مبانی الکتروفورز

مباني الکتروفورز

مبانی الکتروفورز

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت‌علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا… )

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان)

 

 

الکتروفورز (Electrophoresis) به حرکات ذرات بروی یک بستر تحت میدان الکتریکی گویند.

الکتروفورز روشی است که در آن نمونه‌هایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه‌ای متخلخل حرکت می‌کنند. سرعت حرکت مولکول‌ها در این شرایط نه‌تنها تحت تأثیر بار الکتریکی است بلکه عوامل دیگری نظیر اندازه و شکل مولکول نیز در این امر دخیل هستند. به همین دلیل الکتروفورز به‌عنوان روشی مناسب و کارآمد در جداسازی مولکول مورداستفاده قرار می‌گیرد. معمولاً الکتروفورز برای جداسازی مولکول‌های بزرگی چون پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به کار برده می‌شود، اما در مواردی نیز برای جداسازی مولکول‌های باردار کوچک‌تر نظیر قندها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و حتی یون‌های ساده مورداستفاده قرار می‌گیرد.

معمولاً برای الکتروفورز یک مخلوط مولکولی، لایه نازکی از آن، بر روی شبکه‌ای متخلخل که محلولی را درون خود محبوس کرده است، قرار داده می‌شود. پس از برقراری میدان الکتریکی با اعمال اختلاف‌پتانسیل در دو سوی این شبکه، مولکول‌های موجود در نمونه با سرعت‌های متفاوتی درون بستر متخلخل شروع به حرکت می‌کنند. این اختلاف سرعت مبنای جداسازی در الکتروفورز است. در پایان، مولکول‌های پروتئینی مختلف به‌صورت باندهایی مجزا در قسمت‌های مختلف بستر آشکار می‌شوند. بستر متخلخل در ممانعت از انتشار مولکول‌ها در اثر گرمای ایجادشده به خاطر جریان الکتریکی نقش مهمی دارد. علاوه بر این در مواردی که از ژل‌های آگاروز و پلی آکریلامید استفاده می‌شود، بستر متخلخل نقش یک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکول‌ها را نیز ایفا می‌کند.

در اغلب دستگاه‌های الکتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می‌گیرد به‌طوری‌که ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه می‌باشد.

جداسازی توسط الکتروفورز تحت تأثیر عوامل متعددی قرار دارد. ماهیت مولکول‌های نمونه نظیر بار الکتریکی و اندازه مولکول، شدت‌جریان میدان الکتریکی و بالاخره اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه‌ی استفاده از بافرها و حرارت ایجادشده در حین کار از عواملی هستند که بر نحوه جداسازی مولکول‌های نمونه اثر می‌گذارند:

 اثر عوامل الکتریکی

در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول‌ها تناسب مستقیم با اختلاف‌پتانسیل اعمال‌شده دارد. قانون اُهم در الکتروفورز از اهمیت زیادی برخوردار است.

معادله ۱: V=IR

معادله قانون اهم: V ولتاژ یا اختلاف‌پتانسیل برحسب ولت، I شدت‌جریان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است.

معادله فیزیکی دیگر که از اهمیت برخوردار است، معادله توان است. این معادله مقدار حرارت ایجادشده در حین الکتروفورز را مشخص می‌کند.

 P=V2/R

 P=I2R

 P=VI

معادله ۲- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.

این حرارت ایجادشده بر اثر مقاومتی است که الکترودها، بافر مورداستفاده و ژل دارند و به گرمای ژول[۱] موسوم است. منابع الکتریکی[۲] مورداستفاده در الکتروفورز ایجاد جریان مستقیم می‌کنند و معمولاً یکی از پارامترهای الکتریکی، یعنی یا جریان یا اختلاف‌پتانسیل یا توان را ثابت نگاه می‌دارند. باید توجه داشت که مقاومت مدار مورداستفاده در الکتروفورز را به‌هرحال نمی‌توان ثابت نگاه داشت. برای مثال در حین الکتروفورز، مقاومت بافر بر اثر گرمای ژول، کاهش می‌یابد. بنا بر نوع بافر به‌کاررفته و پارامتر الکتریکی که ثابت نگاه داشته می‌شود، گرمای ژول در حین انجام الکتروفورز ممکن است کاهش یا افزایش یابد. برای مثال در SDS-PAGE ثابت نگاه‌داشتن شدت‌جریان منجر به افزایش دما می‌شود که نیاز به سیستم خنک‌کننده را در چنین وضعیتی الزامی می‌کند. انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتریکی در حین الکتروفورز، با در نظر گرفتن متغیرهای مختلفی مانند مدت‌زمان موردنظر برای انجام الکتروفورز، الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعالیت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ می‌دهد و نیاز به حفظ دمای خاص برای انجام الکتروفورز می‌باشد، صورت می‌پذیرد. معمولاً پروتئین‌ها با جریان ثابت الکتروفورز می‌شوند، درحالی‌که الکتروفورز اسیدهای نوکلئیک با ولتاژ ثابت انجام می‌شود.

