مروری مختصر بر محیط‌های کشت مورد مصرف در آزمایشگاه میکروب‌شناسی

مسعود سیفی هیر، کارشناس علوم آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشکین‌شهر

مقدمه

میکروارگانیسم‌ها همانند سایر موجودات زنده برای ادامه زندگی به محیط‌زیستی نیاز دارند که مواد لازم جهت متابولیسم و تکثیر آن‌ها را دارا باشد. ضمناً این محیط باید دارای دما، فشار اسمزی و PH مناسب نیز در حدود 7/2 باشد. میکروارگانیسم‌ها علاوه بر محیط‌های زیست طبیعی خود توانایی زندگی در محیط‌های ساخته‌شده را نیز دارند که آن‌ها را محیط کشت مصنوعی می‌نامند. محیط‌های کشتی که در میکروب‌شناسی به کار برده می‌شوند انواع مختلف دارند و آن‌ها را می‌توان از جنبه‌های گوناگون از جمله حالت و از نظر متمایزسازی تقسیم‌بندی کرد.

1- محیط کشت آگار خون‌دار (Blood agar )

محیط کشت عمومی است که به‌منظور تکثیر و جداسازی باکتری‌های بیماری‌زا بخصوص باکتری‌هایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می‌رود. بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتری‌ها را نیز می‌توان کاوش کرد.

پس از اتوکلاو محیط پایه، هنگامی‌که درجه آن تا حدود ۵۰ درجه سانتی‌گراد رسید، خون دفیبرینه گوسفند را به نسبت ۵ تا ۷ درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیت‌های استریل می‌ریزیم.

ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد:

۱- همولیز کامل β: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده و اطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد می‌گردد.

۲- همولیز ناقص α: باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد می‌باشد و اطراف پرگنه هاله سبزرنگ ایجاد می‌گردد.

۳- عدم همولیز γ: باکتری فاقد آنزیم همولیزین می‌باشد.

2- محیط کشت آگار شکلاته (Chocolate agar)

اگر به محیط پایه آگار خون‌دار، هنگامی‌که درجه حرارت آن بعد از اتوکلاو در حدود ۸۰-۷۰ درجه سانتی‌گراد باشد، خون دفیبرینه گوسفند اضافه کنیم، محیط کشت آگار شکلاته به دست می‌آید. این محیط به علت اینکه گلبول‌های قرمز خون در اثر حرارت متلاشی شده و اجزای آن خارج گشته، برای رشد باکتری‌هایی نظیر هموفیلوس و نایسریاها که نیاز بیشتری به مواد غذایی آماده دارند مناسب می‌باشد.

3- محیط کشت مک‌کانکی آگار (Macconkey agar)

محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتری‌های گرم منفی می‌باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتری‌های گرم مثبت می‌شوند. باکتری‌های تخمیرکننده‌ی لاکتوز (لاکتوز مثبت‌ها) کلنی‌هایی به رنگ ارغوانی و باکتری‌هایی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفی‌ها) کلنی‌هایی بی‌رنگ ایجاد می‌نمایند. رنگ ارغوانی کلنی‌های باکتری‌های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که درنتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است. معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی‌رنگ و در محیط اسیدی قرمزرنگ است.

4- محیط کشت DNase Agar

باکتری‌هایی که حاوی آنزیم دی‌اکسی‌ریبونوکلئاز باشند، هاله صورتی‌رنگی اطراف کلنی‌ها پدید می‌آورند. تولوئیدن آبی در حضور DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن HCLی نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می‌آید.

5- محیط کشت مولر هینتون آگار (Mueller hinton agar)

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی باکتری‌ها (آنتی‌بیوگرام) به روش دیسک می‌باشد. بسیاری از باکتری‌هایی که سخت رشد Fastisious می‌باشند، نظیر Neisseria meningitides N.gonorrhoeae در آن رشد می‌یابند.

6- محیط کشت متیل رد – وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth) MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می‌باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتاً ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم‌ها از هم مورداستفاده قرار می‌گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه‌های آن از این محیط استفاده می‌شود.

آزمایش MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار 0.6 میلی‌لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می‌باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می‌باشد و در صورت عدم‌تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می‌باشد.

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت (PH=4/4)

ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف (PH=3/5)

ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی (PH=3/5)

آزمایش VP: به لوله کشت داده‌شده و انکوبه شده حدود0.6 میلی‌لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار 0.2 میلی‌لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می‌دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و درصورتی‌که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه:

مثبت: ظهور رنگ صورتی تا قرمز

منفی: تغییر رنگی صورت نمی‌گیرد.

7- محیط کشت (Sulfide-Indol-Motility) SIM

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می‌توان سنجید و در تمام باکتری‌ها می‌توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی‌متری انتهای لوله به‌وسیله آنس نوک‌تیز در این محیط کشت می‌دهیم.

اساس آزمایش:

مواد اولیه تولید اندول یعنی اسیدآمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن‌سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و درنتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری‌های متحرک می‌دهد.

ایجاد هیدروژن‌سولفوره توسط باکتری به‌صورت سیاه شدن محیط ظاهر می‌گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت‌شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می‌یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروژن‌سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه‌رنگ می‌باشد. با اضافه کردن یک میلی‌لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی‌لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است. باکتری‌های که حاوی مجموعه آنزیم‌هایی که اصطلاحاً تریپتوفاناز نامیده می‌گردند، باشند، قادرند طی سری واکنش‌های شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری به‌واسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می‌گردد. باکتری‌های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می‌کنند. برای تعیین تولید اندول می‌توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.


SIM	مکانکی آگار	بلاد آگار	شوکولات آگار

8- محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز (Lysine decarboxylase broth)

این محیط توان باکتری را در دکربوکسیله نمودن اسیدآمینه لیزین، تعیین می‌نماید. حاصل این واکنش تولید آلکالین آمین و کادوارین می‌باشد. به‌عنوان محیط تفریقی در تمایز بین آنتروباکتریاسه‌ها به کار برده می‌شود.

تفسیر آزمایش: ازآنجاکه همه آنتروباکتریاسه‌ها درنتیجه تخمیر قند گلوکز، اسید تولید نموده و محیط را به رنگ زرد درمی‌آورند، محیط به رنگ زرد باقی خواهد ماند، مگر آنکه باکتری اسیدآمینه موردنظر را نیز دکربوکسیله کند. در این صورت قلیائیت حاصله، محیط به رنگ بنفش (قلیایی) درخواهد آمد.

نتیجه:

رنگ بنفش: مثبت

رنگ زرد: منفی

محیط کشت گزیلوز لیزین دزوکسی کولات آگار (Xylose-lysin-decarboxycholate-agar) XLD محیطی است انتخابی که از آن برای جداسازی گونه‌های Shigella و سایر باکتری‌های پاتوژن روده‌ای بکار می‌رود.

کلی فرم‌ها و دیگر باکتری‌هایی که قادر به تخمیر یک یا هر دو قند موجود در محیط باشند، کلنی‌هایی به رنگ زرد پدید می‌آورند.(اسید) تخمیرکننده‌های گزیلوز که لاکتوز و سوکروز منفی هستند مانند Proteus mirabilis واکنش اسیدی خفیفی (نارنجی-کهربایی) ایجاد می‌کنند. گونه‌ها Shigella که عموماً هیچ‌یک از این قندها را تخمیر نمی‌کنند، سرتاسر محیط لوله را به حالت قلیایی (قرمز تیره) درمی‌آورند.

گونه‌های Salmonella اگرچه معمولاً گزیلوز مثبت هستند، ولی به‌واسطه برتری داشتن دکربوکسیلاسیون لیزین بر اسیدیته تخمیر گزیلوز، محیط کاملاً به رنگ قرمز (قلیایی) در می‌آید. کلنی‌های همه باکتری‌هایی که H2S تولید می‌کنند، بدون توجه به اسیدیته، مرکزی سیاه دارند.

9- محیط کشت برد پارکرآگار (Baird parker agar)

یک محیط (Medium) انتخابی است که حاوی تلوریت پتاسیم و تلوریت لیتیم می‌باشد. تلوریت محیط از رشد کلی فرم‌ها ممانعت می‌نماید. استافیلوکوک اورئوس می‌تواند تلوریت را به تلورید تبدیل نموده و باعث ایجاد کلنی‌های سیاه بر روی محیط گردد. زرده‌ی اضافه‌شده به محیط نیز باعث ایجاد دو واکنش در محیط می‌گردد. یکی تولید لسیتیناز منجر به ناحیه کدر و دیگری تولید لیپاز که منجر به ناحیه شفاف در اطراف ناحیه کدر می‌شود. در انتها کلنی‌های مشکوک به استافیلوکوک اورئوس باید تست کواگولاز انجام گردد.

10- محیط کشت بایل اسکولین آگار

محیط کشت تفریقی است که در تعیین هویت عده‌ای از باکتری‌ها مانند انتروکوکوسها، استفاده می‌شود.

بعضی از باکتری‌ها قادرند اسکولین را که نوعی گلیکوزید می‌باشد، هیدرولیز کرده و آن را به گلوکز، آگلایکن و آسکولتین تبدیل نمایند. در این فرآیند آهن موجود در محیط، واکنش نشان داده و ترکیبی به رنگ قهوه‌ای مایل به سیاه ایجاد می‌نماید؛ بنابراین تغییر رنگ محیط از زرد شفاف به سیاه و یا قهوه‌ای به معنی مثبت بودن آزمایش آسکولین می‌باشد. آنتروکوکوس فکالیس بایل اسکولین مثبت می‌باشد.

11- محیط کشت (Salmonella Shigella agar) SS

یک محیط انتخابی است که جهت تشخیص سالمونلا و شیگلا مورداستفاده قرار می‌گیرد. این محیط حاوی تیوسولفات سدیم به‌عنوان منبع گوگرد و آهن فریک به‌عنوان منبع آهن می‌باشد. همچنین حاوی لاکتوز و معرف نوترال رد می‌باشد. اگر باکتری تیوسولفات محیط را احیا کند، H2S تولید نموده که H2S با آهن موجود در محیط تولید پرگنه‌های سیاه‌رنگ می‌نماید. اکثر باکتری‌های لاکتوز مانند سالمونلا ها H2S مثبت می‌باشند.

12- محیط کشت (Orthonitro Phenul –β-D-galacto Pyramside) ONPG

با این محیط می‌توان وجود آنزیم بتاگالاکتوزیداز یعنی آنزیمی را که موجب شکستن مولکول لاکتوز می‌گردد را تعیین کرد. مهم‌ترین کاربرد این آزمایش تعیین سریع لاکتوز مثبت‌های تأخیری در بین خانواده انتروباکتریاسه می‌باشد. باکتری‌هایی که دارای آنزیم بتاگالاکتوزیداز باشند، ONPG بی‌رنگ را سریعاً شکسته و به د-گالاکتوز ارتونیتروفنل زردرنگ تبدیل می‌نماید. اگر باکتری واجد هر دو آنزیم یعنی پرمه‌آز و بتاگالاکتوزیداز باشد، پس از ۲۴ ساعت لاکتوز مثبت است. اگر باکتری واجد یکی از دو آنزیم فوق باشد، پس از ۷۲ ساعت با تأخیر لاکتوز مثبت است و اگر هیچ‌یک از آنزیم‌ها را نداشته باشد، لاکتوز منفی است.

13- محیط کشت سیمون سیترات آگار (Simmons Citrate agar)

برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به‌عنوان تنها عامل کربن‌دار موجود در محیط می‌باشد. باکتری‌هایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته‌اند از سیترات که تنها عامل کربن‌دار در محیط است استفاده کنند و درنتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی درمی‌آیند. در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم‌تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.

14- محیط کشت سه قندی آهن‌دار TSI (Triple Sugar iron agar)

از این محیط جهت تعیین هویت باکتری‌های گرم منفی استفاده می‌شود. همچنین برای تعیین تولید H2S بکار می‌رود. این محیط دارای سه قند گلوکز، سوکروز و لاکتوز می‌باشد مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتری‌ها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می‌سازد. آهن موجود در محیط گاز هیدروژن‌سولفوره‌ای را که از مواد گوگرددار تولید می‌شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می‌شود. این واکنش به‌صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است مشخص می‌گردد. گازی که درنتیجه تخمیر مواد قندی حاصل می‌شود به‌صورت حباب‌هایی در عمق محیط دیده می‌شوند و یا اینکه حجم گاز ممکن است زیاد بوده که در این صورت محیط آگار را به سمت بالای لوله رانده و فضای زیادی را اشغال می‌سازد.

نتایج تفسیر واکنش‌های TSI

1- درصورتی‌که هر دو قسمت شیب‌دار و ته لوله زرد شده و حباب تشکیل گشته، ولی سیاه نشده باشد، یعنی گلوکز، لاکتوز و سوکروز را تخمیر نموده و اسید تولید کرده و همچنین گاز نیز تولید نموده، ولی H2S تولید نشده است،+acid/acid ، Gas ، و – H2S می‌باشد.

۲- درصورتی‌که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و گاز تولید و سیاه باشد، یعنی تنها قند گلوکز تخمیر شده و H2S نیز تولید شده است. +Acid/ Alk ، Gaz+ ،H2S می‌باشد.

۳- درصورتی‌که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و تولید و سیاه شده باشد، یعنی اینکه تنها گلوکز را تخمیر نموده و H2S تولید نشده است. -Alk/Acid ، Gaz- ، H2S می‌باشد.

۴- درصورتی‌که ته لوله و شیب لوله هر دو زرد و گاز متغیر باشد و ته لوله‌ نیز سیاه شده باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و H2S نیز تولید نکرده است. متغیر acid/acid ، Gas و +H2S متغیر می‌باشد.

۵- درصورتی‌که سرتاسر لوله ارغوانی و سیاه نشده باشد، یعنی اینکه هیچ‌یک از قندها را تخمیر ننموده و H2S نیز تولید نکرده است. -Alk/Alk ، Gas- ، H2S می‌باشد.

۶- درصورتی‌که سرتاسر لوله زرد و گاز و سیاهی در ته لوله متغیر باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و تنها اسید تولید کرده، گاز و H2S تولید ننموده است. -acid/acid ، Gas-، H2S می‌باشد.

نکته: باید توجه داشت که نتایج کشت حداکثر طی ۲۴ ساعت پس از کشت قرائت گردد. چه‌بسا پس‌ازاین مدت ممکن است واکنش‌های اسیدی قسمت شیب‌دار تغییر یافته و قلیایی گردد. قسمتی از این تغییر واکنش اسیدی به قلیایی مربوط به این است که ذخیره کربوهیدرات‌های موجود در محیط تماماً مصرف شده که در این صورت باکتری به مواد پپتون‌دار محیط رو می‌آورد و همچنین مقدار ناچیز اسیدی که در اثر تخمیر گلوکز حاصل شده به‌سرعت در مجاورت هوا (قسمت شیب‌دار) اکسید شده و ماحصل قلیایی است. در عمق لوله نیز به سبب فشار کم اکسیژن واکنش اسیدی حاصل از تخمیر قند گلوکز و همچنان اسیدی باقی می‌ماند.