‌وسیله رنگ‌آمیزی‌های فلورسنت یا کروموتروپ صورت گرفته باشد (۳۵, ۴۳).

 

آزمایش‌های سرولوژیکی

از آنجا که امروزه عفونت‌های میکروسپوریدیا در افراد دارای ایمنی سالم از قبیل بچه‌ها، مسافرین و افراد مسن خیلی بیشتر از قبل گزارش می‌شود، تلاش برای بهبود و ایجاد روش‌های سرولوژیکی با بکار بردن کل ارگانیسم، پروتئین نوترکیب لوله قطبی و یا پروتئین دیواره اسپور به‌عنوان آنتی‌ژن در حال افزایش است (۲). تست‌های سرولوژیکی مختلفی (ELISA ,IFA ، ایمنوپراکسیداز و کمپلمان فیکساسیون، کانتر ایمنوالکتروفورز و وسترن‌بلات) جهت تشخیص آنتی‌بادی‌های IgM و IgG میکروسپوریدیایی به‌ویژه انسفالیتوزون کانیکولی گسترش یافته است ولی حساسیت و ویژگی هیچکدام از این روش‌ها برای تشخیص آنتی‌بادی علیه میکروسپوریدیا مشخص نیست (۸, ۲۸, ۴۱) و حتی واکنش متقاطع نیز در بین خود این گونه‌ها و انگل‌های دیگر مشاهده می‌شود؛ مثلاً در مطالعه‌ای میزان آنتی‌بادی علیه انسفالیتوزون کانیکولی، در بیماران مبتلا به مالاریا ۴/۷ درصد و در بیماران مبتلا به شیستوزوما ۹/۱ درصد مثبت گزارش شده است (۴۴). همچنین هیچکدام از روش‌های سرولوژی به خاطر پاسخ ضعیف به آنتی‌ژن در افراد دارای نقص سیستم ایمنی، نوع آنتی‌ژن بکار برده شده، روش تشخیصی متفاوت و افراد مورد مطالعه قابل‌اعتماد نمی‌باشند (۴۵).

بررسی آنتی‌بادی‌های اختصاصی میکروسپوریدیا در افراد HIV منفی شامل اهداکنندگان خون، کارگرهای کشتارگاه، مربیان سگ‌ها، کارگران جنگل‌ها و زنان حامله نشان داد میزان شیوع سرمی از ۱/۳ تا ۸ درصد متغیر است، لذا احتمال وجود میکروسپوریدیا را در افراد HIV منفی تقویت می‌نماید. شیوع سرمی میکروسپوریدیازیس در بین افراد HIV مثبت مبتلا به اسهال بر اساس منطقه جغرافیایی مورد مطالعه، گروه بیماران، مشخصات بیماران (جنس، سن، وضعیت اجتماعی- اقتصادی، وضعیت ایمنی و خصوصیات بالینی) و روش‌های تشخیصی مورد استفاده متغیر بوده و بین ۵ الی ۵۰ درصد گزارش شده است. برای انتروسیتوزون بینئوسی که نمی‌توان آن را به مدت طولانی در کشت سلولی نگه داشت روش‌های سرولوژیک مناسبی وجود ندارد (۱, ۷, ۲۸, ۳۹).

 

تشخیص مولکولی

در طول ده سال گذشته کاربرد روش‌های ملکولی در تشخیص انواع عفونت‌های انگلی به‌خصوص عفونت‌های میکروسپوریدیایی و نیز افتراق گونه‌ها توسط تکنیک‌های ملکولی، پیشرفت و توسعه قابل‌توجهی یافته است، برای مثال تنوع ژنتیکی قابل‌توجه در انتروسیتوزون بینئوسی براساس پلی‌مورفیسم توالی نوکلئوتیدی ژن ناحیه rRNA (ITS) و واحد کوچک  SSU rRNAیافت شده است (۱۳).

با وجود اینکه میکروسپوریدیاها جزء ارگانیسم‌های یوکاریوتیک حقیقی می‌باشند و دارای هسته، سیستم غشایی داخل سلولی و کروموزوم هستند، ولی ژن‌های RNA ریبوزومی آنها شبیه پروکاریوت می‌باشد. در مقایسه با ارگانیسم‌های یوکاریوتیک حقیقی، میکروسپوریدیا دارای ۱۶S rRNA و ۲۳S rRNA  می‌باشند و فاقد ۵٫۸S rRNA هستند. ژن‌های RNA زیرواحد کوچک و بزرگ ریبوزومی در میکروسپوریدیاها کوتاه‌تر از سلول‌های یوکاریوت بوده و فاقد چندین توالی عمومی می‌باشند (۸).

جهت تشخیص میکروسپوریدیاها و افتراق گونه‌ها از روش‌های مخــــــــتلف مولکولی مانند PCR، PCR-RFLP، Real-time PCR، هیبریداسیون و غیره می‌توان استفاده کرد (۱۵, ۲۹, ۴۶). تکثیر DNA عامل بیماری‌زا از دو جهت حائز اهمیت می‌باشد:

  • افزایش حساسیت روش‌های مبتنی بر پروب
  • تسهیل آنالیزهای بعدی نظیر آنزیم‌های محدودالاثر و تعیین توالی

بررسی PCR با بکار بردن پرایمرهای اختصاصی انجام می‌شود، پرایمرهای متعددی جهت تکثیر میکروسپوریدیاهای مختلف مورد استفاده قرار گرفته است؛ برخی از این پرایمرها اختصاصی گونه بوده، درحالی‌که بقیه پرایمرها عمومی‌تر بوده و برای مثال جهت تکثیر تمام گونه‌های انسفالیتوزون بکار رفته است. برخی از پرایمرها طوری طراحی شده‌اند که برای آنالیزهای بعدی نظیر آنزیم‌های محدودالاثر کاربرد داشته باشند، این آنزیم‌ها جهت تشخیص افتراقی گونه‌ها بکار می‌روند. برای بالا بردن حساسیتPCR ، روش‌های استخراج سریع و قوی DNA شامل رسوب DNA، جوشاندن، لیتیکاز، تخریب به‌وسیله پرل‌ها، استخراج فنل- کلروفرم، پروتئیناز K و هضم کیتیناز استفاده می‌شود. تکنیک مورد استفاده در استخراج DNA میکروسپوریدیا تأثیر بسزایی در حساسیت تکنیک تشخیصی PCR خواهد داشت. PCR در شناسایی میکروسپوریدیاهای ناشناخته در عفونت‌های انسانی و دامی مفید می‌باشد. با استفاده از پرایمرهای محافظت‌شده به لحاظ فیلوژنیکی در تکثیر زیرواحد کوچک (SSU) و زیرواحد بزرگ (LSU) RNA ریبوزومی و ناحیه جداکننده بین‌ژنی (ITS) امکان کلون نمودن و تعیین توالی قسمتی از RNA ریبوزومی میکروسپوریدیاهای ناشناخته در نمونه‌های بیوپسی فراهم می‌آید. از این اطلاعات می‌توان در آنالیزهای فیلوژنیکی با استفاده از برنامهBLAST  و برنامه‌های مشابه آن بهره جست، بطوریکه توالی‌های ناشناخته میکروسپوریدیایی را با کمک این برنامه‌ها با سایر توالی‌های ثبت‌شده از این ارگانیسم در بانک ژنی می‌توان مقایسه نمود. محصولات PCR به‌وسیله هیبریداسیون ساترن‌بلات مورد تائید قرار می‌گیرد (۷, ۴۷, ۴۸).

بر اساس روش PCR، میزان شیوع میکروسپوریدیوزیس در افراد مختلف HIV منفی از جمله مسافرین ۱۰%-۳/۳%، در بچه‌های دارای اسهال یا بدون اسهال ۱۷/۴%-۵/۹% و در افراد مسن تقریباً ۱۷% گزارش شده است (۷, ۳۹).

امروزه بیشترین تحقیق در ژنوم میکروسپوریدیاها روی قطعه ۱۶S rRNA صورت می‌گیرد. در بیشتر موارد بررسی‌های فیلوژنیکی بر روی توالی RNA زیرواحد کوچک ریبوزوم با طبقه‌بندی عمومی که بر اساس خصوصیات مرفولوژیکی پایه‌ریزی شده است، هماهنگ نمی‌باشد. طبق تحقیقات مختلف، آستانه تشخیص میکروسپوریدیاها در نمونه‌های مدفوع به روش PCR و میکروسکوپ نوری به ترتیب ۱۰۰ و ۱۰۰۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰۰ اسپور در هر گرم مدفوع می‌باشد (۴۱, ۴۹).

 

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

این تکنیک یکی از معمول‌ترین روش‌های مولکولی مورد استفاده برای تشخیص گونه‌ها و ژنوتیپ انگل‌های مختلف ازجمله میکروسپوریدیا می‌باشد. این تکنیک ابتدا برای تشخیص تغییرات در سطح DNA استفاده می‌شد ولی برای بررسی نمونه‌های مختلف بسیار مناسب است زیرا امکان جداسازی ژنوتیپ‌های چندگانه و بررسی پلی‌مورفیسم ژنی در نمونه‌های مشابه را فراهم می‌سازد (۵۰).

 

روش FISH

در مطالعات محدودی از روش هیبریداسیون یا دورگ گیری فلوئورسانس درجا برای تشخیص میکروسپوریدیا استفاده شده است. تکنولوژی FISH از پروب‌های نشان‌دار شده با فلورسانس استفاده نموده که به اسید نوکلئیک مکمل خود (DNA یا RNA)  در نمونه‌ها متصل می‌شود. در مقایسه باPCR، اطلاعات مورفولوژیکی و فضایی مرتبط با اتصال پروب در نمونه‌ها حفظ شده زیرا این روش درجا انجام می‌شود. از این روش با استفاده از پروب‌هایی علیه زیرواحد کوچک یا نواحی بین ژنیRNA  ریبوزومی در تشخیص انتروسیتوزون بینئوسی و انسفالیتوزون هلم استفاده شده است. این روش‌ها به‌طور موفقیت‌آمیزی بر روی نمونه‌های بالینی فیکس‌شده در فرمالین و پارافین بکار برده شده است و موارد مثبت بیشتری در این نمونه‌ها نسبت به رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی گزارش شده است (۴۷).

 

روش الیگونوکلئوتید Microarrays

روش الیگونوکلئوتید میکرواری همزمان قادر به شناسایی انتروسیتوزون بینئوسی و سه گونه انسفالیتوزون در نمونه‌های بالینی می‌باشد. چنین تکنیکی در ابتدا برای آنالیزهای گسترده ژنومی طراحی گردید ولیکن امروزه جهت آزمایشات تشخیص مولکولی نیز استفاده می‌شود. فن‌آوری میکرواری بطور معمول به آرایه الیگونوکلئوتیدهای مکمل هدف همراه با یک تراشه اسید نوکلئیکی نشان‌دار شده با مواد فلورسانس پرداخته که به‌محض هیبرید شدن با نمونه، درجه‌ای از فلورسانس مرتبط با فراوانی DNA هدف را از خود ساطع می‌نماید. با توجه به رقابت این آرایه و ماهیت آنالوگی شدت فلورسانس، این تکنولوژی توان عملیاتی بسیار بالایی داشته است (۴۷).

نتایج مطالعات اخیر بر اساس مشخصات مولکولی نشان داده است که تفاوت‌های ژنتیکی گسترده‌ای مابین جنس‌ها و گونه‌های مختلف میکروسپوریدیا وجود دارد و این تفاوت‌ها در گسترش روش‌های تشخیصی مولکولی جهت شناسایی جنس‌ها و گونه‌های میکروسپوریدیاها نقش عمده‌ای را ایفا می‌کنند، بدین منظور بیشتر از روش PCR و سایر روش‌های وابسته به آن استفاده می‌شود. در این راستا از ژن‌های متعددی جهت تشخیص اولیه میکروسپوریدیا و تعیین جنس و گونه‌های وابسته به آن استفاده شده است که عبارتند از ۱۶SrRNA، آلفاتوبولین‌ها، بتاتوبولین‌ها، Hsp 70، ترانس‌کریپتاز معکوس، کیتین سنتاز و غیره. اما در میان این ژن‌ها بیشترین کارهای تشخیصی مولکولی و فیلوژنتیکی بر روی ژن ۱۶SrRNA صورت گرفته است، چون این لوکوس ژنی کامل‌ترین و قابل اعتمادترین اطلاعات را در مطالعات قبلی ارائه داده است و توالی این لوکوس برای اکثر جنس‌ها و گونه‌های میکروسپوریدیا در دسترس است، نتیجتاً اینکه با توجه به مشکلات موجود در استفاده از روش‌های تشخیصی امروزه، می‌توان از روش‌های مولکولی خصوصاً PCR جهت ردیابی ژنوم گونه‌های میکروسپوریدیا در نمونه‌های مشکوک استفاده کرد (۸, ۵۱).

در نهایت بایستی اشاره کرد که روش تشخیصی آنالیزهای مولکولی و سکوئینسینگ نشان داده است که سدی در انتقال میکروسپوریدیاها بین انسان و حیوانات وجود ندارد و با توجه به احتمال آلودگی انسان به خاطر ارتباط نزدیک با حیوانات مختلف که محیط پیرامون انسان از قبیل آب، خاک، مواد غذایی و هوا را آلوده می‌سازند، این یافته به دلایل بهداشتی برای افراد مختلف ازجمله HIV و تحت شیمی‌درمانی حائز اهمیت بوده و ارائه اطلاعات صحیح به‌منظور طراحی معیارهای پیشگیری و بکار بردن درمان مناسب، لازم و ضروری می‌باشد. در نتیجه وقتی که سایر عوامل اتیولوژیک در بروز اسهال در این بیماران دخالتی نداشته باشند، میکروسپوریدیاها می‌توانند به‌عنوان یکی از عوامل آن مطرح شوند.

References:

  1. Weber R, Bryan RT, Schwartz DA, Owen RL. Human microsporidial infections. Clinical microbiology reviews. 1994;7(4):426-61.
  2. Didier ES, Weiss LM. Microsporidiosis: current status. Current opinion in infectious diseases. 2006;19(5):485.
  3. Stark D, Barratt J, Van Hal S, Marriott D, Harkness J, Ellis J. Clinical significance of enteric protozoa in the immunosuppressed human population. Clinical microbiology reviews. 2009;22(4):634-50.
  4. Didier ES, Didier PJ, Snowden KF, Shadduck JA. Microsporidiosis in mammals. Microbes and Infection. 2000;2(6):709-20.
  5. Stark D, Fotedar R, Van Hal S, Beebe N, Marriott D, Ellis JT, et al. Prevalence of enteric protozoa in human immunodeficiency virus (HIV)–positive and HIV-negative men who have sex with men from Sydney, Australia. The American journal of tropical medicine and hygiene. 2007;76(3):549-52.
  6. Wumba R, Longo-Mbenza B, Menotti J, Mandina M, Kintoki F, Situakibanza NH, et al. Epidemiology, clinical, immune, and molecular profiles of microsporidiosis and cryptosporidiosis among HIV/AIDS patients. Int J Gen Med. 2012;5:603-11.
  7. Didier ES. Microsporidiosis: an emerging and opportunistic infection in humans and animals. Acta tropica. 2005;94(1):61-76.
  8. Franzen C, Müller A. Molecular techniques for detection, species differentiation, and phylogenetic analysis of microsporidia. Clinical Microbiology Reviews. 1999;12(2):243-85.
  9. Bachur TPR, Vale JM, Coêlho ICB, Queiroz TRBSd, Chaves CdS. Enteric parasitic infections in HIV/AIDS patients before and after the highly active antiretroviral therapy. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 2008;12(2):115-22.
  10. Nkinin SW, Asonganyi T, Didier ES, Kaneshiro ES. Microsporidian infection is prevalent in healthy people in Cameroon. Journal of clinical microbiology. 2007;45(9):2841-6.
  11. Gazzard B. AIDS and the gastrointestinal tract. Medicine. 2005;33(6):24-6.
  12. Van Hal S, Muthiah K, Matthews G, Harkness J, Stark D, Cooper D, et al. Declining incidence of intestinal microsporidiosis and reduction in AIDS-related mortality following introduction of HAART in Sydney, Australia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2007;101(11):1096-100.
  13. Breton J, Bart-Delabesse E, Biligui S, Carbone A, Seiller X, Okome-Nkoumou M, et al. New highly divergent rRNA sequence among biodiverse genotypes of Enterocytozoon bieneusi strains isolated from humans in Gabon and Cameroon. Journal of Clinical Microbiology. 2007;45(8):2580-9.
  14. Didier ES. Microsporidiosis. Clinical infectious diseases. 1998:1-7.
  15. Samie A, Obi C, Tzipori S, Weiss L, Guerrant R. Microsporidiosis in South Africa: PCR detection in stool samples of HIV-positive and HIV-negative individuals and school children in Vhembe district, Limpopo Province. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2007;101(6):547-54.
  16. Zali MR, Mehr AJ, Rezaian M, Meamar AR, Vaziri S, Mohraz M. Prevalence of intestinal parasitic pathogens among HIV-positive individuals in Iran. Jpn J Infect Dis. 2004;57(6):268-70.