اثر سیستم‌های بافری و pH

پروتئین‌ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تأثیر pH محیطی که در آن قرار می‌گیرند، بار الکتریکی خاص خود را نشان می‌دهند. بدین ترتیب در جداسازی توسط الکتروفورز باید pH محلول‌های مورداستفاده ثابت باقی بماند. ازآنجاکه الکترولیز آب در آند یون‌های +H و در کاتد یون‌های OH ایجاد می‌کند، برای ثابت نگاه‌داشتن pH محلول‌های مورداستفاده، آن‌ها باید بافری شوند.

اثر حرارت

برای حفظ تکرارپذیری، ثابت نگاه‌داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسیار مهم است. برای مثال پلیمریزه شدن آکریلامید یک واکنش گرمازا است، ازاین‌رو گرمای ایجادشده در حین پلیمریزاسیون، به‌خصوص در مورد ژل‌های غلیظ‌تر، ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بی‌نظمی در اندازه‌ی منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولاً در ژل‌هایی با غلظت کمتر از ۱۵% مشکلی ایجاد نمی‌کند. به‌هرحال گرمای زیاد در حین الکتروفورز مشکلات دیگری را مانند شکستن شیشه‌های الکتروفورز، آسیب به دستگاه نیز پدید می‌آورد. وقتی‌که حرارت به‌صورت یکدست در تمام نقاط ژل منتشر نشود شکل باندهای جداشده نامنظم می‌شود و در اصطلاح باندها خندان[۳] می‌شوند؛ چون نمونه‌ها در ردیف‌های وسط سریع‌تر از ردیف‌های کناری حرکت خواهند کرد.

روش‌های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول‌ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌ها ابداع شده است که در زیر به معرفی انواع متداول آن می‌پردازیم.

الکتروفورز کافی

آند این دستگاه از جنس گرافیت است. همین ویژگی سبب کاهش چشمگیر قیمت آن شده است.

الکتروفورز سطحی

از یک نوار کاغذی یا استات سلولزی به‌عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. دو روش فوق جز در برخی کارهای پژوهشی کاربرد چندانی ندارند.

الکتروفورز ژل

در الکتروفورز ژل از یک محیط نیمه‌جامد (ژل) به‌عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته‌شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالایی بوده و برای تفکیک پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌شود. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می‌شود. تهیه ژل مزبور به‌مراتب سریع‌تر و آسان‌تر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری هم دارد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ) DNA بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) درصورتی‌که هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگاروز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات  DNA تک‌رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌گردد. قدرت تفکیک ژل‌های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آن‌ها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به‌اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳٪ و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگاروز ۰/۸ ٪ استفاده می‌شود. درصورتی‌که نیاز به تفکیک DNA به‌صورت تک‌رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل‌ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل‌هایی پیچ‌وتاب‌های اسیدهای نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول‌ها فقط بر اساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل‌ها مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر، سریع‌تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند.

 

الکتروفورز با ژل پلیآکریلآمید

به‌منظور بررسی پروتئین‌ها با استفاده از PAGE، به سبب این‌که پروتئین‌ها دارای بارهای مختلفی هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط بر اساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیایی      SDS  (سدیم دودسیل‌سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد که به آن‌ها متصل می‌گردد و باعث واسرشت شدن پروتئین‌ها می‌شود. به ازای هر دو اسیدآمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بار منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی‌اکریل‌آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول‌های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی DNA استفاده می‌شود.

اکثر روش‌های مربوط به تفکیک پروتئین‌ها که امروزه از آن‌ها استفاده می‌شود بر مبنای الکتروفورز منطقه‌ای یا ناپیوسته ژل‌های پلی‌آکریل‌آمید استوار است.

الکتروفورز منطقه‌ای روی ژل پلی آکریل آمید تحت عنوان PAGE شناخته می‌شود. در این روش از تفاوت وزن مولکولی پروتئین‌ها برای تفکیک آن‌ها از یکدیگر استفاده می‌شود. اساس این روش بر مبنای حرکت مولکول‌های باردار در یک میدان الکتریکی مشخص است. مشخصات میدان الکتریکی نظیر اختلاف‌پتانسیل، فاصله بین الکترودها، مشخصات مولکول نظیر اندازه مولکول و عوامل دیگری نظیر دما و زمان بر نحوه‌ی انجام این روش تأثیر می‌گذارند.

در سیستم ناپیوسته Laemmli دو نوع ژل وجود دارد: ژل ردیف کننده[۴] و ژل تفکیک‌کننده[۵]. ژل ردیف کننده ژلی با طول کم و با منافذ بزرگ است که در بالای ژل بلند و با منافذ کوچک تفکیک‌کننده قرار می‌گیرد. در سیستم Laemmli ژل‌های ردیف کننده و تفکیک‌کننده با توجه به ترکیب بافری خود ناپیوسته‌اند.

این دو پارامتر، بافرهای متفاوت و ترکیب آکریل آمید متفاوت به نمونه‌هایی با حجم نسبتاً بزرگ این اجازه را می‌دهد که در بخش بالای ژل ردیف کننده متمرکز شوند، پیش از آن‌که به واسطه ورود به ژل پائینی تفکیک‌کننده عمل جداسازی روی آن‌ها انجام گیرد.

مزیت مهم ژل ردیف کننده توانایی آن در تجمع پروتئین نمونه‌های بسیار رقیق است. این کار به‌طور مؤثری تفکیک مراحل بعدی را بهبود می‌بخشد، چراکه نمونه اصلی در ناحیه خیلی باریک و بسیار متمرکزی جمع می‌شود و همه مولکول‌های پروتئینی تفکیک الکتروفورتیک خود را تقریباً از یک نقطه شروع می‌کنند.

ردیف شدن ناشی از ایجاد یک گرادیان محدود و با ولتاژ بالا است که در آن پروتئین‌ها مقید به یک ناحیه باریک کاملاً متمرکز بین یون‌های کلراید پیشتاز و گلایسین دنباله‌رو می‌شوند. وقتی جریان الکتریکی از نمونه عبور می‌کند، یون کلراید از سایر یون‌ها که حرکت آرام‌تری دارند (مثل گلایسین) سریع‌تر حرکت می‌کنند. یون‌های نمونه با حرکت حد واسط خود بین یون‌های کلراید و گلایسین متراکم شده و در نتیجه یک ناحیه باریک یا باندی شکل بسیار متراکم ایجاد می‌شود. بنابراین ژل ردیف کننده قادر است پروتئین‌ها را به‌صورت باندی باریک ساندویچ کند. در ادامه برای انجام تفکیک الکتروفورتیک، پروتئین‌ها متراکم شده، از آن ناحیه جدا می‌شوند. تفکیک بدون ردیف کردن و با افزایش ناگهانی pH و کاهش قطر منافذ ژل نیز امکان‌پذیر است. تحت این شرایط، یون‌های نمونه به ژل تفکیک‌کننده مهاجرت کرده و یون‌های عقب دنباله‌رو (گلایسین) به‌طور متناوب از یون‌های نمونه پیشی گرفته و جلو می‌زنند. بنابراین گرادیان ولتاژ نسبتاً ثابتی ایجاد می‌شود که در آن تفکیک الکتروفورتیک نمونه رخ می‌دهد.

نحوه ایجاد منافذ با اندازه‌های متفاوت

ژل پلی آکریل آمید محدوده گسترده‌ای از اندازه‌های منافذ ژلی را در بر می‌گیرد. ژل پلی آکریل آمید با پلیمریزاسیون منومر آکریل آمید و منومر ایجاد کننده پیوند متقاطع[۶] بیس آکریل آمید شکل می‌گیرند.

 نحوه‌ی پلیمریزاسیون آکریل آمید

پلیمریزاسیون آکریل آمید و بیس آکریل آمید می‌تواند به‌صورت شیمیایی، با تترامتیل اتیلن دی آمین (TEMED)[7] و آمونیوم پرسولفات، یا سیستم فتوشیمیایی شروع شود. رادیکال‌های آزاد پرسولفات که با حل آمونیوم پرسولفات در آب ایجاد می‌شوند، منومر آکریل آمید را فعال کرده و TEMED با انتقال الکترون این واکنش را کاتالیز می‌کند. درعین‌حال ریبوفلاوین می‌تواند در حضور اکسیژن و اشعه UV رادیکال آزاد تولید کند. بعضی مواقع از ریبوفلاوین و آمونیوم پرسولفات برای ایجاد رادیکال‌های آزاد استفاده می‌شود.

اندازه منافذ ژل عامل اصلی در تعیین قدرت تفکیک پروتئین‌ها و اسید نوکلئیک در ژل‌های پلی آکریل آمید است. اندازه منافذ با دو پارامتر مشخص می‌شوند: محتوای کل ماده جامد یا %T و نسبت منومر ایجادکننده پیوند متقاطع به منومر آکریلامید یا . %C  بدین ترتیب پلیمرهای آکریل آمید می‌توانند منافذی با اندازه‌های بسیار متفاوتی را ایجاد کنند. با تغییر در غلظت آکریل آمید و نسبت اتصالات متقاطع، کنترل اندازه منافذ امکان‌پذیر است. برای مثال، با افزایش نسبت پیوندهای متقاطع، اندازه منافذ کاهش می‌یابد. انتخاب دقیق و درست غلظت ژل آکریل آمید برای جداسازی بهینه پروتئین‌ها در الکتروفورز ضروری است.

نکات دیگری نیز در نحوه‌ی پلیمریزه شدن مؤثرند، برای مثال با افزایش دمای پلیمریزاسیون، میزان پلیمریزاسیون افزایش می‌یابد و اندازه منافذ ژل کوچک می‌شود. درحالی‌که کاهش دمای پلیمریزاسیون می‌تواند ژل‌هایی با منافذ بزرگ تولید کند. عواملی که کارایی تبدیل منومر به پلیمر را تحت تأثیر قرار می‌دهند نیز می‌توانند اندازه حفره ژل را تحت تأثیر قرار دهند. برای مثال، استفاده از آکریل آمید با کیفیت پائین و نیز  pH بسیار بالا یا پایین سبب تبدیل ناکامل منومر به پلیمر شده و سبب ایجاد منافذ بزرگی در ژل می‌گردد. مواد افزودنی ژل نیز می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی ساختار منافذ ژل را تحت تأثیر قرار دهد. مثلاً اوره ۸ مولار سبب ایجاد ژل‌هایی با منافذ کوچک می‌شود.

 الکتروفورز DNA

برای تائید انجام آزمایشات ژنتیکی و بیولوژی مولکولی باید تغییراتی که روی  DNA ایجاد  شده است، رؤیت گردند. مشاهده DNA متعاقب الکتروفورز روی ژل آگاروز یا پلی آکریل آمید و رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید یا سایر رنگ‌های امکان‌پذیر خواهد بود. برای انتخاب درصد آگاروز از جدول شماره ۱ استفاده می‌شود:

 

جدول شماره ۱- قدرت جداسازی مولکول‌های DNA توسط غلظت‌های مختلف آگاروز

درصد آگاروز قدرت جداسازی DNA
۳ ۱۰۰-۱۰۰۰bp
۲ ۲۰۰- ۱۵۰۰bp
۱٫۵ ۳۰۰- ۳۰۰۰bp
۱ ۵۰۰ – ۵۰۰۰bp
۰٫۸ ۱۰۰۰- ۷۰۰۰bp
۰٫۶ ۱۰ – ۳۰kbp
۰٫۴ ۳۰ – ۵۰kbp

 

تهیه ژل آگاروز

  1. قالب ژل را آماده کنید.
  2. شانه‌ای با دنده‌های مناسب روی قالب قرار دهید.
  3. حجم ژل موردنظر را تعیین کنید (اندازه‌گیری طول و عرض قالب و قطر ژل موردنظر).
  4. پودر آگاروز را وزن کنید.
  5. آگاروز را در بافر ۱xTBE حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر ۱۰ میلی‌لیتر ژل یک میکرولیتر از محلول ۱۰mg/ml اتیدیوم بروماید اضافه کنید. سپس آن را خوب مخلوط کرده و داخل قالب بریزید.

 

 TBE 1x (pH8)

  • ۸۹mM Tris base
  • ۸۹mM boric acid
  • ۵mM EDTA
  1. بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید.
  2. هر ۵ میکرولیتر نمونه را با یک میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط کرده و داخل چاهک‌های ژل بریزید (این بافر حاوی ۵۰% ماده سنگین کننده مانند گلیسرین یا ساکاروز است که نمونه به‌خوبی داخل چاهک ریخته می‌شود و همچنین حاوی ۰/۲% از یک رنگ نشانه مانند بروموفنل‌بلو یا گزیلون‌سیانول می‌باشد. رنگ بروموفنل‌بلو در ژل ۱/۵% همراه با  ۵۰۰bp و در ژل ۰/۸% با ۱۰۰۰bp حرکت می‌کند.

جدول شماره ۳:  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA روی ژل آگاروز

درصد ژل آگاروز حرکت  تقریبی رنگ نشانه در مقایسه با مارکر حرکت تقریبی  DNA   در مقایسه با مارکر
بروموفنل بلو Xylen cyanol
۰/۴ ۵۰۰bp ۳ kbp ۲٫۵ kbp
۰/۸ ۵۰۰ bp ۳ kbp ۱kbp
۱ ۵۰۰bp ۳ kbp ۵۰۰ bp
۱/۲۵ ۵۰۰ bp ۳ kbp ۲۵۰bp
۱/۵ ۱۰۰bp ۱kbp ۲۵۰bp
۲ ۱۰۰bp ۱kbp ۱۰۰bp

 

جدول شماره ۴: مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA  روی ژل پلی آکریل آمید

درصد ژل پلی آکریل آمید حرکت  تقریبی رنگ نشانه  در مقایسه با مارکر حرکت تقریبی  DNA در مقایسه با مارکر
بروموفنل بلو Xylen cyanol
۳/۵ ۱۰۰bp ۵۰۰ bp ۱۰۰ bp
۵ ۷۵bp ۲۵۰bp ۷۵bp
۸ ۵۰bp ۲۵۰bp ۵۰ bp
۱۲ ۲۵bp ۷۵bp ۲۵bp
۱۵ ۱۰bp ۶۰bp ۲۵bp
۲۰ ۱۰bp ۶۰bp ۵bp

 

  1. بافر تانک باید کاملاً روی  ژل  را پوشانده و نمونه‌ها از داخل بافر درون چاهک‌ها ریخته شوند. برای الکتروفورز از بافرهای مختلف استفاده می‌گردد. بهتر است هنگام الکتروفورز به ازای هر میلی‌لیتر بافر تانک (TBE buffer) یک میکرولیتر از اتیدیوم بروماید ۱۰mg/ml اضافه شود.
  2. DNA دارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید نمونه به‌طرف قطب منفی باشد تا هنگام الکتروفورز به سمت قطب مثبت حرکت کند.
  3. تانک الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل کنید.
  4. پیچ Current را روی ماکزیمم قرار داده و ولتاژ را تنظیم کنید (۱۰V/centimeter)
  5. وقتی رنگ نشانه سه‌چهارم طول ژل را طی کرد، ژل را از تانک خارج کرده با نور UV نتیجه را مشاهده کنید.

تهیه ژل پلی آکریل آمید:

قدرت تفکیک سازی این ژل بسیار بالا است و قطعات DNA با طول کم نیز در این ژل قابل‌رؤیت می‌باشند و بسته به درصد ژل حتی اختلاف یک باز را می‌توان در قطعات DNA الکتروفورز شده مشاهده نمود.

  1. شیشه‌ها، شانه[۸] و فضاسازها[۹] را با آب و دترجنت خوب بشویید و سپس با الکل ۷۰ درصد آن‌ها را تمیز کنید تا چربی دست‌ها روی آن‌ها باقی نماند. (به‌جای پنبه از گاز استفاده کنید. زیرا پرزهای پنبه روی شیشه باقی می‌مانند).
  2.  قالب ژل را آماده کرده و جهت جلوگیری از نشت ژل از داخل آن اطراف آن را با آگاروز ۱% به‌دقت درزگیری[۱۰] نمایید.
  3.  حجم قالب[۱۱] (حجم ژل) را با اندازه‌گیری طول و عرض قالب مشخص نمایید (قطر ژل بسته به قطر فضا سازها یک و یا نیم میلی‌متر است).
  4.  بسته به درصد ژل موردنظر مقدار آکریل آمید و بیس آکریل آمید لازم را (به‌صورت مخلوط ۲۹% آکریل آمید و ۱% بیس آکریل آمید تهیه و در یخچال نگهداری می‌شود) داخل لوله تمیز بریزید.
  5.  از بافر ۱۰xTBE با غلظت نهایی ۱x اضافه کنید و با آب مقطر به حجم موردنظر برسانید.
  6.  مقدار ۱۰۰ میکرولیتر آمونیوم پرسولفات ۱۰% و ۳ میکرو لیتر محلول TEMED به آن اضافه کنید (توجه داشته باشید که منومرهای آکریل آمید و بیس آکریل آمید در حال پلیمریزه شدن هستند).

طرز تهیه APS 10% (آمونیوم پرسولفات):

۴ گرم از پودر APS را با ml40 از آب مقطر مخلوط نموده و ورتکس کنید تا به‌خوبی حل شود. سپس در ویال‌های کوچک تقسیم و در فریزر نگهداری کنید.

  1.  به‌آرامی محلول را در قالب از قبل آماده‌شده بریزید و مراقب باشید که حباب هوا وارد آن نشود. زیرا حباب هوا مانع انجام الکتروفورز می‌شود.
  2. به‌آرامی شانه را داخل قالب قرار دهید تا بعد از پلیمریزه شدن ژل، درون آن چاهک‌هایی جهت نمونه گذاری ایجاد شود.
  3. بعد از پلیمریزه شده به‌آرامی شانه را درآورده و چاهک‌ها را با آب بشویید تا اگر منومرهای پلیمریزه نشده هنوز وجود دارد، شسته شوند.
  4. گیره پایینی را باز کنید و فضاساز پایینی را از قالب خارج کنید.
  5. گیره‌های طرفین را باز کرده و دستگاه را طوری داخل تانک مخصوص قرار دهید که قسمت بریده شده شیشه رویی[۱۲] به سمت محفظه بالایی (تانک فوقانی) قرار گیرد.
  6. شیشه‌های دستگاه (قالب) را با نصب گیره‌های مخصوص به‌طرفین تانک، ثابت نمایید.
  7. محفظه‌های بالا و پایین تانک را با بافر TBE1x پر نمایید. به‌طوری‌که بافر روی چاهک‌ها را بپوشاند. چنانچه بین دو شیشه قالب (محل خارج کردن فضاساز پایینی) که در محفظه پایینی تانک قرار دارد حباب هوا مشاهده می‌شود با یک سرنگ پر از بافر که دارای سرسوزن کج است حباب هوا را بیرون کنید تا مانع جریان الکتریکی نشود و الکتروفورز به‌خوبی انجام گیرد.
  8. محصول PCR را (همانند الکتروفورز با ژل آگاروز) با بافر نمونه گذاری مخلوط کرده و توسط سرنگ همیلتون نمونه گذاری را روی ژل انجام دهید.
  9. محفظه بالایی تانک را به قطب منفی و محفظه پایینی را به قطب مثبت منبع تغذیه وصل کرده و الکتروفورز کنید.
  10. بعد از خاتمه الکتروفورز (وقتی رنگ نشانه به پایین ژل رسید) جریان برق را قطع کرده و شیشه را از تانک جدا کنید. با یک تیغه فلزی نازک به‌آرامی بین دو شیشه فشار آورید تا دو شیشه از هم جدا شوند. ژل به یکی از دو شیشه می‌چسبد. به‌آرامی آن را داخل آب حاوی ۱۰ میکروگرم در هر میلی‌لیتر اتیدیوم بروماید قرار دهید تا بعد از چند دقیقه ژل رنگ شود. سپس ژل با دستگاه UV Transilluminator موردبررسی قرار می‌گیرد.

[۱] Joule heat

[۲] Power supply

[۳] Smile

[۴] Stacking

[۵] Resolving

[۶] Cross linker

[۷] N,N,N’,N’-tetra methyl ethylene diamine

[۸] Comb

[۹] Spacer

[۱۰] Seal

[۱۱] cast

[۱۲] Notch

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (۳)

نکته‌های کلیدی آزمایشگاهی در الکتروفورز هموگلوبین، پروتئین و CSF

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی
  • قانون اهم
  • مباني الکتروفورز

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *