مباني الکتروفورز

مباني الکتروفورز

دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت‌علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا… )

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان)

 

 

الکتروفورز (Electrophoresis) به حرکات ذرات بروی یک بستر تحت میدان الکتریکی گویند.

الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه‌هایی که بار الکتريکي دارند، تحت تأثیر يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه‌ای متخلخل حركت می‌کنند. سرعت حرکت مولکول‌ها در اين شرايط نه‌تنها تحت تأثیر بار الکتريکي است بلکه عوامل ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. به همين دليل الکتروفورز به‌عنوان روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورداستفاده قرار می‌گیرد. معمولاً الکتروفورز براي جداسازي مولکول‌های بزرگي چون پروتئین‌ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده می‌شود، اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکول‌های باردار کوچک‌تر نظير قندها، اسيدهاي آمينه، پپتيدها و حتي یون‌های ساده مورداستفاده قرار می‌گیرد.

معمولاً براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي، لايه نازکي از آن، بر روي شبکه‌ای متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است، قرار داده می‌شود. پس از برقراری ميدان الکتريکي با اعمال اختلاف‌پتانسیل در دو سوي اين شبکه، مولکول‌های موجود در نمونه با سرعت‌های متفاوتي درون بستر متخلخل شروع به حرکت می‌کنند. اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان، مولکول‌های پروتئيني مختلف به‌صورت باندهايي مجزا در قسمت‌های مختلف بستر آشکار می‌شوند. بستر متخلخل در ممانعت از انتشار مولکول‌ها در اثر گرماي ایجادشده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل‌های آگاروز و پلي آکريلاميد استفاده می‌شود، بستر متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکول‌ها را نيز ايفا می‌کند.

در اغلب دستگاه‌های الکتروفورز، ژل مابين دو محفظه بافري قرار می‌گیرد به‌طوری‌که ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه می‌باشد.

جداسازي توسط الکتروفورز تحت تأثیر عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکول‌های نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه مولکول، شدت‌جریان ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه‌ی استفاده از بافرها و حرارت ایجادشده در حين کار از عواملي هستند که بر نحوه جداسازي مولکول‌های نمونه اثر می‌گذارند:

 اثر عوامل الکتريکي

در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول‌ها تناسب مستقيم با اختلاف‌پتانسیل اعمال‌شده دارد. قانون اُهم در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است.

معادله 1: V=IR

معادله قانون اهم: V ولتاژ يا اختلاف‌پتانسیل برحسب ولت، I شدت‌جریان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است.

معادله فيزيکي ديگر که از اهميت برخوردار است، معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ایجادشده در حين الکتروفورز را مشخص می‌کند.

 P=V2/R

 P=I2R

 P=VI

معادله 2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.

اين حرارت ایجادشده بر اثر مقاومتي است که الکترودها، بافر مورداستفاده و ژل دارند و به گرماي ژول[1] موسوم است. منابع الکتريکي[2] مورداستفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم می‌کنند و معمولاً يکي از پارامترهاي الکتريکي، يعني يا جريان يا اختلاف‌پتانسیل يا توان را ثابت نگاه می‌دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورداستفاده در الکتروفورز را به‌هرحال نمی‌توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز، مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول، کاهش می‌یابد. بنا بر نوع بافر به‌کاررفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته می‌شود، گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد. براي مثال در SDS-PAGE ثابت نگاه‌داشتن شدت‌جریان منجر به افزايش دما می‌شود که نياز به سيستم خنک‌کننده را در چنين وضعيتي الزامي می‌کند. انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز، با در نظر گرفتن متغیرهای مختلفي مانند مدت‌زمان موردنظر براي انجام الکتروفورز، الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ می‌دهد و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز می‌باشد، صورت می‌پذیرد. معمولاً پروتئین‌ها با جريان ثابت الکتروفورز می‌شوند، درحالی‌که الکتروفورز اسیدهای نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام می‌شود.

اثر سیستم‌های بافري و pH

پروتئین‌ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تأثیر pH محيطي که در آن قرار می‌گیرند، بار الکتریکی خاص خود را نشان می‌دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH محلول‌های مورداستفاده ثابت باقي بماند. ازآنجاکه الکتروليز آب در آند یون‌های +H و در کاتد یون‌های OH ايجاد می‌کند، براي ثابت نگاه‌داشتن pH محلول‌های مورداستفاده، آن‌ها بايد بافری شوند.

اثر حرارت

براي حفظ تکرارپذیری، ثابت نگاه‌داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پليمريزه شدن آکريلاميد يک واکنش گرمازا است، ازاین‌رو گرماي ایجادشده در حين پليمريزاسيون، به‌خصوص در مورد ژل‌های غلیظ‌تر، ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بی‌نظمی در اندازه‌ی منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولاً در ژل‌هایي با غلظت کمتر از 15% مشکلي ایجاد نمی‌کند. به‌هرحال گرماي زياد در حين الکتروفورز مشکلات ديگري را مانند شکستن شیشه‌های الکتروفورز، آسيب به دستگاه نيز پديد می‌آورد. وقتی‌که حرارت به‌صورت یکدست در تمام نقاط ژل منتشر نشود شکل باندهاي جداشده نامنظم مي‌شود و در اصطلاح باندها خندان[3] می‌شوند؛ چون نمونه‌ها در ردیف‌های وسط سریع‌تر از ردیف‌های کناري حرکت خواهند کرد.

روش‌های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول‌ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌ها ابداع شده است که در زیر به معرفی انواع متداول آن می‌پردازیم.

الکتروفورز کافی

آند این دستگاه از جنس گرافیت است. همین ویژگی سبب کاهش چشمگیر قیمت آن شده است.

الکتروفورز سطحی

از یک نوار کاغذی یا استات سلولزی به‌عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. دو روش فوق جز در برخی کارهای پژوهشی کاربرد چندانی ندارند.

الکتروفورز ژل

در الکتروفورز ژل از یک محیط نیمه‌جامد (ژل) به‌عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته‌شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالایی بوده و برای تفکیک پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌شود. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می‌شود. تهیه ژل مزبور به‌مراتب سریع‌تر و آسان‌تر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری هم دارد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ) DNA بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) درصورتی‌که هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگاروز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات  DNA تک‌رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌گردد. قدرت تفکیک ژل‌های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آن‌ها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به‌اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳٪ و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگاروز 0/8 ٪ استفاده می‌شود. درصورتی‌که نیاز به تفکیک DNA به‌صورت تک‌رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل‌ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل‌هایی پیچ‌وتاب‌های اسیدهای نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول‌ها فقط بر اساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل‌ها مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر، سریع‌تر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند.

 

الکتروفورز با ژل پليآکريلآميد

به‌منظور بررسی پروتئین‌ها با استفاده از PAGE، به سبب این‌که پروتئین‌ها دارای بارهای مختلفی هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط بر اساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیایی      SDS  (سدیم دودسیل‌سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد که به آن‌ها متصل می‌گردد و باعث واسرشت شدن پروتئین‌ها می‌شود. به ازای هر دو اسیدآمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بار منفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی‌اکریل‌آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول‌های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی DNA استفاده می‌شود.

اكثر روش‌های مربوط به تفكيك پروتئین‌ها كه امروزه از آن‌ها استفاده می‌شود بر مبناي الكتروفورز منطقه‌ای يا ناپيوسته ژل‌های پلي‌آكريل‌آميد استوار است.

الكتروفورز منطقه‌ای روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان PAGE شناخته می‌شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي پروتئین‌ها براي تفکيک آن‌ها از يکديگر استفاده می‌شود. اساس اين روش بر مبناي حركت مولکول‌های باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف‌پتانسیل، فاصلة بين الكترودها، مشخصات مولکول نظير اندازه مولكول و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه‌ی انجام اين روش تأثیر می‌گذارند.

در سیستم ناپيوسته Laemmli دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده[4] و ژل تفکیک‌کننده[5]. ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکیک‌کننده قرار می‌گیرد. در سيستم Laemmli ژل‌های رديف کننده و تفکیک‌کننده با توجه به تركيب بافري خود ناپیوسته‌اند.

اين دو پارامتر، بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه‌هایی با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را می‌دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند، پيش از آن‌که به واسطة ورود به ژل پائيني تفکیک‌کننده عمل جداسازي روي آن‌ها انجام گيرد.

مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تجمع پروتئين نمونه‌هاي بسيار رقيق است. اين كار به‌طور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود می‌بخشد، چراکه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع می‌شود و همة مولکول‌های پروتئيني تفکیک الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع می‌کنند.

رديف شدن ناشي از ايجاد يك گراديان محدود و با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئین‌ها مقيد به يك ناحية باريك کاملاً متمركز بين یون‌های كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله‌رو می‌شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور می‌کند، يون كلرايد از ساير یون‌ها كه حركت آرام‌تری دارند (مثل گلايسين) سریع‌تر حرکت می‌کنند. یون‌های نمونه با حركت حد واسط خود بين یون‌های كلرايد و گلايسين متراکم شده و در نتیجه يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متراکم ايجاد می‌شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است پروتئین‌ها را به‌صورت باندي باريك ساندويچ كند. در ادامه براي انجام تفکیک الكتروفورتيك، پروتئین‌ها متراکم شده، از آن ناحیه جدا می‌شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطر منافذ ژل نيز امکان‌پذیر است. تحت اين شرايط، یون‌های نمونه به ژل تفکیک‌کننده مهاجرت كرده و یون‌های عقب دنباله‌رو (گلايسين) به‌طور متناوب از یون‌های نمونه پيشي گرفته و جلو می‌زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد می‌شود كه در آن تفکیک الكتروفورتيك نمونه رخ می‌دهد.

نحوه ايجاد منافذ با اندازه‌های متفاوت

ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده‌ای از اندازه‌های منافذ ژلي را در بر مي‌گيرد. ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون منومر آكريل آميد و منومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع[6] بيس آکريل آميد شكل می‌گیرند.

 نحوه‌ی پليمريزاسيون آکريل آميد

پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد می‌تواند به‌صورت شيميايي، با تترامتيل اتيلن دي آمين (TEMED)[7] و آمونيوم پرسولفات، يا سيستم فتوشيميايي شروع شود. رادیکال‌های آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد می‌شوند، منومر آكريل آميد را فعال كرده و TEMED با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز می‌کند. درعین‌حال ريبوفلاوين می‌تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند. بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد رادیکال‌های آزاد استفاده می‌شود.

اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئین‌ها و اسید نوکلئیک در ژل‌های پلي آكريل آميد است. اندازه منافذ با دو پارامتر مشخص می‌شوند: محتواي کل ماده جامد يا %T و نسبت منومر ایجادکننده پيوند متقاطع به منومر آکريلاميد يا . %C  بدين ترتيب پلیمرهای آكريل آميد می‌توانند منافذي با اندازه‌های بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع، کنترل اندازه منافذ امکان‌پذیر است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع، اندازه منافذ كاهش می‌یابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئین‌ها در الكتروفورز ضروري است.

نکات ديگري نيز در نحوه‌ی پليمريزه شدن مؤثرند، براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش می‌یابد و اندازه منافذ ژل كوچك می‌شود. درحالی‌که كاهش دماي پليمريزاسيون می‌تواند ژل‌هایي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل منومر به پلیمر را تحت تأثیر قرار می‌دهند نيز می‌توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثیر قرار دهند. براي مثال، استفاده از آكريل آميد با كيفيت پائين و نيز  pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل منومر به پلیمر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل می‌گردد. مواد افزودني ژل نيز می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی ساختار منافذ ژل را تحت تأثیر قرار دهد. مثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژل‌هایي با منافذ کوچک می‌شود.

 الكتروفورز DNA

براي تائید انجام آزمایشات ژنتيكی و بیولوژی مولکولی بايد تغييراتي كه روي  DNA ايجاد  شده است، رؤیت گردند. مشاهده DNA متعاقب الكتروفورز روي ژل آگاروز يا پلي آكريل آميد و رنگ‌آمیزی با اتيديوم برومايد یا سایر رنگ‌های امکان‌پذیر خواهد بود. براي انتخاب درصد آگاروز از جدول شماره 1 استفاده می‌شود:

 

جدول شماره 1- قدرت جداسازي مولکول‌های DNA توسط غلظت‌های مختلف آگاروز

درصد آگاروز قدرت جداسازي DNA
3 100-1000bp
2 200- 1500bp
1.5 300- 3000bp
1 500 – 5000bp
0.8 1000- 7000bp
0.6 10 – 30kbp
0.4 30 – 50kbp

 

تهيه ژل آگاروز

  1. قالب ژل را آماده كنيد.
  2. شانه‌ای با دنده‌های مناسب روي قالب قرار دهید.
  3. حجم ژل موردنظر را تعيين كنيد (اندازه‌گیری طول و عرض قالب و قطر ژل موردنظر).
  4. پودر آگاروز را وزن كنيد.
  5. آگاروز را در بافر 1xTBE حل كنيد و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنك شدن به ازاي هر 10 میلی‌لیتر ژل يك ميكروليتر از محلول 10mg/ml اتيديوم برومايد اضافه كنيد. سپس آن را خوب مخلوط كرده و داخل قالب بريزيد.

 

 TBE 1x (pH8)

  • 89mM Tris base
  • 89mM boric acid
  • 5mM EDTA
  1. بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج كرده و داخل تانك الكتروفورز قرار دهيد.
  2. هر 5 ميكروليتر نمونه را با يك ميكروليتر لودینگ بافر مخلوط كرده و داخل چاهک‌های ژل بريزيد (اين بافر حاوي 50% ماده سنگين كننده مانند گليسرين يا ساكاروز است كه نمونه به‌خوبی داخل چاهك ريخته می‌شود و همچنين حاوي 0/2% از يك رنگ نشانه مانند بروموفنل‌بلو يا گزيلون‌سيانول می‌باشد. رنگ بروموفنل‌بلو در ژل 1/5% همراه با  500bp و در ژل 0/8% با 1000bp حركت می‌کند.

جدول شماره 3:  مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA روي ژل آگاروز

درصد ژل آگاروز حركت  تقريبي رنگ نشانه در مقايسه با ماركر حركت تقريبي  DNA   در مقايسه با ماركر
بروموفنل بلو Xylen cyanol
0/4 500bp 3 kbp 2.5 kbp
0/8 500 bp 3 kbp 1kbp
1 500bp 3 kbp 500 bp
1/25 500 bp 3 kbp 250bp
1/5 100bp 1kbp 250bp
2 100bp 1kbp 100bp

 

جدول شماره 4: مقايسه حركت رنگ نشانه و ماركر DNA  روي ژل پلي آكريل آميد

درصد ژل پلي آكريل آميد حركت  تقريبي رنگ نشانه  در مقايسه با ماركر حركت تقريبي  DNA در مقايسه با ماركر
بروموفنل بلو Xylen cyanol
3/5 100bp 500 bp 100 bp
5 75bp 250bp 75bp
8 50bp 250bp 50 bp
12 25bp 75bp 25bp
15 10bp 60bp 25bp
20 10bp 60bp 5bp

 

  1. بافر تانك بايد کاملاً روي  ژل  را پوشانده و نمونه‌ها از داخل بافر درون چاهک‌ها ريخته شوند. برای الکتروفورز از بافرهاي مختلف استفاده می‌گردد. بهتر است هنگام الكتروفورز به ازاي هر میلی‌لیتر بافر تانك (TBE buffer) يك ميكروليتر از اتيديوم برومايد 10mg/ml اضافه شود.
  2. DNA داراي شارژ منفي است و براي الكتروفورز شدن بايد نمونه به‌طرف قطب منفي باشد تا هنگام الکتروفورز به سمت قطب مثبت حركت كند.
  3. تانك الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل كنيد.
  4. پيچ Current را روي ماكزيمم قرار داده و ولتاژ را تنظيم كنيد (10V/centimeter)
  5. وقتي رنگ نشانه سه‌چهارم طول ژل را طي كرد، ژل را از تانك خارج كرده با نور UV نتيجه را مشاهده كنيد.

تهيه ژل پلي آكريل آميد:

قدرت تفكيك سازي اين ژل بسيار بالا است و قطعات DNA با طول كم نيز در اين ژل قابل‌رؤیت می‌باشند و بسته به درصد ژل حتي اختلاف يك باز را می‌توان در قطعات DNA الكتروفورز شده مشاهده نمود.

  1. شیشه‌ها، شانه[8] و فضاسازها[9] را با آب و دترجنت خوب بشوييد و سپس با الكل 70 درصد آن‌ها را تميز كنيد تا چربي دست‌ها روي آن‌ها باقي نماند. (به‌جای پنبه از گاز استفاده كنيد. زيرا پرزهاي پنبه روي شيشه باقي می‌مانند).
  2.  قالب ژل را آماده كرده و جهت جلوگيري از نشت ژل از داخل آن اطراف آن را با آگاروز 1% به‌دقت درزگیری[10] نماييد.
  3.  حجم قالب[11] (حجم ژل) را با اندازه‌گیری طول و عرض قالب مشخص نماييد (قطر ژل بسته به قطر فضا سازها يك و يا نيم میلی‌متر است).
  4.  بسته به درصد ژل موردنظر مقدار آكريل آميد و بيس آكريل آميد لازم را (به‌صورت مخلوط 29% آكريل آميد و 1% بيس آكريل آميد تهيه و در يخچال نگهداري می‌شود) داخل لوله تميز بريزيد.
  5.  از بافر 10xTBE با غلظت نهايي 1x اضافه كنيد و با آب مقطر به حجم موردنظر برسانيد.
  6.  مقدار 100 ميكروليتر آمونيوم پرسولفات 10% و 3 ميكرو ليتر محلول TEMED به آن اضافه كنيد (توجه داشته باشيد كه منومرهاي آكريل آميد و بيس آكريل آميد در حال پليمريزه شدن هستند).

طرز تهیه APS 10% (آمونیوم پرسولفات):

4 گرم از پودر APS را با ml40 از آب مقطر مخلوط نموده و ورتکس كنيد تا به‌خوبی حل شود. سپس در ویال‌های کوچک تقسیم و در فریزر نگهداری كنيد.

  1.  به‌آرامی محلول را در قالب از قبل آماده‌شده بريزيد و مراقب باشيد كه حباب هوا وارد آن نشود. زيرا حباب هوا مانع انجام الکتروفورز می‌شود.
  2. به‌آرامی شانه را داخل قالب قرار دهيد تا بعد از پليمريزه شدن ژل، درون آن چاهک‌هايي جهت نمونه گذاري ايجاد شود.
  3. بعد از پليمريزه شده به‌آرامی شانه را درآورده و چاهک‌ها را با آب بشوييد تا اگر منومرهاي پليمريزه نشده هنوز وجود دارد، شسته شوند.
  4. گيره پاييني را باز كنيد و فضاساز پاييني را از قالب خارج كنيد.
  5. گیره‌های طرفين را باز كرده و دستگاه را طوري داخل تانك مخصوص قرار دهید که قسمت بريده شده شيشه رويي[12] به سمت محفظه بالايي (تانك فوقاني) قرار گيرد.
  6. شیشه‌های دستگاه (قالب) را با نصب گیره‌های مخصوص به‌طرفين تانك، ثابت نماييد.
  7. محفظه‌های بالا و پايين تانك را با بافر TBE1x پر نماييد. به‌طوری‌که بافر روي چاهک‌ها را بپوشاند. چنانچه بين دو شيشه قالب (محل خارج كردن فضاساز پاييني) كه در محفظه پاييني تانك قرار دارد حباب هوا مشاهده می‌شود با يك سرنگ پر از بافر كه داراي سرسوزن كج است حباب هوا را بيرون كنيد تا مانع جريان الكتريكي نشود و الکتروفورز به‌خوبی انجام گيرد.
  8. محصول PCR را (همانند الكتروفورز با ژل آگاروز) با بافر نمونه گذاري مخلوط كرده و توسط سرنگ هميلتون نمونه گذاري را روي ژل انجام دهيد.
  9. محفظه بالايي تانك را به قطب منفي و محفظه پاييني را به قطب مثبت منبع تغذيه وصل كرده و الكتروفورز كنيد.
  10. بعد از خاتمه الكتروفورز (وقتي رنگ نشانه به پايين ژل رسيد) جريان برق را قطع كرده و شيشه را از تانك جدا كنيد. با يك تيغه فلزي نازك به‌آرامی بين دو شيشه فشار آوريد تا دو شيشه از هم جدا شوند. ژل به يكي از دو شيشه می‌چسبد. به‌آرامی آن را داخل آب حاوي 10 ميكروگرم در هر میلی‌لیتر اتيديوم برومايد قرار دهيد تا بعد از چند دقيقه ژل رنگ شود. سپس ژل با دستگاه UV Transilluminator موردبررسی قرار می‌گیرد.

[1] Joule heat

[2] Power supply

[3] Smile

[4] Stacking

[5] Resolving

[6] Cross linker

[7] N,N,N’,N’-tetra methyl ethylene diamine

[8] Comb

[9] Spacer

[10] Seal

[11] cast

[12] Notch

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (3)

نکته‌های کلیدی آزمایشگاهی در الکتروفورز هموگلوبین، پروتئین و CSF

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

پاسخی قرار دهید

ایمیل شما هنوز ثبت نشده است.