  17. Tumwine JK, Kekitiinwa A, Bakeera-Kitaka S, Ndeezi G, Downing R, Feng X, et al. Cryptosporidiosis and microsporidiosis in Ugandan children with persistent diarrhea with and without concurrent infection with the human immunodeficiency virus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 2005;73(5):921-5.
  18. Galván A, Sánchez AM, Valentín MP, Henriques-Gil N, Izquierdo F, Fenoy S, et al. First cases of microsporidiosis in transplant recipients in Spain and review of the literature. Journal of clinical microbiology. 2011;49(4):1301-6.
  19. Jamshidi S, Tabrizi AS, Bahrami M, Momtaz H. Microsporidia in household dogs and cats in Iran; a zoonotic concern. Veterinary parasitology. 2012;185(2):121-3.
  20. Mungthin M, Subrungruang I, Naaglor T, Aimpun P, Areekul W, Leelayoova S. Spore shedding pattern of Enterocytozoon bieneusi in asymptomatic children. Journal of medical microbiology. 2005;54(5):473-6.
  21. Aikawa NE, Twardowsky AdO, Carvalho JFd, Silva CA, Ribeiro ACdM, Saad CGS, et al. Intestinal microsporidiosis: a hidden risk in rheumatic disease patients undergoing anti-tumor necrosis factor therapy combined with disease-modifying anti-rheumatic drugs? Clinics. 2011;66(7):1171-5.
  22. Wichro E, Hoelzl D, Krause R, Bertha G, Reinthaler F, Wenisch C. Microsporidiosis in travel-associated chronic diarrhea in immune-competent patients. The American journal of tropical medicine and hygiene. 2005;73(2):285-7.
  23. Norhayati M, Azlin M, Al-Mekhlafi MH, Anisah N, Aini UN, Fatmah M, et al. A preliminary study on the prevalence of intestinal microsporidiosis in patients with and without gastrointestinal symptoms in Malaysia. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2008;102(12):1274-8.
  24. Barsoum RS. Parasitic infections in transplant recipients. Nature Clinical Practice Nephrology. 2006;2(9):490-503.
  25. Gumbo T, Hobbs RE, Carlyn C, Hall G, Isada CM. Microsporidia infection in transplant patients. Transplantation. 1999;67(3):482-4.
  26. Guerard A, Rabodonirina M, Cotte L, Liguory O, Piens M-A, Daoud S, et al. Intestinal microsporidiosis occurring in two renal transplant recipients treated with mycophenolate mofetil. Transplantation. 1999;68(5):699-701.
  27. Lanternier F, Boutboul D, Menotti J, Chandesris M, Sarfati C, Mamzer Bruneel M, et al. Microsporidiosis in solid organ transplant recipients: two Enterocytozoon bieneusi cases and review. Transplant Infectious Disease. 2009;11(1):83-8.
  28. Didier E, Stovall M, Green L, Brindley P, Sestak K, Didier P. Epidemiology of microsporidiosis: sources and modes of transmission. Veterinary parasitology. 2004;126(1):145-66.
  29. Fedorko DP, Nelson NA, Cartwright CP. Identification of microsporidia in stool specimens by using PCR and restriction endonucleases. Journal of clinical microbiology. 1995;33(7):1739-41.
  30. Katzwinkel‐Wladarsch S, Lieb M, Heise W, Löscher T, Rinder H. Direct amplification and species determination of microsporidian DNA from stool specimens. Tropical Medicine & International Health. 1996;1(3):373-8.
  31. Carter PL, MacPherson DW, McKenzie RA. Modified technique to recover microsporidian spores in sodium acetate-acetic acid-formalin-fixed fecal samples by light microscopy and correlation with transmission electron microscopy. Journal of clinical microbiology. 1996;34(11):2670-3.
  32. Corcoran G, Tovey D, Moody A, Chiodini P. Detection and identification of gastrointestinal microsporidia using non-invasive techniques. Journal of clinical pathology. 1995;48(8):725-7.
  33. Franzen C. Microsporidia: a review of 150 years of research. The Open Parasitology Journal. 2008;2(1).
  34. Conteas CN, Sowerby T, Berlin GW, Dahlan F. Fluorescence techniques for diagnosing intestinal microsporidiosis in stool, enteric fluid, and biopsy specimens from acquired immunodeficiency syndrome patients with chronic diarrhea. Archives of pathology & laboratory medicine. 1996;120(9):847.
  35. Didier ES, Orenstein JM, Aldras A, Bertucci D, Rogers LB, Janney FA. Comparison of three staining methods for detecting microsporidia in fluids. Journal of clinical Microbiology. 1995;33(12):3138-45.
  36. Chacin-Bonilla L, Panunzio AP, Monsalve-Castillo FM, Parra-Cepeda IE, Martinez R. Microsporidiosis in Venezuela: Prevalence of intestinal microsporidiosis and its contribution to diarrhea in a group of Human Immunodeficiency Virus–infected patients from Zulia State. The American journal of tropical medicine and hygiene. 2006;74(3):482-6.
  37. Kokoskin E, Gyorkos TW, Camus A, Cedilotte L, Purtill T, Ward B. Modified technique for efficient detection of microsporidia. Journal of clinical microbiology. 1994;32(4):1074-5.
  38. Ryan NJ, Sutherland G, Coughlan K, Globan M, Doultree J, Marshall J, et al. A new trichrome-blue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. Journal of clinical microbiology. 1993;31(12):3264-9.
  39. Matos O, Lobo ML, Xiao L. Epidemiology of Enterocytozoon bieneusi infection in humans. Journal of parasitology research. 2012;2012.
  40. Moura H, Schwartz DA, Bornay-Llinares F, Sodre FC. A new and improved” quick-hot Gram-chromotrope” technique that differentially stains microsporidian spores in clinical samples, including paraffin-embedded tissue sections. Archives of pathology & laboratory medicine. 1997;121(8):888.
  41. Garcia LS. Laboratory identification of the microsporidia. Journal of clinical microbiology. 2002;40(6):1892-901.
  42. Van Gool T, Canning E, Gilis H, Weerman MVDB, Schattenkerk JE, Dankert J. Septata intestinalis frequently isolated from stool of AIDS patients with a new cultivation method. Parasitology. 1994;109(03):281-9.
  43. Aldras AM, Orenstein JM, Kotler DP, Shadduck JA, Didier ES. Detection of microsporidia by indirect immunofluorescence antibody test using polyclonal and monoclonal antibodies. Journal of clinical microbiology. 1994;32(3):608-12.
  44. Hollister WS, Canning EU. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to Encephalitozoon cuniculi and its use in determination of infections in man. Parasitology. 1987;94(02):209-19.
  45. Didier ES, Bessinger GT. Host-parasite relationships in microsporidiosis: animal models and immunology. The microsporidia and microsporidiosis: American Society of Microbiology; 1999. p. 225-57.
  46. Notermans DW, Peek R, de Jong MD, Wentink-Bonnema EM, Boom R, van Gool T. Detection and identification of Enterocytozoon bieneusi and Encephalitozoon species in stool and urine specimens by PCR and differential hybridization. Journal of clinical microbiology. 2005;43(2):610-4.
  47. Ghosh K, Weiss LM. Molecular diagnostic tests for microsporidia. Interdisciplinary perspectives on infectious diseases. 2009;2009.
  48. Omalu I, Duhlinska D, Anyanwu G, Parn V, Inyama P. Human Microsporidial Infections. Online J Health Allied Scs. 2006;3(2).
  49. Müller A, Stellermann K, Hartmann P, Schrappe M, Fätkenheuer G, Salzberger B, et al. A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 1999;6(2):243-6.
  50. Tavares R, Staggemeier R, Borges A, Rodrigues M, Castelan L, Vasconcelos J, et al. Molecular techniques for the study and diagnosis of parasite infection. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases. 2011;17(3):239-48.
  51. Fedorko DP, Hijazi YM. Application of molecular techniques to the diagnosis of microsporidial infection. Emerging infectious diseases. 1996;2(3):183.

 برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • ابراهیم کاظمی
  • تک‌یاخته‌
  • حسین هوشیار
  • میکروسپوریدیوزیس

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *