فلوسایتومتری

flow cytometry

مروری بر روش فلوسایتومتری

فتانه توسلیان، دانشجوی دکتری تخصصی ایمونولوژی پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده پزشکی

دکتر احمد زواران حسینی، استاد گروه ایمونولوژی، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده پزشکی، گروه ایمونولوژی

الهام عبدالهی، دانشجوی دکتری تخصصی ایمونولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، دانشکده پزشکی

فلوسایتومتری (Flow Cytometry) روشی است که در آن سلول‌های موجود در سوسپانسیون در منطقه تمرکز هیدرودینامیک به صورت جریان لامینار از فلوسل و مقابل نور لیزر عبور کرده و از نظر مشخصات فیزیکی مثل اندازه، داشتن گرانول، شکل و پیچیدگی هسته و نیز از نظر شاخص های موجود در سطح غشا، سیتوپلاسم و هسته با واسطه آنتی‌بادی‌های منوکلونال و پلی‌کلونالی که با مواد فلورسانس نشاندار شده‌اند بررسی می‌گردند. پرتوهای لیزر بر روی سلول‌ها (متصل به رنگ فلورسنس) متمرکز و به آنها برخورد می‌نمایند و پراکنده می‌شوند.

پراکندگی‌ها در جهت جلو  (FSC)و جانبی(SSC)  ثبت می‌شوند. پرتوهای پراکنده شده پیش از رسیدن به آشکارسازها از طریق فیلترها و آیینه‌ها در جهت صحیح هدایت و توسط تقویت‌ کننده‌ها، تقویت شده و سپس به آشکارساز می‌رسند. کاربردهای مختلفی برای فلوسایتومتری وجود دارد که از جمله مهم‌ترین آنها می‌توان به ایمیونوفنوتایپینگ لوسمی‌های حاد و مزمن، بیماری‌های پلاسماسل‌ها، پایش درمان در لوسمی‌ها، تعیین فاکتورهای مؤثر در پیش‌آگهی، تشخیص بیماری‌های نقص ایمنی ارثی و اکتسابی اشاره کرد.

مقدمه

در تکنیک‌های وسترن‌بلات، PCR وReal time  نیازمند دسترسی به کل محتوای ژنتیکی سلول و یا محتوای پروتئینی هستیم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌، بنابراین باید غشای سلول تخریب شود و در نتیجه ما خود سلول را دیگر نخواهیم داشت. اما برخی از تکنیک‌های شناسایی پروتئین وجود دارند که بدون از بین رفتن غشای سلول می‌توانند در تشخیص سلول محقق را یاری کنند. از جمله این تکنیک‌ها می‌توان به فلوسایتومتری و ایمونوفلورسنت اشاره نمود (۱). تکنیک فلوسایتومتری، تکنیکی است که سلول‌ها را به طور سوسپانسیون (نه چسبنده) مورد آنالیز قرار می‌دهد. در حقیقت شرط اصلی در کار با این تکنیک این است که سلول‌ها حتماً به صورت سوسپانسیون باشند، بنابراین نمونه‌هایی که به صورت بافت هستند اگر نیاز به بررسی با فلوسایتومتری دارند باید حتماً به صورت سوسپانسیون درآورده شوند (۲).

فلوسایتومتری نقش مهمی در زمینه‌های مختلف آسیب‌شناسی، هماتولوژی، ایمنی‌شناسی، بیماری‌های عفونی، بررسی پیوند اعضاء، نئوپلازیا و ژنتیک دارد و از طرفی بررسی وقایع چرخه سلولی و نقایص موجود در DNA جهت تشخیص انواع لوسمی‌ها و لنفوم‌ها بوسیله فلوسیتومتری امکان‌پذیر است. همچنین این روش در تشخیص بیماری‌ها، تعیین پیش‌آگهی و همچنین برای ارزیابی درمان بدخیمی‌ها کاربرد دارد. فلوسایتومترهای کلینیکی معمولاً برای استفاده آزمایشگاه‌های کلینیکی تنظیم شده است، اما بعضی از آنها ظرفیت جداسازی انتخابی سلول‌ها را Sorting دارا می‌باشند که در کارهای تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرند (۳).

فلوسیتومتری و آپوپتوز سلول‌ها

آپوپتوز یکی از شکل‌های مرگ سلول می‌باشد که از نظر بیولوژی اهمیت زیادی دارد و به همین دلیل ردیابی و اندازه‌‌گیری آپوپتوز در تحقیقات و موارد بالینی اهمیت پیدا می‌کند. سلول‌های در حال آپوپتوز نشانه‌های زیادی دارند که قابل اندازه‌گیری با فلوسایتومتری می‌باشند؛ این نشانه‌ها عبارتند از تغییرات در غشاء پلاسمائی سلول، تغییرات در نفوذپذیری غشاء پلاسمائی، تغییرات در نفوذپذیری غشاء میتوکندری، فعال‌سازی کاسپازها و شکستگی‌های DNA سلولی. شناسایی هر یک از این تغییرات به تنهایی یا ترکیبی از آنها به وسیله فلوسایتومتری، امکان شناسایی و اندازه‌‌گیری سلول‌های آپوپتوتیک را از میان مخلوطی از سلول‌های دیگر فراهم می‌کند، همچنین اطلاعات باارزشی درباره مسیر مولکولی مرگ سلول‌ها به دست می‌آید (۴).

فلوسیتومتری و آنالیز DNA

دسترسی به رنگ‌های فلورسنتی که به صورت خطی و متناسب با غلظت به DNA سلولی متصل می‌شوند فلوسایتومتری را برای آنالیز DNA توانمند ساخته است. امروزه تعیین کمی مقدار DNA، شناسایی سلول‌های دیپلوئید نرمال در حالت استراحت، شناسایی سلول‌هایی که به طور فعال DNA سنتز می‌کنند و شناسایی سلول‌هایی که در مرحله پیش‌میتوز و یا میتوز هستند توسط فلوسایتومتر امکان‌پذیر شده است. هنگامی که فازهای مختلف چرخه زندگی سلول‌ها مشخص شدند، می‌توان با توأم‌ کردن روش‌های ردیابی پروتئین‌های مؤثر در چرخه سلولی به وسیله آنتی‌بادی‌های اختصاصی و روش تعیین مقدار DNA، بیان پروتئین‌ها را در فازهای مختلف زندگی سلول‌ها بررسی کرد.

اضافه‌ نمودن آنالوگ تیمیدین یا بروموداکسی یوریدین به محیط کشت سلولی امکان شناسایی سلول‌هایی را فراهم می‌کند که فعالانه در حال سنتز DNA هستند. با استفاده از روش تعیین مقدار DNA همچنین می‌توان تعداد کروموزوم‌ها (هنجار یا ناهنجار) را مشخص کرد. سلول‌هایی که به حالت پلوئیدی (برای مثال در مگاکاریوسیت‌ها) و یا آناپلوئیدی (برای مثال در بیماری‌های بدخیم) می‌باشند نیز با این روش قابل شناسایی هستند (۵).

مزایای سیستم فلوسایتومتری بر سایر روش‌های اندازه‌گیری فلورورسانس

 ۱- عینی بودن Objective

۲- حساسیت بالا: دستگاه می‌تواند تا بیش از هزار مولکول فلوئوروکروم را در سلول مشخص کند

۳- سرعت عمل زیاد که بررسی تعداد زیادی سلول را ممکن می‌سازد

۴- توانایی تشخیص سلول‌های نادر با مشخصات اختصاصی در یک جمعیت هتروژن و ناهمگن

۵- توانایی مطالعه سلول‌های زنده فیکس نشده

۶- توانایی اندازه‌گیری معیارهای همزمان چندین پارامتر و تطابق چند حساسیت هر سلول معلق در مایع

دستگاه‌های فلوسایتومتر از ۳ بخش اصلی تشکیل شده‌اند که شامل سیستم پدیدآورنده‌ی جریان (Fluidics System)، سیستم نوری (Optical System)  و سیستم الکترونیک و پردازش (Electronics Systems)  می‌باشد (۶).

 سیستم پدیدآورنده جریان

همان‌طور که در بالا به آن اشاره شد شرط اول در کار با این تکنیک سوسپانسیون بودن سلول‌های مورد بررسی می‌باشد. در کل سلول‌های موجودات مختلف یا به صورت فشرده در یک بافت قرار دارند (مانند اکثر بافت‌های بدن) و یا خود در محیطی سوسپانسیون قرار دارند (مانند خون). سلول‌های مورد بررسی اگر سلول‌های خونی باشند نیازی بهdigestion  هضم کردن آنها وجود ندارد. اما اگر به صورت بافت باشند ابتدا باید توسط آنزیم‌های مختلف و یا به صورت مکانیکی و یا حتی به هر دو صورت، بافت را هضم نمود تا بتوان از بافت فشرده شده، سوپ سلولی تهیه نمود. آنزیم‌های مختلفی جهت هضم بافت‌ها وجود دارد که بسته به نوع بافت، سختی و مواد تشکیل‌دهنده آن باید نوع مناسب انتخاب شود. البته شایان ذکر است این انتخاب نباید به گونه‌ای باشد که به خود سلول صدمه زده و سبب مرگ آن شود (۷).

 تمرکز هیدرودینامیک Hydrodinamic Focousing

خصوصیت اصلی یک سیستم فلوسایتومتری این است که اندازه‌گیری‌ها بر روی نمونه‌های سلولی که در دستگاه جریان می‌یابند، انجام می‌شود. اگر از یک لوله جهت انتقال نمونه استفاده شود، سلول‌ها نمی‌توانند به طور مکرر به نقطه اندازه‌گیری محل برخورد لیزر به سلول بروند. اگر از لوله‌های باریک جهت اطمینان از انتقال تکرارپذیر سلول‌ها استفاده شود، احتمال دارد با عبور سلول‌های بزرگ‌تر مسیر بسته شود. برای حل این مشکل از روش تمرکز هیدرودینامیک  Hydrodinamic Focousing کمک گرفته می‌شود. در این روش جریان آرامی از سلول‌ها را به درون جریان حامل سریع ( Sheath fluid) وارد می‌کنند. مایع حامل، سلول‌ها را در مرکز لوله متمرکز می‌کند، بنابراین سلول‌ها به طور منظم و در یک مسیر مجازی به نقطه اندازه‌گیری منتقل می‌شوند (۸،۹)

مروری بر روش فلوسایتومتری

شکل ۱- تمرکز هیدرودینامیک در دستگاه فلوسایتومتری نشان داده شده است.

هدف از آماده‌سازی نمونه، تهیه یک سوسپانسیون از پارتیکل‌های منفرد است که به روش خاصی رنگ‌آمیزی شده‌اند تا در سیستم، بدون ایجاد اختلال در جریان یکنواخت مایع سیال و یا انسداد لوله و منافذ دستگاه عبور کنند. درسیستم فلوسایتومتری، سلول‌های معلق در مایع ایزوتونیک از طریق سیستم حسی با فشار هوا از ظرف حاوی نمونه به لوله مخصـــــــوصی منتقل شده و به یک محفظه خاصی به نام حفره جریان Flow chamber وارد می‌شوند. مایع پوششی  Sheath fluidدر حفره نمونه، یک اثر تمرکز هیدرودینامیکی ایجاد کرده و نمونه را به داخل جریان می‌کشاند که زیادتر بودن سرعت جریان مایع پوششی نسبت به مایع حاوی نمونه، سبب هدایت سلول‌ها به صورت منفرد و تک‌تک جهت عبور از سوراخ انتهایی می‌شود تا در نقطه خاصی در مقابل اشعه لیزر قرار بگیرد.

سلول از لوله شیشه‌ای با سرعتی حدود ۵ تا ۵۰ متر در ثانیه از میان منفذی باریک و از مقابل پرتوی یک یا چند منبع نوری که غالباً لیزر است، عبور می‌کنند. بدین ترتیب امکان جمع‌آوری اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا ۵۰۰۰۰  سلول در هر ثانیه فراهم می‌شود (۱۰).

مروری بر روش فلوسایتومتری

شکل ۲- نحوه حرکت سلول‌ها به صورت تک‌تک و منفرد از مقابل نور لیزر نشان داده شده است.

بنابراین دو شرط اصلی برای نمونه‌هایی که قرار است با تکنیک فلوسایتومتری بررسی شوند وجود دارند:

۱- سوسپانسیون بودن

۲ – عبور تک‌تک از مقابل منبع نوری (۱۱).

سیستم نوری

دومین بخش از دستگاه فلوسایتومتری، سیستم نوری است. این سیستم دو بخش کلی دارد؛ یکی منبع تولید نور و دیگری آینه‌ها و فیلترهای هدایت‌کننده نور.

انواع مختلفی از منابع نوری برای فلوسایتومتر وجود دارند. در فلوسایتومترهای مدرن، نور لیزر به عنوان منبع نوری بکار می‌رود، لیزر نسبت به جیوه یا لامپ‌های دیگر مزایایی دارد که از آن جمله می‌توان به تولید نور منوکروم تک‌رنگ و با اندازه نقطه‌ای بسیار کوچک آن اشاره کرد، این اندازه نقطه‌ای بسیار مهم است، زیرا هرچه نور در فضای کوچک‌تری محدود شود، میزان تهییج سلول به حد ماکزیمم نزدیک‌تر می‌شود، علاوه بر این باعث اطمینان از قرار گرفتن تنها یک سلول در برابر نور در هر لحظه می‌گردد. بیشترین لیزر مصرفی نیز، لیزر آرگون با طول موج  ۴۸۸نانومتر می‌باشد که با هوا سرد می‌شود. لیزرهای دیودی نیز به دلیل پایداری مورد استفاده قرار می‌گیرند و معمولاً طول موج ۶۳۵ نانومتر آن مورد استفاده است (۱۲).

جزء دوم این بخش آینه‌هایی است که در دستگاه‌ها تعبیه شده‌اند. این آینه‌ها یا فیلترها نوع خاصی از آینه‌ها هستند که طول موج خاصی را از خود عبور داده و طول موج خاصی را منعکس می‌کنند. به این گونه فیلتر‌ها یا آینه‌ها، Dichroic mirror گفته می‌شود (۱۳). بسته به اینکه این آینه‌ها چه طول موج خاص را عبور و یا منعکس می‌کنند به سه دسته تقسیم‌بندی می‌شوند:

۱- فیلترهای Long Pass: این گونه فیلترها طیف نوری با طول موج‌های برابر یا بیشتر از مقدار مشخصی را از خود عبور می‌دهند و مابقی را منعکس می‌کنند. به عنوان مثال فیلترBP 500  طیف‌های نوری با طول موج‌های برابر یا بیشتر از ۵۰۰ نانومتر را از خود عبور می‌دهد و طول موج‌های کمتر از آن را منعکس می‌کند.

۲فیلترهای Short Pass: در این فیلترها طیف‌های نوری با طول موج‌های برابر یا کمتر از مقدار تعیین شده عبور می‌کنند و غیر از آن منعکس می‌شوند، برای مثال فیلترSP 500  طیف‌های نوری با طول موج‌های برابر یا کمتر از ۵۰۰ نانومتر را از خود عبور می‌دهد و طول‌موج‌های بیشتر را منعکس می‌کند.

۳- فیلترهای Band Pass: فیلترهایی هستند که محدوده مشخصی از طیف نوری را از خود عبور می‌دهند. برای مثال فیلترBP 500/50  طیف نوری بین ۴۷۵ تا ۵۲۵ نانومتر را عبور می‌دهد و غیر از آن را منعکس می‌کند .(۱۴)

مروری بر روش فلوسایتومتری

شکل ۳- فیلترهای نوری فقط طول موج خاصی را عبور داده و مانع عبور طول موج‌های دیگر می‌شوند. در این شکل نحوه عملکرد فیلترهای Long Pass ,Short Pass ,Band Pass نشان داده شده است

سیستم الکترونیک و پردازش

در این قسمت، سیگـــنال‌ها و ولتاژهای ایجاد شده‌ی حاصل از برخورد نور لیزر به سلول به داده‌های دیجیتالی تبدیل می‌شـــوند تا به وســــــــیله‌ی نرم افزار دستگاه قابل تجزیه و تحلیل باشند. سیگنال‌ها در سیستم‌های قدیمی به شکل آنالوگ ثبت می‌شـــــدند در حالی که امروزه یک مبدل آنالوگ به دیجیتال (Analogue to Digital Converter (ADC آنها را به داده‌های دیجیتالی تبدیل می‌کند، به این شکل که با توجه به کیفیت ثبت سیگنال در آشکارساز برای هر مقدار ولتاژ حجمی از داده کامپیوتری به صورت بایت(Byte)  درنظر می‌گیرد به این معنی که ولت به بایت تبدیل می‌شود.

این امر قابلیت بیشتر آنالیز سیگنال‌ها، تقویت و یا تضعیف آن‌ها را میسر می‌سازد. زمانی که یک سلول از مقابل منبع نوری عبور می‌کند بر روی تمام آشکارسازها سیگنال ایجاد می‌کند که همان پالس الکتریکی (ولتاژ) است. بر اساس این که چه میزان از ذره در مقابل منبع نوری قرار گیرد، پالس ایجاد شده می‌تواند ضعیف یا قوی باشد. چنانچه نمودار ولتاژ بر حسب زمان برای هر سلول رسم شود به صورت یک پالس خواهد بود که واجد یک پیک می‌باشد. هر پالس دارای ویژگی‌های ارتفاع(Height;H) ، پهنا (Width;W) و سطح زیر نمودار (Area;A) است (۱۵).

مروری بر روش فلوسایتومتری

                 شکل ۴- نمودار ولتاژ بر حسب زمان برای هر سلول به صورت یک پالس خواهد بود که واجد یک پیک می‌باشد. هر پالس دارای ویژگی‌های ارتفاع(Height;H) ، پهنا (Width;W) و سطــــــــح زیر نمودار (Area;A)  است.

 سرنوشت نور پس از برخورد به سلول‌ها

سلول‌ها پس از مکش توسط دستگاه در منطقه‌ای البته پس از تک‌تک شدن با لیزر روبرو می‌شوند. نتیجه برخورد نور لیزر به یک سلول،‌ پراکندگی نور در جهات مختلف است که گاهی با تغییر در طول موج نیز همراه است. در حقیقت زمانی که نور لیزر به ذره‌ای برخورد می‌کند، برخی از پرتوهای لیزر با همان طول موج از جوانب سلول گذشته و در زوایای ۲ تا ۱۰ درجه در مقابل سلول پراکنده می‌شوند که به آن پراکندگی جلویی (Forward Scatter, FSC) گفته می‌شود و در حقیقت بیانگر اندازه (Size) سلول است که می‌توان به وسیله‌ی آن اندازه‌ی سلول را مورد بررسی قرار داد. برخی از پرتوهای لیزر نیز به درون سلول وارد شده و به ساختارهای درونی سلول مثل گرانول‌ها، واکوئل‌ها، هسته و ساختارهای درون سلولی برخورد کرده و در زوایای ۱۰ تا ۹۰ درجه پراکنده می‌شوند.

این پراکندگی‌ها که نشان‌دهنده‌ی پیچیدگی‌های درون سلول هستند، پراکندگی جانبی(Side Scatter,SSC)  نام دارد و در حقیقت نشان‌دهنده میزان گرانولوسیتی سلول است. طول موج پراکندگی جانبی نیز برابر با طول موج تابیده به سلول است. به طور کلی هر ذره‌ای که از مقابل نور لیزر عبور می‌کند، دارای یک اندازه و گرانولیتی مشخص است که در نمودارهای فلوسایتومتری قابل ردیابی و نمایش می‌باشد؛ به طور مثال اگر سلول‌های خون محیطی انسان را در دستگاه فلوسایتومتری بررسی کنیم شاهد جمعیت‌های مختلف سلولی از جمله مونوسیت‌ها، گرانولوسیت‌ها و لنفوسیت‌ها خواهیم بود که بسته به اندازه و گرانولیتی‌شان در نمودار فلوسایتومتری قابل تمیز از هم هستند (۱).

شکل ۵- جمعیت‌های مختلف سلولی از جمله مونوسیت‌ها، گرانولوسیت‌ها و لنفوسیت که بسته به اندازه و گرانولیتی‌شان در نمودار فلوسایتومتری قابل تمیز از هم هستند

اما قابل ذکر است در اکثر موارد نمی‌توان سلول‌ها را بر حسب اندازه و گرانولیتی آنها با هم قیاس نمود زیرا بسیاری از آنها شبیه هم هستند و اندازه و گرانولیتی مشابه دارند، به راحتی نمی‌توان از روی سایز و اندازه و گرانولیتی یک سلول پی به ماهیت آن برد. یکی از مهم‌ترین کلیدها در رفع این مشکل استفاده از آنتی‌بادی و آنتی‌ژن و واکنش بین این دو با هم است به طوری که اگر ما بتوانیم برای شناسایی سلول موردنظر خود آنتی‌بادی اختصاصی علیه آنتی‌ژن را شناسایی و آن آنتی‌بادی را به رنگی یا فلوروکرومی متصل کنیم خواهیم توانست سلول مورد هدف را شناسایی کنیم، اما این دستگاه به چه شکل می‌تواند رنگ مورد استفاده را شناسایی کند؟

همان طور که می‌دانید هر مولکول در اطراف خود دارای الکترون‌هایی است که در اطراف هسته در حال گردش‌اند. حال اگر این الکترون‌ها توسط منبع نوری مانند لیزر برانگیخته شوند، از لایه اصلی خود خارج شده و به مدار بالاتر می‌روند. اما این الکترون‌ها تمایل به ماندن در لایه‌های بالاتر را نداشته و تمایل دارند به لایه خود حرکت کنند. این برگشت از یک لایه بالاتر به لایه پایین‌تر با از دست دادن انرژی همراه است. حال اگر این مولکول یک فلورکروم باشد بنابراین انرژی از دست رفته را به شکل نور نمایش خواهد داد (۱۶).

به هنگام آماده‌سازی سلول‌ها و اتصال رنگ‌های گوناگون فلورسنس به سلول،‌ پرتوهای تابیده شده پس از برخورد تغییر طول موج داده و در زوایای ۱۰ تا ۹۰ درجه پراکنده می‌شوند که آن را به عنوان پراکندگی‌های فلورسنس (Fluorescence Scatter) می‌شناسند. طول موج بازتابی در این نوع پراکنش با توجه به رنگ فلورسنس به کار رفته متغیر است. سپس طیف‌های نوری ایجادشده توسط فیلترها و آیینه‌ها به سمت آشکارسازها (Detector)  هدایت شده و سیگنال‌های ایجاد شده را ثبت می‌کنند. این فیلترها یا آشکارسازها که طول موج‌های مختلف فلورسنس را دریافت می‌کنند با توجه به تعدادشان شماره‌گذاری می‌شوند که معمولاً در بیشتر دستگاه‌های فلوسیتومتری پرتوهایی با طول موج ۵۲۰ تا ۵۷۰ (محدوده سبز =FL1 )، پرتوهایی با طول موج ۵۸۵ تا۶۲۰ (محدوده نارنجی =FL2)  و پرتوهایی با طول موج ۶۲۵ تا۷۶۰  (محدوده قرمز =FL3) را شامل می‌شوند (۱۷)

در داخل آشکارسازها پرتوها توسط گروهی از تقویت‌کننده‌ها، تقویت شده تا بتوانند به یک ولتاژ ساده الکتریکی مبدل شوند و سپس در قسمت الکترونیک به داده‌های دیجیتالی تبدیل شده و در انتها، توسط نرم‌افزارهای مخصوص قابل تجزیه و تحلیل می‌شوند. البته شایان ذکر است که برخی از پرتوها نیاز به تقویت‌کننده‌های قوی ندارند اما برخی نیاز به تقویت شدن مفصل دارند (۱۷).

 آنالیز اطلاعات

Gating

اطلاعات جمع‌آوری شده توسط فلوسیتومتر را می‌توان در بُعد واحدی و یا در دو بعد و یا حتی سه بعد برای تولید یک هیستوگرام رسم نمود. مناطقی از این هیستوگرام را می‌توان به صورت مرتب بر اساس شدت فلورسنت از هم جدا کرد. این کار با استفاده از “واحدهای استخراجی” انجام می‌گیرد که به آنها “گیت” می‌گویند. پروتکل‌های اختصاصی Gating برای شناسایی بیماری‌ها و همچنین اهداف کلینیک و آزمایشگاهی به خصوص در خون‌شناسی تعریف و ایجاد شده است. رسم‌ها معمولاً در مقیاس‌های لگارتیمی ساخته می‌شوند. از آنجا که طیف رنگ‌های فلورسنت با هم، همپوشانی دارند سیگنال‌ها در دتکتورها (آشکارسازها) باید از نظر الکتریکی و محاسباتی جدا شوند (۱۸). داده‌های گردآوری شده با فلوسیتومتری توسط نرم‌افزار‌های مختلفی مانند WinMD ، Flowjo، Cell quest Pro بررسی می‌شوند. بعد از اینکه داده‌ها جمع‌آوری شدند دیگر نیاز به اتصال دستگاه فلوسیتومتری نیست. به همین دلیل است که بررسی‌ها معمولاً در رایانه جداگانه‌ای انجام می‌گیرد (۱,۱۹).

جداسازی سلولی sorting

بیشترین مورد استفاده از فلوسایتومتری ارزیابی آنتی‌ژن‌های سطحی بیان‌شده بر روی سلول‌ها می‌باشد، اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌های مختلف برای اندازه‌گیری خصوصیات عملکردی بوسیله فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گیرند. می‌توان تغییرات زمانی بیان گیرنده‌ها را تعیین کرد یا برهمکنش یک نوع سلول را با سلول دیگر اندازه‌گیری نمود. بعلاوه، امکان ارزیابی تغییرات در فعالیت آنزیم‌ها و پتانسیل غشایی وجود دارد. همچنین می‌توان آزمایشاتی برای نشان دادن فاگوسیتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زیستی (bioactive) انجام داد (۲۰).

کارآیی اصلی این جداسازها، جدا کردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها برای مطالعه بیشتر می‌باشد. بطور کلی اگر سلول یا ذره‌ای دارای خصوصیات منحصر به فردی از نظر فیزیکی یا شیمیایی باشد با استفاده از آن خصوصیات می‌توان براحتی آن را شناسایی و توسط flow sorter از دیگر سلول‌های همراه جدا کرد (۲۱).

شکل ۶- جدا کردن جمعیت‌های سلولی دلخواه از میان جمعیتی هتروژن از سلول‌ها توسط دستگاه فلوسایتومتری نشان داده شده است.

 نتیجه‌گیری

روش فلوسیتومتری در سایه افزایش تعداد آنتی‌بادی‌ها، تترامرها و رنگ‌های تولید شده برای استفاده در ارزیابی فعالیت سلول‌ها به عنوان یک ابزار مهم در مطالعه سلول‌های سیستم ایمنی در آمده است و این امکان را فراهم آورده که انواع سلول‌های موجود در نمونه خون یا سلول‌های کشت شده به تفکیک مورد ارزیابی قرار بگیرند.

References:

  1. Shapiro HM. 2005. Practical flow cytometry: John Wiley & Sons
  2. Zharov VP, Galanzha EI, Shashkov EV, Kim J-W, Khlebtsov NG, Tuchin VV. 2007. Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo. Journal of biomedical optics 12: 051503–14
  3. Darzynkiewicz Z, Zhao H. 2014. Cell cycle analysis by flow cytometry. eLS
  4. Riccardi C, Nicoletti I. 2006. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nature protocols 1: 1458-61
  5. DOLEŽEL J, Bartoš J. 2005. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size. Annals of Botany 95: 99-110
  6. Givan AL. 2013. Flow cytometry: first principles: John Wiley & Sons
  7. Macey MG. 2007. Flow Cytometry: Springer
  8. Mao X, Lin S-CS, Dong C, Huang TJ. 2009. Single-layer planar on-chip flow cytometer using microfluidic drifting based three-dimensional (3D) hydrodynamic focusing. Lab on a Chip 9: 1583-9
  9. Mao X, Nawaz AA, Lin S-CS, Lapsley MI, Zhao Y, McCoy JP, El-Deiry WS, Huang TJ. 2012. An integrated, multiparametric flow cytometry chip using “microfluidic drifting” based three-dimensional hydrodynamic focusing. Biomicrofluidics 6: 024113
  10. Simonnet C, Groisman A. 2005. Two-dimensional hydrodynamic focusing in a simple microfluidic device. Applied Physics Letters 87: 114104
  11. Lee G-B, Chang C-C, Huang S-B, Yang R-J. 2006. The hydrodynamic focusing effect inside rectangular microchannels. Journal of Micromechanics and Microengineering 16: 1024
  12. Godin J, Chen C-H, Cho SH, Qiao W, Tsai F, Lo Y-H. 2008. Microfluidics and photonics for Bio-System-on-a-Chip: A review of advancements in technology towards a microfluidic flow cytometry chip. Journal of biophotonics 1: 355
  13. Perfetto SP, Ambrozak D, Nguyen R, Chattopadhyay P, Roederer M. 2006. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nature protocols 1: 1522-30
  14. Chen H-T, Wang Y-N. 2009. Optical microflow cytometer for particle counting, sizing and fluorescence detection. Microfluidics and nanofluidics 6: 529-37
  15. Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR. 2006. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature immunology 7: 681-5
  16. Robert S, Lacroix R, Poncelet P, Harhouri K, Bouriche T, Judicone C, Wischhusen J, Arnaud L, Dignat-George F. 2012. High-sensitivity flow cytometry provides access to standardized measurement of small-size microparticles—brief report. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 32: 1054-8
  17. Goddard G, Martin JC, Naivar M, Goodwin PM, Graves SW, Habbersett R, Nolan JP, Jett JH. 2006. Single particle high resolution spectral analysis flow cytometry. Cytometry Part A 69: 842-51
  18. Lo K, Brinkman RR, Gottardo R. 2008. Automated gating of flow cytometry data via robust model‐based clustering. Cytometry Part A 73: 321-32
  19. Krutzik PO, Nolan GP. 2006. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature methods 3: 361-8
  20. Ibrahim SF, van den Engh G. 2007. Flow cytometry and cell sorting. In Cell Separation, pp. 19-39: Springer
  21. Müller S, Nebe-von-Caron G. 2010. Functional single-cell analyses: flow cytometry and cell sorting of microbial populations and communities. FEMS microbiology reviews 34: 554-87

فن‌آوری فلوسایتومتری

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5939936/

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • الهام عبدالهی
  • دکتر احمد زواران حسینی
  • فتانه توسلیان
  • فلوسایتومتری

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *