مطالعه الگوی متیلاسیون پروموتر ژن‌های BCL-2 و BAX و سینرژیستی آن‌ها در مرگ فیزیولوژیک سلولی (آپوپتوزیس) بیماران مبتلا به سندرم بهجت در مقایسه با گروه کنترل سالم توسط تکنیک qMSP-PCR

مطالعه الگوی متیلاسیون پروموتر ژن‌های BCL-2 و BAX و سینرژیستی آن‌ها در مرگ فیزیولوژیک سلولی (آپوپتوزیس) بیماران مبتلا به سندرم بهجت در مقایسه با گروه کنترل سالم توسط تکنیک qMSP-PCR

مطالعه الگوی متیلاسیون پروموتر ژن‌های BCL-2 و BAX و سینرژیستی آن‌ها در مرگ فیزیولوژیک سلولی (آپوپتوزیس) بیماران مبتلا به سندرم بهجت در مقایسه با گروه کنترل سالم توسط تکنیک qMSP-PCR

شاهین اسعدی (کارشناس ارشد ژنتیک)

چکیده:

مقدمه: گروهی از ژن‌های القاکننده و مهارکننده سیگنالینگ که نقش کلیدی در مسیر فرآیند مرگ فیزیولوژیک سلولی (آپوپتوزیس) ایفا می‌کنند، ژن‌های BCL2 و BAX هستند. با توجه به اینکه تغییر متیلاسیون ژن‌ها می‌تواند بر روی بیان آن‌ها مؤثر واقع شود و همچنین از آنجا که این ژن‌ها از طریق مسیر سیگنالینگ JAK/STAT موجب اثرگذاری سایتوکاین‌های مختلف بر روی عملکرد سلول‌ها شده و به دنبال آن منجر به پاتوفیزیولوژی بیماری‌ها مخصوصاً بیماری‌های اتوایمیون می‌گردند که به‌طور مستقیم با میزان سایتوکاین‌های درگیر در ارتباط هستند و همچنین از آنجا که هنوز علت و پاتولوژی بیماری بهجت به‌طور کامل مشخص نشده است، بنابراین هدف از این مطالعه تعیین الگوی متیلاسیون ژن BCL2 و BAX در افراد مبتلا به بیماری بهجت و مقایسه آن با افراد گروه کنترل (سالم) می‌باشد.

روش کار: این مطالعه یک مطالعه موردی- شاهدی بوده که ۴۰ نفر بیمار مبتلا به بهجت و ۶۰ نفر گروه کنترل (سالم) در این مطالعه شرکت داشتند. از تمامی افراد مورد مطالعه نمونه خونی تهیه شد، سپس سلول‌های تک‌هسته‌ای (PBMCs) توسط روش فایکول (Ficoll) جدا شــده و پس از استخراج DNA با روش Salting out و بررسی آن با نانودراپ، متیلاسیون جایگاه‌های موردنظر توسط تکنیک qMS-PCR مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج: یافته‌های مربوط به میزان متیلاسیون و بیان ژن Bax نشان می‌دهد که میزان متیلاسیون در گروه بیمار نسبت به افراد گروه سالم افزایش نشان داده که این افزایش، معنی‌دار آماری بوده است (P-value<0.05)، همچنین نتایج مربوط به بیان ژن Bax مشخص کرد که میانگین بیان ژن در گروه بیمار نسبت به گروه سالم کاهش داشته که این کاهش از نظر آماری معنی‌دار بود (P-value<0.05)، در صورتی که میزان بیان ژن و متیلاسیون مربوط به ژن Bcl2 هیچ‌گونه تغییری را در دو گروه بیمار و سالم نشان نداد.

بحث و نتیجه گیری: با توجه به نتایج حاصل از این بیماری می‌توان حدس زد که شاید متیلاسیون DNA در شرایط خاصی از بیماری دخالت داشته باشد و منجر به تنظیم بیان ژن‌های دخیل، مانند ژن Bax در روند پاتوژنز بیماری گردد.

کلید واژه: متیلاسیون DNA، بیماری بهجت، ژن Bax، Bcl2، qMS-PCR

 

فصل اول:

مقدمه و بیان مسئله

بیماری بهجت با آفت‌های دهانی عودکننده، یوویتیس زخم‌های دهانی و آسیب‌های پوستی مشخص می‌شود. از آنجا که تظاهرات عروقی در این بیماری شایع است، آن را به‌عنوان واسکولیت در نظر می‌گیرند، با این حال علائم پاتولوژیک بافتی غالب در بافت‌های ملتهب شامل انفلتراسیون لنفوسیت‌ها، منوسیت‌ها و در بعضی موارد لکوسیت‌های چندهسته‌ای می‌شود. اگرچه عروق کوچک بدون تغییرات میکروسکوپی در دیواره مشخص می‌باشند، ترومبوفیلیا یا لخته‌شدگی در عروق کوچک و بزرگ معمول است، در حالی که آرتریت در این بیماری نادر است. در این رابطه، بیماری بهجت در مقایسه با سایر واسکولیت‌ها بی‌نظیر است. چون این بیماری شیوع بیشتری در کشورهای محدوده جاده ابریشم از ژاپن تا مناطق مدیترانه ای دارد، لذا ما را بر آن داشت تا این بیماری را در اولویت مطالعات خود قرار دهیم (۱).

پاسخ‌های سلول‌های T از نوع Th1/Th17 در بیماری بهجت دچار تنظیم افزایشی می‌شوند. اگرچه، مسیرهای سیگنالینگ با پاسخ‌های ایمنی منحرف رابطه دارند اما هنوز به‌طور کامل روشن نشده‌اند. هر دو نوع سلول T از نوع CD4+ و CD8+ در بافت‌های التهابی و خون محیطی بیماران مبتلا به بهجت، تولید سایتوکاین‌های التهابی شامل IL-2، IL-12 و اینترفرون گاما را افزایش می‌دهند (۲). سلول‌های Th-17 یک زیرمجموعه نسبتاً جدیدی از سلول‌های Th بوده که به‌طور عمده IL-17A، IL-17F، IL-22 و TNF-α را تولید می‌کنند (۳). مطالعات اخیر مشارکت IL-17 و پاسخ‌های سلول‌های Th17 را در پاتوژنز بیماری بهجت به اثبات رسانده است.

این بیماری، یک بیماری خودایمن است و امروزه، اطلاعاتی که نشان‌دهنده‌ی نقش عوامل ژنتیکی در پاتوژنز بیماری‌های خودایمن انسانی است، به‌سرعت در حال افزایش است. تعدادی از مطالعات، رابطه قــوی میان HLA-B51 با بیماری در نژادهای مختلف را نشان داده است. گروه Mizuki اخیراً نشان داده‌اند که مناطق بحرانی برای بیماری بهجت در انسان در مناطق MHC در محدوده ۴۶ کیلوبازی میان MHC کلاس I وابسته به ژن A (MIC-A) و ژن HLA-B نشان‌گذاری شده است (۴). همچنین در مطالعه‌ای که بر روی سلول‌های Tی γδ انجام شد، در این سلول‌ها مارکرهای فعال‌کننده این سلول‌ها مانند CD25، CD69 و CD29 افزایش بیان نشان داده و منجر به افزایش تولید سایتوکاین‌های التهابی IFN گاما و TNF آلفا می‌گردند. افزایش تولید IFN-γ در بیماری بهجت نشان داده شده است (۱)؛ بر این اساس، سلول‌های وابسته به Th1 محیطی، به‌طور قابل‌توجهی در بیماری فعال بهجت افزایش می‌یابند، علاوه بر این، مشخص شد که سطوح سرمی IL-12 ممکن است با سلول‌های محیطی Th1 و پیشرفت بیماری ارتباط داشته باشد، هرچند مکانیسم افزایش تولید IL-12 در بیماری بهجت هنوز ناشناخته مانده است. میزان IL-6 موجود در CSF، به‌عنوان یک مارکر فعالیت بیماری و یک پیامد درازمدت در گروه‌های هتروژن بیماران بهجتی با علائم عصبی مورد اهمیت قرار گرفته است، همچنین میزان IL-6 در این بیماران با علائم مزمن پیشرونده به‌طور برجسته‌ای افزایش می‌یابد (۵). بهجت فعال، سطوح سرمی بالای اینترلوکین‌های ۶، ۱۷، ۲۳ و سلول‌های Th17 را نشان می‌دهد (۶). روش‌های درمانی همچون اینترفرون آلفا و عوامل آنتی TNF-α که در بیماری بهجت با درگیری چشم مؤثر هستند، نشان داده‌اند که پاسخ‌های سلول‌های Th17 را مهار می‌کنند (۷, ۸).

سایتوکاین‌های مختلفی مانند اینترفرون‌ها، اینترلوکین‌ها و فاکتورهای تحریک‌کننده کلنی به خانواده بزرگ گیرنده‌های سایتوکاینی نوع I/II روی غشا متصل می‌شوند و از طریق دُمین‌های پروگزیمال غشایی JAK3 منجر به فسفریلاسیون آن‌ها می‌شوند (۹). اینترفرون گاما، GM-CSF، IL-2، IL-6، IL-12، IL-15، IL-17، IL-21، IL-22 و IL-23 از طریق ترکیبات مختلفی از JAK/STAT در سطح سلولی فعال می‌شوند و در پاتوژنز عفونت‌ها، بدخیمی‌ها و اختلالات خودایمنی/التهابی مانند آرتریت روماتوئید، IBD و پسوریازیس، درگیر هستند (۱۰). مسیرهای سیگنالینگ JAK/STAT برای فعال‌سازی سیستم ایمنی ذاتی بسیار اهمیت دارند، به‌طوری‌که سیگنال مربوط به اینترفرون گاما و اینترلوکین‌های ۲ و ۶ از طریق JAK1 به همراه JAK2 و JAK3 فعال می‌شود، در صورتی که اینترلوکین‌های ۱۲ و ۲۳ از طریق مسیر JAK2/Tyk2 فعال می‌شوند (۱۱). در مسیرهای پایین‌دست، STAT1 برای اینترلوکین ۲ و ۶ و اینترفرون گاما موردنیاز است درحالی‌که STAT3 با اینترلوکین‌های ۲، ۶، ۱۲ و ۲۳ در ارتباط می‌باشد. سایتوکاین ضدالتهابی اینترلوکین ۱۰ توسط مسیر JAK1/STAT3 با سیستم تنظیمی SOCS3 فعال می‌گردد (۹). همچنین STAT3 در ایجاد تعادل میان سلول‌های Th17 و Treg و تحریک تکثیر سلول‌های +CD4 بسیار اهمیت دارد. STAT3 با بسیاری از ژن‌ها در ارتباط است، مخصوصاً با اینترلوکین ۶ که در تمایز سلولی Th17، فعال‌سازی سلولی، تکثیر و بقا، تنظیم مُدیفیکاسیون اپی‌ژنتیک و بیان ژنی درگیر می‌باشد؛ بنابراین، STAT3 جنبه‌های بسیار مهم و حیاتی عملکرد سلول‌های T در التهاب و هوموستازی را سامان‌دهی می‌کند (۱۲). سایتوکاین‌های مرتبط با مسیر JAK/STAT و رده‌های سلولی Th نشان می‌دهند که در بیماری بهجت فعال می‌شوند. مشاهده شده است که اینترلوکین ۱۲ فعال شده و اینترفرون گامای ترشح‌شده از سلول‌های Th1 و اینترلوکین ۲۳ فعال‌شده در رده سلولی Th17 در خون محیطی و بافت‌های بیماران بهجت افزایش یافته‌اند (۱۳).

همانطور که ذکر شد، گروهی از ژن‌های القاکننده و مهارکننده سیگنالینگ که نقش کلیدی در مسیر فرآیند مرگ فیزیولوژیک سلولی (آپوپتوزیس) بازی می‌کنند، ژن‌های BCL2 و BAX هستند. این پروتئین‌ها در فیدبک منفی، به‌عنوان مهارکننده مسیر سیگنالینگ JAK/STAT عمل می‌کنند و به‌عنوان فعال‌کننده این مسیر (JAK/STAT) به‌منظور تعدیل در پاسخ‌های سلولی عمل می‌کنند (۱۴). نسبت عوامل القا‌کننده و مهارکننده و توازن بین آن‌ها تعیین‌کننده‌ی مسیر آپوپتوز یا بقای سلول زنده است. در میان ژن‌های درگیر در فرآیند آپوپتوز، ژن‌های اعضای خانواده BCL-2 نقش مهمی در تنظیم آپوپتوز دارند. BCL-2 یک ژن آنتی‌آپوپتوزی می‌باشد که بقای سلول را پیش می‌برد، در حالی که BAX یک ژن پروآپوپتوزی می‌باشد که منجر به پیشبرد مرگ فیزیولوژیک سلولی می‌گردد. در صورت کاهش میزان بیان ژن مربوط به پروتئین Bcl-2، فرآیند مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول یا آپوپتوزی به‌واسطه فعال شدن سایر اونکوژن‌ها از قبیل p53 شروع می‌شود. با در نظر گرفتن نقش کاسپاز‌ها در سلول‌های مختلف، مطالعات نشان داده‌اند که Bcl-2 به‌واسطه مهار سنتز و تولید کاسپازها نیز می‌تواند فرآیند آپوپتوز را مهار نماید. به‌طور اختصاصی‌تر، پروتئین‌های Bcl-2 موجود در دیواره میتوکندری‌ها بواسطه‌ی جلوگیری از رها شدن سیتوکروم C و یا با اتصال به Apaf-1 مانع از تشکیل آپوپتوزوم و به راه افتادن آبشار کاسپازی می‌شوند (۱۴).

علی‌رغم اینکه وجود سایتوکاین‌های پیش‌التهابی و مرتبط با سلول‌های Th1/Th17 در پاتوژنز بیماری بهجت به اثبات رسیده شده است، اما هنوز علت و پاتولوژی بیماری بهجت در مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی به‌طور کامل مشخص نشده است. با این حال، تحقیقات اخیر پیشرفت‌های قابل‌توجهی را نشان می‌دهند. از آنجا که بیماری‌های روماتولوژیک از جمله بیماری‌هایی هستند که علاوه بر ژنتیک، با عوامل محیطی مانند نژاد نیز در ارتباط هستند و همچنین بخاطر اینکه فرآیندهای اپی‌ژنتیکی تحت تأثیر عوامل محیطی بر روی بیان ژن‌ها مؤثر هستند، ما را بر آن داشت که مطالعه‌ای بر تأثیر بیان یک سری از ژن‌های مؤثر در این بیماری در بیماران مراجعه‌کننده به بیمارستان امام رضا (ع) در شهر تبریز انجام دهیم.

 

تعریف واژه‌های اختصاصی:

بیماری بهجت: از جمله بیماری‌های روماتولوژیک می‌باشد که با آفت‌های عودکننده دهانی، زخم‌های چشم، زخم‌های تناسلی و ضایعات پوستی مشخص می‌گردد.

qMS-PCR: این تکنیک جزء شایع‌ترین تکنیک‌های مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل متیلاسیون DNAی تغییریافته با بی‌سولفیت می‌باشد. PCR خاص متیلاسیون (qMS-PCR) متکی به آمپلیفیکاسیون برای ارزیابی وضعیت متیلاسیون در جایگاه‌های CpG خاص می‌باشد.

BAX و BCL2: گروهی از ژن‌های القاکننده و مهارکننده سیگنالینگ که نقش کلیدی در مسیر فرآیند مرگ فیزیولوژیک سلولی (آپوپتوزیس) بازی می‌کنند، ژن‌های BCL2 و BAX هستند.

 

الف) هدف کلی طرح:

مطالعه الگوی متیلاسیون پروموتر ژن‌های BCL2 و BAX در بیماران مبتلا به سندرم بهجت در مقایسه با کنترل‌های سالم توسط تکنیک qMSP-PCR.

 

ب) اهداف اختصاصی طرح:

هدف اختصاصی اول: تعیین میزان متیلاسیون ژن BCL2 در بیماران بهجت و مقایسه آن‌ها با افراد سالم با استفاده از تکنیک qMS- PCR

هدف اختصاصی دوم: تعیین میزان بیان ژن BCL2 در بیماران بهجت و مقایسه آن‌ها با افراد سالم با استفاده از تکنیک Real- time PCR

هدف اختصاصی سوم: تعیین میزان متیلاسیون ژن BAX در بیماران بهجت و مقایسه آن‌ها با افراد سالم با استفاده از تکنیک qMS- PCR

هدف اختصاصی چهارم: تعیین میزان بیان ژن BAX در بیماران بهجت و مقایسه آن‌ها با افراد سالم با استفاده از تکنیک Real- time PCR

 

ج) فرضیات طرح:‌

فرضیه اول: میزان متیلاسیون جایگاه پروموتری ژن BCL2 در بیماران بهجتی نسبت به افراد سالم تغییر می‌یابد.

فرضیه دوم: بیان نسبی ژن BCL2 در بیماران بهجتی نسبت به افراد سالم تغییر یافت.

فرضیه سوم: میزان متیلاسیون جایگاه پروموتری ژن BAX در بیماران بهجتی نسبت به افراد سالم تغییر می‌یابد.

فرضیه چهارم: بیان نسبی ژن BAX در بیماران بهجتی نسبت به افراد سالم تغییر یافت.

 

فصل دوم:

کلیات و بررسی متون

 

کلیات بیماری بهجت:

این بیماری یک نوع التهاب رگ‌ها می‌باشد که در ایجاد مشکلات بینایی از جمله کوری و ایجاد ضایعات پوستی در دهان، پستان و یا اندام تناسلی نقش دارد. ضایعات پوستی به شکل آفت‌های دردناک دیده می‌شوند، از طرفی مشکلات ریه، روده و یا درد ماهیچه‌ها کمیاب بوده ولی ممکن است دیده شوند. درمان با استفاده از استروئیدها و یا داروهای ایمنی می‌باشد. نام این بیماری از نام حلوسی بهجت، پزشک پوست اهل ترکیه گرفته شده است که نخستین بار این بیماری را توصیف کرد (۱۵).

این بیماری یکی از بزرگ‌ترین و شایع‌ترین بیماری‌های خودایمنی در جهان محسوب شده که بیشتر در کشورهای اطراف جاده ابریشم دیده می‌شود. هر چه از جاده ابریشم دور شویم شیوع این بیماری کاهش می‌یابد، به‌طوری که در نیمکره جنوبی این بیماری بسیار نادر است. این بیماری بیشتر در نژاد زردپوست و ترک‌تباران زردپوست دیده می‌شود. بر اساس آخرین مطالعات، شیوع آن در ایران ٨٠ بیمار در هر صد هزار نفر جمعیت می‌باشد. بیماری بهجت در هر دو جنس به نسبت مساوی دیده شده اما در مردان شدیدتر از زنان ظاهر می‌گردد (۱۶).

از آنجا که تظاهرات عروقی در بیماری بهجت شایع است، آن را به‌عنوان واسکولیت در نظر می‌گیرند. با این حال، علائم پاتولوژیک بافتی غالب در بافت‌های ملتهب شامل ترشح لنفوسیت‌ها، منوسیت‌ها و در بعضی موارد لکوسیت‌های چندهسته‌ای می‌باشد. ترومبوفیلیا یا لخته‌شدگی در عروق کوچک و بزرگ معمول می‌باشد، در حالی که آرتریت در این بیماری نادر است. در این رابطه، بیماری بهجت در مقایسه با سایر واسکولیت‌ها منحصر به فرد می‌باشد. این بیماری تمام دستگاه‌های بدن از جمله مفاصل، پوست و مخاط، چشم، قلب، شش، دستگاه گوارش، مغز و اعصاب و سیستم خونی را تحت تأثیر قرار می‌دهد. ابتلا به این بیماری از بیماری لوپوس بیشتر بوده و این بیماری در مردان نسبت به زنان پیش‌آگهی  شدیدتری دارد (۱۷).

به نظر می‌رسد که این بیماری در نتیجه‌ی تعامل بین حساسیت ژنتیکی و فاکتورهای محیطی مختلف که آغازگر خود ایمنی در افراد مستعد از نظر ژنتیکی هستند، به وجود می‌آید (۱۸). این بیماری، یک بیماری خودایمن است و امروزه، اطلاعاتی که نشان‌دهنده‌ی نقش عوامل ژنتیکی در پاتوژنز بیماری‌های خودایمن انسانی باشد، به‌سرعت در حال افزایش است (۱۹). بر این اساس، سلول‌های وابسته به Th1 محیطی به‌طور قابل‌توجهی در بیماری فعال بهجت افزایش می‌یابد، علاوه بر این، مشخص شد که سطوح سرمی IL-12 ممکن است با سلول‌های محیطی Th1 و پیشرفت بیماری ارتباط داشته باشد، هرچند مکانیسم افزایش تولید IL-12 در بیماری بهجت هنوز ناشناخته است. میزان IL-6 موجود در CSF[1]، به‌عنوان یک مارکر فعالیت بیماری و یک پیامد درازمدت در گروه‌های هتروژن بیماران بهجتی با علائم عصبی اهمیت داده شده است، همچنین میزان IL-6 در این بیماران با علائم مزمن پیشرونده به‌طور برجسته‌ای افزایش می‌یابد. (۵).

 

۲-۱ مشخصات کلی بیماری بهجت و تاریخچه:

بهجت یک بیماری مولتی‌سیستمیک است که برای اولین بار در سال ۱۹۳۷ توسط پروفسور Hulusi Behcet درماتولوژیست اهل ترکیه معرفی شد. بهجت این بیماری را با سه علامت جراحات عودکننده دهان، جراحات عودکننده دستگاه تناسلی و Iritis که می‌تواند منجر به کوری شود، مشخص کرد و نـــــــــــــــــام Triple system complex را بر آن نهاد، ولی بعدها با اضافه شدن نشانه‌ها و علائم دیگری به بیماری، نام خود او برای این بیماری برگزیده شد. البته پیش از او Adamantiada از بلغارستان در سال ۱۹۲۴ گزارش‌های مشابهی ارائه داده بود.

 

اپیدمیولوژی بیماری بهجت:

این بیماری شیوع بیشتری در کشورهای محدوده جاده ابریشم که به‌عنوان جاده قدیمی و باستانی میان مدیترانه و آسیای شرقی واقع است، دارد (۲۰). ترکیه کشوری که بیشترین میزان بروز این بیماری را داراست، شیوعی در حدود ۱۱۰ تا ۴۲۰ به ازای هر ۱۰۰،۰۰۰ نفر را دارد (جدول ۲-۱)، (۲۱)، در حالی که ژاپـــن شیوعی در حدود ۲۲-۱۳ نفر به ازای هر صد هزار نفر را دارا می‌باشد و شیوع این بیماری در کشورهایی مثل انگلستان و ایالات متحده در حدود ۲-۱ نفر به ازای هر صد هزار نفر می‌باشد (۲۲). شیوع این بیماری هنوز در میان سرخ‌پوستان ناشناخته می‌باشد و فقط به‌صورت هرچند وقت یک‌بار در میان افرادی با اصالت آفریقایی گزارش می‌شود (شکل ۲-۱) (۲۳).

 سندرم بهجت

شکل ۲-۱: شماتیکی از فرکانس شیوع بیماری بهجت در جهان

 

بیماری بهجت معمولاً در بزرگسالان مشاهده می‌شود و در میان کودکان بسیار نادر می‌باشد. در جمعیت مدیترانه خاور، این بیماری بیشتر در میان مردها رایج است (۲۴). در جمعیت آسیایی، نسبت ابتلای مربوط به جنسیت، برعکس است؛ یعنی اینکه بیماری در میان زنان رایج‌تر است (۲۵). در میان  سفیدپوستان بیماری خانوادگی غیرمعمول بوده اما در افراد غیرسفیدپوست در حدود ۱۲ درصد رابطه خانوادگی مثبت می‌باشد (۲۶) و رابطه هم‌نژادی در مطالعات ترکیه در حدود ۱۱/۴ تا ۵۲/۵ گزارش شده است. این یافته‌ها پیشنهاد می‌کند که یک جزء ژنتیکی همانند بیماری‌های ژنتیکی پیچیده‌ای مانند بیماری التهاب روده در این بیماری نیز مشاهده می‌شود.

 

جدول ۲-۱: فرکانس شیوع بیماری بهجت در کشورهای مختلف

 سندرم بهجت

۲-۲ اتیوپاتولوژی بیماری بهجت:

هنوز اتیوپاتولوژی دقیق بیماری بهجت روشن نشده است، با این حال بیشتر مطالعات نشان می‌دهند که این بیماری توسط فاکتورهای محیطی مانند عوامل عفونت‌زا یا آلودگی، در بیماران با سابقه استعداد ژنتیکی شروع می‌شود (۲۷).

تعدادی از مطالعات، رابطه قوی میان HLA[2]-B51 با بیماری در نژادهای مختلف را نشان داده است. این قسمت مورد بحث قرار گرفته شده است که علیرغم عدم تعادل پیوستگی با ژن‌های همجوار در بیماران بهجت، این نسبت در مورد ژن‌های HLA-B51 در حدود ۶۰% می‌باشد (۲۸). گروه Mizuki اخیراً نشان داده‌اند که مناطق بحرانی برای بیماری بهجت در انسان در مناطق MHC[3] در محدوده ۴۶ کیلوبازی میان MHC کلاس I وابسته به ژن A (MIC-A) و ژن HLA-B نشان‌گذاری شده است (۲۹). MIC-A یک عضو بسیار پلی‌مورفیک از MHC کلاس I با بیش از بیست آلل برحسب تنوع آمینواسیدی در دومن‌های آلفا یک (α۱)، آلفا دو (α۲) و آلفا سه (α۳) می‌باشد (۴). MIC-A یک گلیکوپروتئین سطحی بیان می‌کند که با میکروگلوبولین دو در ارتباط نیست و فاقد جایگاه CD8 بوده که در آن ساختار پایدار مستقل از لیگاندهای پپتیدی نوع I معمول می‌باشد (۴). MIC-A در سلول‌های متنوعی بیان می‌شود و بیان آن به‌وسیله پروموتر اجزای شوک حرارتی شبیه با ژن‌های hsp70 تنظیم می‌شود (۴). طبقه‌بندی و آنالیز پیوستگی میــــان MIC-A009 و HLA-B51 مشخص کرده است که ژن‌های مستعد بیماری بهجـــــت خود آلل‌های HLA-B51 می‌باشند، علاوه بر آن مشخص شده است که MIC-A009 به‌طور قوی با HLA-B51 و همچنین  HLA-B52در ارتباط است که در بیماری بهجت افزایش نیافته است (۴)، بنابراین نتیجه می‌شود که افزایش قابل‌توجه آلل MIC-A009 در بیماران ژاپنی از عدم تعادل پیوستگی قوی با آلل HLA-B51 ناشی می‌شود.

 

 سندرم بهجت

 

شکل ۲-۲: شماتیکی از عوامل ژنتیکی و محیطی مؤثر در ایجاد بیماری بهجت

 

عوامل عفونی مخصوصاً ویروس هرپس سیمپلکس (HSV) و استرپتوکوکوس سانجیوس (S.sanguis) به‌عنوان راه‌اندازهای محیطی برای بیماری بهجت به اثبات رسیده‌اند. بیماران با بیماری بهجت مقادیـــــــــر بالایی از S.sanguis در فلور دهانی خودشان نسبت به افراد سالم کنترل یا بیماران سایر بیماری‌ها نشان می‌دهند، همچنین بیماران بهجتی واکنش‌های حساسیت‌زای پوستی به‌تعویق‌افتاده را نشان می‌دهند و علاوه بر این زخم‌های آفت دهانی در مقابل آنتی‌ژن‌های استرپتوکوکی، پس از تزریق پوستی یا آزمون خراش توسط آنتی‌ژن‌های استرپتوکوکی را نشان می‌دهند (۳۰).

 

۲-۳ ایمونوپاتوژنز بیماری بهجت:

واکنش پاترژی یکی از ویژگی‌های منحصر به فرد از بیماری بهجت است و ممکن است با پاتوژنز بیماری رابطه بسیار نزدیکی داشته باشد. مشخص شده است که واکنش زودتر از ۴ ساعت پاترژی به‌وسیله نوتروفیل‌ها و لنفوسیت‌ها بدون واسکولیت، با تجمع نوتروفیل‌ها در جایگاه‌های نقطه مانند میانجیگری می‌شود (۳۱). پوست در عرض ۴۸ ساعت در برابر واکنش پاترژی عمدتاً توسط سلول‌های تک‌هسته مخصوصاً از لنفوسیت‌های T و ماکروفاژها و منوسیت‌ها ایجاد می‌شود، درحالی‌که نوتروفیل‌ها کمتر از ۵% سلول‌های انفیلتره را به خود اختصاص داده‌اند (۳۲). این حالت پیشنهادکننده این است که هایپرکموتاکسی نوتروفیل‌ها ممکن است در راه‌اندازی واکنش نقش بازی کند، در حالی که لنفوسیت‌های T فعال‌شده برای گسترش واکنش پاترژی موردنیاز هستند.

اثر درمانی سیکلوسپورین A در یووئیت (التهاب چشم) بیماری بهجت، قویاً درگیری سلول‌های T فعال در پاتوژنز بیماری را پیشنهاد می‌کند (۳۳). برعکس نقش نژادهای خاص استرپتوکوکوس به‌عنوان فاکتور اتیولوژی بیماری مورد توجه می‌باشد. بیماران بهجتی بروز بالایی از تونسیلیتیس (التهاب لوزه) و پوسیدگی دندان دارند. علائم سیستمیک بیماری بهجت می‌تواند پس از درمان پوسیدگی دندان یا پس از تزریقات داخل پوستی آنتی‌ژن‌های استرپتوکوکی بروز کنند (۳۴).

آنتی‌ژن KTH-1 وابسته به استرپتوکوکوس سانژیوس تولید invitroی اینترلوکین ۶ کرده و اینترفرون گاما توسط سلول‌های T در بیماران بهجتی را تحریک می‌کند. هرچند، آنتی‌ژن‌های مشــــتق از اشرشیاکلی تولید invitroی اینترفرون گاما توسط سلول‌های T بیماران را تشدید می‌کنند (۳۵).

فرض می‌شود که سلول‌های T در بیماری بهجت دارای حساسیت فوق‌العاده به انواع آنتی‌ژن است. در این راستا نشان داده شده است که سلول‌های T بیماران بهجت تحت تأثیر غلظت‌های پائین انتروتوکسین B و SEC1 استافیلوکوکوس برای تولید اینترفرون گاما تحریک می‌شوند که این‌ها قادر نیستند سلول‌های T را در افراد نرمال یا بیماران کنترل (آرتریت روماتوئید) تحریک کنند. از آنجا که تفاوت معنی‌داری بین سلول‌های T بیماری بهجت و سلول‌های Tی کنترل در تولید IFN-γ مستقل از منوسیت و یا وابسته به منوسیت که با غلظت پایین و یا بالا از آنتی CD3 تحریک شده، وجود ندارد، پیشنهاد شده است که اختلال در انتقال سیگنال به‌وسیله اختلال در گیرنده‌های سلول T راه‌اندازی می‌شود. اختلال گیرنده‌های سلول T ممکن است نقش مهمی در پاتوژنز بیماری بهجت بازی کند (۳۵, ۳۶).

به نظر می‌رسد که این بیماری در نتیجه‌ی تعامل بین حساسیت ژنتیکی و فاکتورهای محیطی مختلف که پروسه خودایمنی را در افراد به لحاظ ژنتیکی مستعد، به راه می‌اندازند، به وجود می‌آید (۱۸). این بیماری، یک بیماری خودایمن است و امروزه، اطلاعاتی که نشان‌دهنده‌ی نقش عوامل ژنتیکی در پاتوژنز بیماری‌های خودایمن انسانی است، به‌سرعت در حال افزایش است (۱۹). بیماران مبتلا به این بیماری، دارای سطوح بالایی از سایتوکاین‌های پیش‌التهابی مانند IL1، IL2، IL6، TNFα، IL12، IL17، IL-18 و IL-23R هستند (۳۹-۳۷).

افزایش تولید IFNγ در بیماری بهجت نشان داده شده است. بر این اساس، سلول‌های وابسته به Th1 محیطی به‌طور قابل‌توجهی در بیماری فعال بهجت افزایش یافت (۴۰). علاوه بر این، مشخص شد که سطوح سرمی IL12 با میزان سلول‌های محیطی Th1 و پیشرفت بیماری ارتباط دارد، هرچند مکانیسم افزایش تولید IL12 در بیماری بهجت هنوز ناشناخته مانده است. Frassanito و همکارانش فرض کردند که بیماری فعال بهجت ممکن است یک بیماری مربوط به سلول‌های پردازش‌کننده آنتی‌ژن باشد و سلول‌های T ممکن است از لحظه‌ای که برجستگی IL-12 در پاتوژنز بیماری ظاهر می‌شود، به‌عنوان ناظران بی‌ضرر باشند (۴۰). باید تأکید کرد که حساسیت بالای سلول‌های T که منجر به فعال شدن سلول T می‌شود، ممکن است برای فعال‌سازی سلول‌های پردازش‌کننده آنتی‌ژن از طریق واکنش با CD40-CD154 که باعث تولید IL-12 می‌شوند، به‌شمار آید. علاوه بر این، منوسیت‌های بیماری بهجت نمی‌توانند در حساسیت بالای سلول‌های Tی گروه کنترل نسبت به آنتی‌ژن‌های متنوع ایجاد شده باشند (۳۶, ۴۰)، بدین صورت این نتیجه‌گیری که انحراف به پاسخ‌های وابسته به TH1 در بیماری بهجت از اختلالات سلول‌های پردازش‌کننده آنتی‌ژنی ناشی می‌شود، می‌تواند گمراه‌کننده باشد (شکل ۲-۳)

 سندرم بهجت

شکل ۲-۳: شماتیکی از مسیر پردازش آنتی‌ژن و اثرگذاری سایتوکاین‌های مختلف در این مسیر

 

اخیراً نشان داده شده است که بیماری فعال بهجت دارای تعداد زیادی سلول‌های CD4 + T حاوی IFN گاما و لیگاند CD40 که خاص سلول‌های وابسته به Th1 هستند، می‌باشند. توجه داشته باشید، اهمیت IL17 در سرم بیماری بهجت نشان داده شده است (۴۱). در مقابل، تولید IL8، سایتوکاینی که نوتروفیل را فعال می‌کند، به‌وسیله سلول‌های T در بیماری بهجت تشدید یافته است (۴۲). لازم به ذکر است که بیان IL17 تقریباً به‌طور انحصاری در سلول‌های Tی +CD8 و +CD4 فعال‌شده، تشخیص داده شده است. از همه مهم‌تر، نشان داده شده است که IL-17 به‌صورت انتخابی نوتروفیل‌ها را به جایگاه التهاب جذب می‌کنند (۴۳). این نتایج پیشنهاد می‌کنند که اختلال در پاسخ‌های سلول T در واکنش‌پذیری بیش از حد نوتروفیل‌ها در بیماری بهجت از طریق تولید متنوعی از سایتوکاین‌ها شامل اینترلوکین‌های ۱۰، ۶، ۱، ۱۲، ۸ و ۱۷ نتیجه می‌شود. این نتیجه قویاً پیشنهاد می‌کند که ممکن است فعال‌سازی نوتروفیل‌ها، پیامد حساسیت بیش از حد سلول‌های T در بیماری بهجت باشد (۳۸).

حساسیت بیش از حد سلول‌های T به آنتی‌ژن‌های چندشکلی، نقش مهمی در این پاتوژنز بازی می‌کند. فعال‌سازی منوسیت‌ها متعاقب فعال‌سازی سلول‌های T از طریق واکنش‌های CD40-CD154 همانند خیلی از سایتوکاین‌های مشتق از سلول T مانند اینترفرون گاما و TNF آلفا ممکن است در تولید IL-12 نتیجه شود که باعث شیفت به پاسخ‌های TH1 گردد. در نتیجه فعال‌سازی سلول‌های Tی غیرطبیعی، ممکـن است توسط سایتوکاین‌ها مثل IL-8، IL-17، γ-IFN و TNF-α فعال‌سازی نوتروفیل‌ها راه‌اندازی شده باشد (۳۸). در حالی که نقش مولکول‌های تحریکی به‌طور کامل در بیماری بهجت کشف نشده است، حضور آنتی‌بادی ضد CTLA-4[4] در کسری از بیماران مبتلا به بیماری بهجت گزارش شده است (۴۴). اگرچه حضور این آنتی‌بادی ممکن است در پاسخ‌های سلول Tی غیرطبیعی درگیر باشد، آنتی‌بادی ممکن است تنها به‌عنوان یک پدیده ثانویه فعال‌سازی سلول T به‌طور مکرر در بیماری بهجت تولید  ‌شود.

 

ژن‌های BCL2 و BAX:

مرگ سلولی مرحله نهایی آسیب سلول است. در صورت تداوم آسیب به سلول، آسیب غیرقابل برگشت می‌شود (۴۵). آپوپتوز یک فرآیند بیوشیمیایی هماهنگ است که به مرگ سلول منتهی می‌گردد و به سه نوع آپوپتوز، شبه‌آپوپتوز و شبه‌نکروز تقسیم می‌شود. مهم‌ترین حالت مرگ برنامه‌ریزی‌شده، حالت آپوپتوز است که نقش کلیدی را در تکامل، سیستم ایمنی و زندگی طبیعی موجودات پرسلولی بازی می‌کند (۴۶). آپوپتوز یک نوع مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی است. مسیرهای درگیر در تحریک فرآیند آپوپتوز را به دو دسته کلی تقسیم می‌کنند: مسیر بیرونی یا رسپتورهای مرگ، مسیر درونی یا مسیر میتوکندریایی (۴۷). مسیر درونی توسط اعضای خانواده‌ی bcl-2 کنترل می‌شود و با فعال‌سازی bak/bax منجر به نفوذپذیری غشای میتوکندری و آزاد شدن سیتوکروم C می‌گردد (۴۸, ۴۹).

پروتئین‌های خانواده B-cell lymphoma 2 (Bcl-2): مولکول Bcl2 ابتدا به‌عنوان پروتوانکوژن در لنفومای فولیکولار سلول‌های B شناسایی شد، سپس این مولکول به‌عنــوان همولوگ یکی از اعضای اصلی آپوپتوز در C-elegance معرفی گردید. Bcl2 در پستانداران شناسایی شده است. این خانواده چهار موتیف حفاظت‌شده به‌صورت BH1-BH2-BH3-BH4 دارد که با توجه به فعالیت و ساختار به سه دســــته تقسیم شده‌اند (۵۰, ۵۱):

الف- اعضای ضد آپوپتوز که شامل حداقل دو موتیف حفاظت‌شده هستند و شامل Bcl2 و Bcl-XL هستند.

ب- اعضای پروآپوپتوز که شامل چهار دسته حفاظت‌شده هستند و شامل Bax و Bak و غیره هستند.

ج- شامل Bik، Bin و Bad می‌باشند. این گروه تنها دارای موتیف حفاظت‌شده BH3 بوده و این ناحیه برای القای خاصیت کشندگی کافی و ضروری است (۵۰, ۵۱).

میتوکندری به‌عنوان یکی از اصلی‌ترین اندامک‌های فعال در مسیر مرگ سلولی شناخته شده است. این اندامک با رهایی مولکول‌های فعال‌کننده مکانیسم خودکشی سلولی به‌صورت مستقیم و یا غیرمستقیم در این فرآیند شرکت می‌کند. برخی انکوپروتئین‌ها مانند محصولات ژن‌های مهارکننده تومور، عوامل عفونت‌زای ویروسی و عوامل دارویی می‌توانند از طریق تأثیر مستقیم بر روی میتوکندری، آپوپتوز را فعال کنند. این پدیده به بیماری‌های مختلفی نظیر سرطان، تخریب عصبی و ایدز منجر می‌شود. آبشار کاسپازی با رهایی سیتوکروم C از میتوکندری کامل می‌شود. مولکول‌های خانواده Bcl2 این مرحله را کنترل می‌کنند (۵۲, ۵۳).

سایر اعضای این خانواده فعالیت Bak و Bax را القا می‌کنند و سبب القای نفوذپذیری غشای میتوکندریایی و خروج سیتوکروم C از میتوکندری می‌شوند. محل استقرار Bak و Bax قبل از ارسال پیام مرگ متفاوت است. Bak به غشای رتیکولوآندوپلاسمی متصل است، درحالی‌که Bax به‌صورت منومر در سیتوزول حضور دارد. پیام آپوپتوز، آن‌ها را روی غشای میتوکندری به هم نزدیک می‌کند و با هموالیگومریزه کردن آن‌ها با هم، منافذی در سطح غشای میتوکندری ایجاد می‌کند که از طریق آن‌ها خروج سیتوکروم C، آندونوکلئاز G، AIF و Smac اتفاق می‌افتد (۵۲, ۵۴).

 

۲-۴ متیلاسیون DNA و بیماری‌های انسانی:

امروزه اپی‌ژنتیک به‌عنوان یک مکانیسم مهم در اتیولوژی بیشتر بیماری‌ها مورد توجه واقع شده است. طی دهه‌های گذشته، مطالعات اپی‌ژنتیکی بیشتر روی تکوین جنین، پیری و سرطان فوکوس شده است؛ اما اخیراً، اپی‌ژنتیک در خیلی از زمینه‌های دیگر همچون التهاب، بیماری‌های ایمنی، چاقی، مقاومت انسولین، تیپ دو دیابت ملیتوس، بیماری‌های قلبی و بیماری‌های نورودژنراتیو تمرکز کرده است. این‌ها ناشی از تغییرات اپی‌ژنتیکی به‌وسیله فاکتورهای داخلی و خارجی و توانایی آن‌ها در تغییر بیان ژن می‌باشد. سلول‌های یک ارگانیسم می‌توانند به توده‌های ناهمسان انواع سلول‌ها تمایز یابند، ولو اینکه دارای توالی یکسان DNA در سلول باشند. این فرآیندهای تمایز در همان اوایل تکوین معین می‌شوند و هرکدام از انواع سلول‌های بدست آمده یک پروفایل اپی‌ژنتیکی منحصر به فرد در طی فرآیندهای تمایز سلول‌های پروژنیتور پلوروپوتنت به سلول‌ها و بافت‌های تمایزیافته کامل بدست می‌آورند (۵۵). پروفایل اپی‌ژنتیکی ممکن است به هم بخورد در صورتی که سلول‌ها در معرض فاکتورهای محیطی مختلفی قرار گیرند (۵۶). در یوکاریوت‌ها، جزایر CpG متیله در مناطق نان-کدینگ ژنوم پیدا شده‌اند که به‌طور قوی دلالت به افزایش عملکردهای سلولی در ارتباط با مهار رونویسی دارند. این‌ها شامل خاموشی توالی‌های تکراری، غیرفعال‌سازی کروموزوم X، ژنوم ایمپرینتینگ، تکوین جنینی پستانداران و گونه‌زایی نسل‌ها می‌گردد (۵۷).

متیلاسیون ابنرمال جزایر CpG در ارتباط با پروموتر می‌توانند به از دست رفتن بیان ژن منجر گردند که به‌عنوان یک مکانیسم جایگزین غیرفعال‌سازی ژن در موتاسیون‌های کاهش عملکردی است. مکانیسم‌های اپی‌ژنتیک در سال‌های اخیر بسیار زیاد مورد کالبدشکافی قرار گرفته‌اند و نتایج ازهم‌گسیخته آن‌ها در بیماری‌های انسان شامل نقص‌های ایمنی، ناپایداری سانترومری، سندرم آنومالی صورت و سندرم X شکننده دیده می‌شوند (۵۸)، به‌ویژه، اختلال در تنظیم متیلاسیون DNA در سرطان به‌عنوان یک اتفاق ناگهانی و پرشتاب در گسترش تومورها به‌وسیله ژن‌های مهارکننده تارگت‌ها و مولکول‌های مربوط به تمایز مورد توجه قرار گرفته شده است (۵۹). گزارش‌های پیشین نشان داده‌اند که ژنوم انواع تومورها توسط هیپومتیلاسیون (کاهش سرتاسری متیلاسیون) و هایپرمتیلاسیون متناقض (افزایش سرتاسری میزان متیلاسیون) جزایر CpG، بخصوص آنهایی که به ژن‌های مهارکننده تومور مربوط می‌شوند، طبقه‌بندی می‌شوند (۶۰). علاوه بر این، اپی‌ژنتیک انتخابی خاموش‌کننده انکوژن‌ها، با اشکال پاتولوژیک مهاجم و رفتار تومورها در ارتباط است. سایتوکاین‌ها و مسیرهای سیگنال ترانسداکشن به‌طور ذاتی با نواحی درگیر در رشد سرطان، تمایز، بلوغ و فعال‌سازی سلول‌های درگیر در التهاب و ایمنی، در ارتباط هستند (۶۱). تنظیم شبکه سایتوکاین‌های التهابی به‌وسیله مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی در مطالعات زیادی به اثبات رسیده است، از سوی دیگر، مقدار متیلاسیون CpG در پیری افزایش می‌یابد که پیشنهادکننده گسترش بیماری‌های مزمن است که می‌تواند به پیشرفت خاموشی ژن‌های اساسی نسبت داده شود (۶۲).

تغییرات اپی‌ژنتیکی بر اساس شواهد عملکردهای تعادلی آنزیم‌های مختلف مسئول حفاظت اپی‌ژنوم، برگشت‌پذیر هستند. لیزین متیل‌ترانسفراز توسط دمتیله کردن لیزین، اثرات متیلاسیون را خنثی می‌کند (۶۳)؛ بنابراین فهم مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی که چگونه بیان ژن را در فرآیندهای التهابی تنظیم می‌کنند، بینش ما را در گسترش طراحی استراتژی به‌منظور بلوکه کردن یا کاهش پاسخ‌های التهابی ایجاد می‌کند. این بخش روی درک التهاب در نمود یافته‌های اخیر در تنظیم اپی‌ژنتیکی بیان ژن به‌وسیله متیلاسیون عوامل اصلی فوکوس می‌کند (۶۲).

اپی‌ژنتیک و محیط. علائم اپی‌ژنتیک، دینامیک هستند و در پاسخ به محرک‌های محیطی متنوع تغییر می‌کنند.   شماتیک  زیر  نشان می‌دهد که چگونه محرک‌های مختلف و مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی می‌توانند به پاتولوژی اپی‌ژنتیکی تبدیل شوند. فاکتورهای محیطی روی فرآیندهای مولکولی و سلولی پایین‌دست به‌وسیله مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی شامل تغییرات رونویسی از طریق متیلاسیون DNA و تغییرات هیستونی اثر می‌گذارند، همچنین کارایی ترجمه را به‌وسیله مهار به‌واسطه نان-کدینگ RNA، موجب می‌شوند (در التهابات ویژه).

 سندرم بهجت

شکل ۲-۴: شماتیکی از اپی‌ژنتیک و فاکتورهای دخیل در آن

این شماتیک نشان می‌دهد که چگونه محرک‌های مختلف و مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی می‌توانند به پاتولوژی اپی‌ژنتیکی تبدیل شوند

 

۲-۵ اپی‌ژنتیک در بیماری بهجت:

امروزه اپی‌ژنتیک به‌عنوان یک مکانیسم مهم در اتیولوژی بیشتر بیماری‌ها مورد توجه واقع شده است. طی دهه‌های گذشته، مطالعات اپی‌ژنتیکی بیشتر روی تکوین جنین، پیری و سرطان فوکوس شده است؛ اما اخیراً، اپی‌ژنتیک در خیلی از زمینه‌های دیگر همچون التهاب، بیماری‌های ایمنی، چاقی، مقاومت انسولین، تیپ دو دیابت ملیتوس، بیماری‌های قلبی و بیماری‌های نورودژنراتیو تمرکز کرده است. این‌ها ناشی از تغییرات اپی‌ژنتیکی به‌وسیله فاکتورهای داخلی و خارجی و توانایی آن‌ها در تغییر بیان ژن می‌باشد. متیلاسیون غیرنرمال جزایر CpG در ارتباط با پروموتر، می‌تواند به از دست رفتن بیان ژن منجر گردند که به‌عنوان یک مکانیسم جایگزین غیرفعال‌سازی ژن در موتاسیون‌های کاهش عملکردی است (۵۸).

متیلاسیون DNA، معمول‌ترین روش اپی‌ژنتیکی، انتقال کووالانسی گروه متیل از S-آدنوزیل L-متیونین به سیتوزین‌ها است که منجر به خاموشی پایدار رونویسی می‌گردد. در پستانداران، متیلاسیون DNA، تقریباً محدود است به کلاسترهای C-فسفات-G دی‌نوکلئوتیدهایی که بنام جزایر CpG معروف هستند و بیشتر در مناطق پروموتر مشاهده می‌گردند. اگرچه مشاهدات اخیر به‌وسیله Irizarry و همکارانش نشان دادند که بیشتر متیلاسیون DNA خاص بافت در مناطقی دورتر از ۲ کیلوبازی از پروموتر دیده می‌شوند. به‌طور کلی، جزایر CpG غیرمتیله در پروموتر اجازه شروع رونویسی را می‌دهند، درحالی‌که جزایر CpGی متیله در پروموتر فعالیت پروموتر را مهار می‌کنند. تقریباً ۶۰ تا ۹۰ درصد دی‌نوکلئوتیدهای CpG در سلول‌های سوماتیک سالم متیله هستند (۶۴).

فرآیندهای متیلاسیون DNA به‌وسیله پروتئین‌هایی بنام DNA متیل‌ترانسفرازها (DNMTs) کاتالیز می‌شوند که از S-آدنوزیل متیونین (SAM) به‌عنوان دهنده متیل استفاده می‌کند و به‌طور اختصاصی اتم کربن شماره ۵ در حلقه سیتوزین را متیله می‌کند. SAM در میان سلول توزیع گردیده و به‌عنوان دهنده برای انواع متیل ترانسفرازها عمل می‌کند. اهدای گروه متیلی از SAM منجر به تولید S-آدنوزیل هموسیستئین (SAH) می‌گردد. کاربرد داروهای مهارکننده DNA متیل ترانسفراز توانایی آنزیم‌های متیله‌کننده جزایر CpG را کاهش داده یا بلوکه می‌کند و اجازه می‌دهد ژن‌هایی که از قبل خاموش شده بودند، دوباره بیان گردند. متیلاسیون DNA یک تغییر اپی‌ژنتیکی پایدار فوق‌العاده می‌باشد. دو مکانیسم بنیادی پذیرفته‌شده که از طریق آن متیلاسیون DNA باعث خاموشی ژن‌ها می‌گردد، وجود دارد؛ اول، متیلاسیون DNA خودش می‌تواند افینیتی اتصال فاکتورهای رونویسی را کاهش می‌دهد. دوم اینکه، اتصال گروه‌های متیلی پروتئین‌های متصل‌شونده به جزایر CpG (MBPs) به مناطق پروموتری را تقویت می‌کند که مشارکت آن‌ها با کورپرسورهای کلاسیک منجر به فرآیندهای رونویسی معیوب می‌گردد (۶۴, ۶۵).

 سندرم بهجت

شکل ۲-۵: شماتیکی از ارتباط اپی‌ژنتیک با بیماری بهجت

همانطوریکه در شکل نیز مشخص می‌باشد، فرآیندهای اپی‌ژنتیکی تحت تأثیر عوامل محیطی مانند سن، جنس، رژیم غذایی، داروها و عوامل میکروبی از طریق مکانیسم‌های مولکولی روی برخی از سلول‌ها مانند PBMC اثر گذاشته و به دنبال آن از طریق مکانیسم‌هایی مانند متیلاسیون ابنرمال DNA، میزان بیان برخی از ژن‌ها را تغییر می‌دهند. در نهایت از طریق تغییر بیان ژن‌های مؤثر در پاتوژنز بیماری، بر روی روند بیماری مؤثر واقع می‌شوند (۶۴)

 

سایتوکاین‌ها و مسیرهای سیگنال ترانسداکشن به‌طور ذاتی با نواحی درگیر در رشد سرطان، تمایز، بلوغ و فعال‌سازی سلول‌های درگیر در التهاب و ایمنی، در ارتباط هستند. تنظیم شبکه سایتوکاین‌های التهابی به‌وسیله مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی در مطالعات زیادی به اثبات رسیده است. لیزین متیل ‌ترانسفراز توسط دمتیله کردن لیزین، اثرات متیلاسیون را خنثی می‌کند، بنابراین فهم مکانیسم‌های اپی‌ژنتیکی که چگونه بیان ژن را در فرآیندهای التهابی تنظیم می‌کنند، بینش ما را در گسترش طراحی استراتژی به‌منظور بلوکه کردن یا کاهش پاسخ‌های التهابی ایجاد می‌کند. در ارتباط با زمینه‌های مستعد ژنتیکی، اپی‌ژنتیک یک نقش مکمل سببی در پاتولوژی بیماری‌های اتوایمیون مانند لوپوس اریتروماتوز سیستمیک (SLE)، آرتریت روماتوئید (RA)، سندرم شوگرن اولیه (pSS)، پسوریازیس و دیابت ملیتوس نوع یک (T1D) بازی می‌کند (۶۶).

 سندرم بهجت

شکل ۲-۶: نقش IL-10 و IL-6 در پاتوژنز بیماری‌های خودایمنی

این سایتوکاین‌ها تحت تأثیر عوامل محیطی اشاره شده، در نهایت تحت تأثیر متیلاسیون ابنرمال DNA، میزان بیان ژن متفاوتی نسبت به افراد سالم نشان داده و از این طریق پاتوژنز بیماری را تحت تأثیر قرار می‌دهند.

 

تغییرات وضعیت متیلاسیون پروموتر می‌تواند بیان و فعال‌سازی سایتوکاین‌های مختلف را تعدیل کند؛ به‌طور کلی، گستردگی متیلاسیون نواحی CpGی پروموتر با میزان تولید سایتوکاین‌ها همبستگی دارد، برای مثال، بیان فاکتور نکروزدهنده توموری (TNF)، یک سایتوکاین قوی در ارتباط با فعالیت‌های پیش‌التهابی، در ماکروفاژها به دنبال در معرض قرار گرفتن لیپوپلی‌ساکارید اندوتوکسین افزایش می‌یابد، اگرچه، تنوع معنی‌دار بین افراد در تولید TNF به‌وسیله مشاهدات و تحقیقات قبلی مختلفی گزارش شده است. تفاوت‌ها در متیلاسیون پروموتر TNF، به میزان متنوعی از بیان ژن TNF دلالت دارد که ممکن است اساس تنوع پاسخ‌ها در افراد با بیماری‌های التهابی مزمن را توضیح دهد. (۶۷, ۶۸).

 

بررسی متون:

مطالعاتی برای الگوی متیلاسیون ژن‌های BCL-2 و BAX صورت گرفته است که می‌توان به مطالعه نسرین مجیدی قره‌ناز و همکاران (مجله علوم پزشکی فسا- زمستان ۱۳۹۳) اشاره کرد که با ارزیابی تکوین و بیان ژن‌های BCL-2,BAX,ErbB4 پس از انجماد شیشه‌ای در بلاستوسیت های موشی و بررسی الگوی متیلاسیون این ژن‌ها، نتیجه گرفتند که روش انجماد شیشه‌ای تأثیری در متیلاسیون این ژن‌ها ندارد، فلذا اثر سوئی برای فرآیند آپوپتوزیس سلول‌های بلاستوسیت موشی ندارد (۱۴).

در مطالعه دیگری که بر روی ژن‌های BCL-2 و BAX انجام گرفته، می‌توان به مطالعه مریم قوشچیان و همکاران (مجله طب جنوب- خرداد و تیر ۱۳۹۵) اشاره کرد که در این مطالعه به بررسی بیان ژن‌های وابسته به آپوپتوز BCL-2 و BAX در هیپوکامپ مغز موش‌های صحرایی با استفاده از تزریق نانوذرات نقره به‌صورت درون صفاقی پرداخته شده است که طی آن نشان دادند که میزان بیان ژن آنتی‌آپوپتوتیک BCL-2 به‌صورت وابسته به دوز نانوذرات نقره کاهش و برعکس بیان ژن پروآپوپتوتیک BAX به‌صورت وابسته به دوز نانوذرات نقره افزایش می‌یابد (۱۴).

در یک مطالعه توسط Anatol Panasiuk و همکاران در سال ۲۰۰۶ به بررسی میزان بیان پروتئین‌های p53، Bax و Bcl2 در هپاتوسیت‌های بیماری کبد چرب پرداختند. این مطالعه روی ۸۴ بیمار در مراحل مختلف بیماری کبد چرب پرداخته شد. رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی مربوط به بافت کبد نشان داد که فعال‌سازی پروتئین p53 در بیماران تحت افزایش استئاتوز کبدی با کاهش bcl2 و کاهش ضعیف bax همراه می‌باشد. ارتباط مثبت میان مرحله استئاتوز بیماری با بیان p53 دیده شد. همچنین پروتئین آنتی‌آپوپتوزی bcl2 همراه با پیشرفت استئاتوز کبدی، مخصوصاً در هپاتوسیت‌های غیراستئاتوزی کاهش نشان داد. این نتایج نشان می‌دهد که آپوپتوز یکی از مهم‌ترین مکانیسم‌های حذف هپاتوسیت‌ها در بیماری کبد چرب غیرالکلی می‌باشد. همچنین مشخص گردید که شدت التهاب در این بیماران موجب القاء p53 توسط مهار پروتئین آنتی‌آپوپتوز bcl2 می‌گردد (۶۹).

در یک مطالعه دیگر توسط Birgit Dibbert در سال ۱۹۹۹ به بررسی نقص bax با واسطه سایتوکاین و به دنبال آن به تأخیر افتادن آپوپتوز نوتروفیل‌ها پرداختند. نوتروفیل‌ها سلول‌های تأثیرگذار و مهمی در سیستم ایمنی میکروارگانیسم‌ها به‌ویژه باکتری‌ها هستند. در این مطالعه محققین اثبات کردند که روند آپوپتوز نوتروفیل‌ها در چندین بیماری التهابی به تأخیر می‌افتد که این پدیده ممکن است یک خصوصیت کلی برای رشد نوتروفیل‌ها باشد. تأخیر آپوپتوز نوتروفیل‌ها با کاهش قابل‌توجه مقدار bax و bcl2 در ارتباط می‌باشد. چنین سلول‌هایی با کمبود bax، بر اثر تحریک نوتروفیل‌های نرمال توسط سایتوکاین‌های موجود در جایگاه‌های التهاب، مانند فاکتورهای تحریک‌کننده کولونی گرانولوسیت و ماکروفاژ-گرانولوسیت مشاهده می‌شود. علاوه بر این، نوتروفیل‌های با کمبود bax توسط الیگودواکسی نوکلئوتیدهای ضد bax تولید شده و آپوپتوز را به تأخیر می‌اندازند و شواهد مستقیمی برای نقش bax به‌عنوان مولکول پیش‌التهابی در این سلول‌ها وجود دارد، بنابراین به نظر می‌رسد که پیشروی گرانولوسیت‌ها و رفع التهاب هر دو با بیان bax در نوتروفیل‌ها تنظیم می‌گردد (۷۰).

در یک مطالعه دیگر، Lee Yeong و همکاران در سال ۲۰۱۳ به بررسی بیان bcl2 با واسطه IL17 در سینوویوسیت‌های شبه‌فیبروبلاستی (FLS[5]) در بیماران آرتریت روماتوئیدی پرداختند. در این مطالعه میزان بیان Bax و Bcl2 توسط PCR و وسترن بلات مورد سنجش قرار گرفتند. بیان Bcl2 و فسفو STAT3 در بافت سینوویال توسط میکروسکوپ کونفوکال مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که Bax پیش‌التهابی کاهش یافته و bcl2 آنتی‌آپوپتوزی در FLS بیماران RA در مقایسه با بیماران استئوآرتریتی (OA) افزایش می‌یابد. IL17 منجر به تنظیم افزایشی Bcl2 در سلول‌های FLA بیماران آرتریت روماتوئید می‌شود، اما هیچ تأثیری در FLS بیماران استئوآتریت ندارد. همچنین مشخص شد که STAT3 در تنظیم افزایشی Bcl2 توسط IL17 به‌عنوان واسطه عمل می‌کند (۷۱).

در یک تحقیق دیگر توسط Xinxin Wang و همکاران در سال ۲۰۱۷ به بررسی و آنالیز متیلاسیون DNA در کوندروسیت‌ها در موش‌هایی با استئوآرتریت زانو پرداختند. تغییرات متیلاسیون DNA ممکن است در تخریب کندروسیت‌های مفاصل درگیر باشد. این مطالعه روی ۱۰ موش با مدل جانوری استئوآرتریت زانو (KOA) و ۱۰ موش به‌عنوان گروه کنترل انجام شد. در این مطالعه از روش‌های رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، ABH/OG و تونل برای بررسی ایمونوهیستوشیمی Bax، Bcl2 و Fas استفاده شد. نتایج مربوط به انواع روش‌های رنگ‌آمیزی نشان داد که تمامی نمونه‌های مربوط به KOA نسبت به گروه کنترل از شدت بیشتری برخوردار بودند. همچنین میزان متیلاسیون KOA به‌طور معنی‌داری نسبت به گروه کنترل سالم کاهش نشان داده بود. این نتایج نشان می‌دهد که آپوپتوز کندروسیت‌ها و کاهش میزان متیلاسیون C/ebpa-2، Cdk2، Bak1 و Fas در پاتوژنز بیماری KOA نقش اساسی دارند (۷۲).

در یک مطالعه دیگر، Itoh J و همکاران در سال ۲۰۰۱ به بررسی میزان بیان Bax توسط سلول‌های T موکوسی در آپوپتوز بیماری ایمنی کرون پرداختند. همانطور که می‌دانید، سلول‌های T فعال نسبت به سلول‌های در حال استراحت نسبت به آپوپتوز حساس‌تر هستند و در روده بیشتر سلول‌های T در مرحله فعال هستند، بنابراین آپوپتوز افزایش‌یافته ممکن است برای حفظ هموستازی ایمنی در محیط اطراف مخاط ضروری باشد، بدین منظور در این تحقیق به مطالعه میزان بیان Bcl2 به‌عنوان یکی از پروتئین‌های پیش‌آپوپتوز و تنظیم‌کننده آپوپتوز پرداخته شد. این تحقیق روی سلول‌های T لامینا پروپریای (LPT) 10 فرد سالم، ۷ فرد با بیماری کرون و ۸ نفر با بیماری کولیت اولسراتیو و سلول‌های T خون محیطی (PBT) انجام شد. درنهایت در سلول‌های خالص‌سازی‌شده و رنگ‌آمیزی‌شده، میزان Bcl2 و Bax توسط فلوسایتومتری مورد سنجش قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان بیان Bcl2 و bax در سلول‌های PBT در مقایسه با LPT افزایش معنی‌دار نشان داده بود. همچنین مشخص گردید که میزان بیان Bax در بیماران کرون در مقایسه با افراد گروه کنترل به‌طور معنی‌داری کاهش نشان داده بود اما در کولیت اولسراتیو بدون تغییر بود. این نتایج نشان داد که نوع تنظیم بیان Bcl2 در میان سلول‌های Tی در حال گردش با سلول‌های مخاطی متفاوت می‌باشد (۷۳).

 

فصل سوم:

مواد و روش کار

 

۳-۱- نوع مطالعه و زمان و مکان مطالعه:

این مطالعه از نوع مطالعات بالینی و به‌صورت مورد- شاهدی بوده است.

این مطالعه در آزمایشگاه مرکزی دانشکده علوم نوین پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریز با همکاری مرکز تحقیقات بیماری‌های بافت همبند و گروه ژنتیک دانشگاه آزاد اسلامی تبریز در سال‌های ۹۷-۹۶ انجام پذیرفت.

 

۳-۲- جامعه نمونه آماری و روش نمونه‌گیری:

جهت تعیین تعداد نمونه با نظر مشاور آماری و با سطح اطمینان ۹۵% و دقت ۰/۰۷ و سطح خطای نوع اول ۰/۰۵، ۴۰ نمونه از بیماران مبتلا به بیماری بهجت به‌عنوان گروه بیمار و ۶۰ نفر از افراد سالم به‌عنوان گروه کنترل برآورد گردید.

در این بررسی جمعیت بیماران مبتلا به بیماری بهجت مورد مطالعه قرار گرفتند، این افراد بر اساس یافته‌های آزمایشگاهی و محتوای پرونده پزشکی با نظر پزشک متخصص، به‌صورت تصادفی از میان مراجعه‌کنندگان به متخصص روماتولوژی که تحت درمان با سرکوب‌کننده‌های سیستم ایمنی نباشند، انتخاب شدند. انتخاب بیماران بر اساس کرایتریاهای (The International Criteria for Behcet’sDisease) IBCD صورت گرفت. همچنیــــــــــــــــــن میــــزان فعالیــــــت بیمــــــــــاری بر اساس معیارهای (IBDDAM) Iran Behcet’s Disease Dynamic Activity Measure)) سنجیده شد که بر این اساس، درگیری‌های تهدیدکننده‌ی عروق، چشم و مفاصل، نشان‌دهنده‌ی شدت بیماری است. گروه شاهد نیز شامل افراد نرمال است که فاقد هرگونه سابقه بیماری خودایمنی بوده و به‌صورت تصادفی از میان اهداکنندگان مستمر خون، آگاهانه انتخاب می‌شوند. دامنه سنی در هر گروه بین ۲۰ تا ۵۰ انتخاب شد.

پس از دریافت رضایت آگاهانه از داوطلبان از هر فرد ۵ CC خون وریدی با ضد انعقاد EDTA جهت انجام تست‌های ژنتیک دریافت شد. نمونه خون همراه EDTA تا زمان شروع کار در دمای ۲۰ – درجه نگهداری شد، سپس با استفاده از روش Salting out (RGDE[6]) به مقدار موردنیاز DNA از نمونه‌های خونی استخراج گردید. پس از تعیین غلظـت DNA، طبق پروتکل موردنظر کیت زایمو (Zymo) برای سنجش میزان متیلاسیون مورد استفاده قرار گرفت. برای بررسی میزان بیان ژن، از تمامی نمونه‌های موردنظر، RNA طبق پروتکل کیت ترایزول جداسازی شد. سپس توسط تکنیک Real-time PCR مورد آنالیز و سنجش قرار گرفت.

درنهایت به‌منظور تأیید مراحل انجام‌شده، محصولات حاصل از PCR توسط روش ژل الکتروفورز مورد بررسی قرار گرفت.

 

۳-۳- دستگاه‌های موردنیاز:

جدول ۳-۱: مواد و تجهیزات موردنیاز

 

۳-۴- مواد موردنیاز:

  • اتانول ۱۰۰% شرکت مرک آلمان
  • ایزوپروپانول شرکت مرک آلمان
  • کلروفرم
  • آب مقطر
  • DEPCE Water
  • محلول PBS
  • میکروتیوب۰/۲ و ۱/۵ میلی‌لیتری شرکت
  • میکروتیوب ۰/۲ و ۱/۵میلی‌لیتری شرکت RNase Free
  • دستکش‌های لاتکس از نوع لاتکس و وینیلی و نیتریلی
  • لوله‌های فالکون ۱۵ و ۵۰ میلی‌لیتری
  • سرسمپلر های ۱۰، ۱۰۰ و ۱۰۰۰ میکرو (کریستالی، زرد و آبی)
  • رک آبی، زرد مخصوص سرسمپلرهای آبی و زرد و کریستالی
  • رک لوله فالکون ۱۵ میلی‌لیتری

 

۳-۵- روش کار:

ابتدا تمام وسایل موردنیاز شامل سرسمپلرها، دستکش، ماسک، محلول‌ها، ترایزول استریل شده و زیر هود قرار داده شد. سپس برای تمام مراحل کار میکروتیوب‌ها برچسب و شماره‌گذاری می‌شود. قبل از شروع استخراج بهتر است که برخی از نمونه‌ها را شمارش سلولی انجام دهیم. بدین منظور ۲۰μl از محلول سلول با ۱۰μl رنگ تریپان‌بلو در یک میکروتیوب ۰/۲میلی‌لیتری مخلوط شده و در نهایت با استفاده از لام نئوبار سلول‌ها شمارش گردیدند، سپس سلول‌های جداسازی‌شده توسط فایکول، به‌منظور استخراج RNA و DNA مورد استفاده قرار گرفتند.

 

۳-۶- طرز تهیه محلول‌های موردنیاز:

۳-۶-۱- بافر فسفات سالین (PBS, Phosphate Buffered Saline):

به‌منظور تهیه یک لیتر بافر فسفات سالین ۱X، ۸ گرم کلرید سدیم Nacl (137 میلی مولار)،۰/۲ گرم کلرید پتاسیم mM 10 (KCL) را توزین کرده و به درون ارلن ریخته و این مخلوط را در ۹۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر دو بار تقطیر دیونیزه حل نموده و PH را توسط NaOH و HCl غلیظ بر روی PH=7.4 تنظیم کرده و سپس حجم بافر را به یک لیتر رسانده و در حجم‌های ۲۰ میلی‌لیتری تقسیم و اتوکلاو کرده و در نهایت در یخچال در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

 

۳-۶-۲- محلول اتانول ۷۵%:

در یک فالکون ۵۰ میلی‌لیتری، ۳۷/۵ میلی‌لیتر اتانول absolute (100%) شرکت مرک آلمان را ریخته و حجم با DEPC water به ۵۰ رسید و در نهایت در دمای ۲۰- نگهداری شد.

 

۳-۶-۳- محلول‌های لازم جهت واکنش PCR:

الف) پرایمرها

غلظت پرایمرهای موردنیاز برای واکنش,PCR  ۱ میکروگرم در میکرولیتر می‌باشد که پس از تهیه این غلظت در آزمایشگاه دردمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

 

جدول ۳-۲: توالی پرایمرهای ژن‌های BAX و BCL2


محلول‌های لازم جهت الکتروفورز کردن
DNA: 

الف) بافر الکتروفورز xTBE5

برای تهیه بافر xTBE5 به این شکل عمل می‌شد: برای تهیه ۱۰۰۰ میلی‌لیتر از این محلول، ۵۴ گرم از پودر Tris را با ۲۷/۵ گرم اسید بوریک مخلوط کرده و ۲۰ میلی‌لیتر EDTA(0.5M) به آن اضافه می‌کنیم و با آب مقطر حجم محلول را به ۱۰۰۰ میلی‌لیتر می‌رسانیم. برای بافر داخل تانک الکتروفورز از بافر X1TBE استفاده شد. همچنین از این بافر برای تهیه ژل آگارز نیز استفاده شد.

 

ب) بافر بارگذاری DNA در ژل

این بافر برای سنگین کردن محصولات PCR در چاهک ژل و اطلاع از میزان حرکت قطعات روی ژل با مقایسه میزان حرکت رنگ استفاده شد. برای تهیه ۱۰۰ میلی‌لیتر بافر بارگذاری، ۲۵۰ میلی‌گرم بروموفنل بلو و یا ۲۵۰ میلی‌گرم زایلن سیانول در ۳۳ میلی‌لیتر Tris 150 میلی‌مولار (pH=7/6) حل شده، سپس ۶۰ میلی‌لیتر گلیسرول و ۷ میلی‌لیتر H2O به آن اضافه شد. بافر بارگذاری حاصل در یخچال نگهداری شد.

 

۳-۷- روش فایکول:

افزودن ۴ سی‌سی از خون به لوله‌های فالکون ۱۵ سی‌سی

به‌منظور رقیق‌سازی خون، به همان مقدار محلول PBS (که از قبل آماده کرده‌ایم) روی نمونه خونی افزوده شد.

چندین بار لوله حاوی نمونه خونی رقیق‌شده وارونه گردید.

در یک لوله فالکون دیگر به مقدار ۳ تا ۴ سی‌سی فایکول ریخته شد.

نمونه خون رقیق‌شده به‌آرامی با یک سمپلر از لبه لوله روی فایکول ریخته شد (طبق شکل)

سپس نمونه‌های خونی قرارگرفته روی فایکول را به‌آرامی در داخل سانتریفیوژ قرار داده و طبق پروتکل با سرعت ۸۰۰g به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفیوژ شد.

در این مرحله پس از سانتریفیوژ، نمونه‌ها به‌صورت ۴ فاز مشخص جدا می‌شوند: (از بالا به پایین)

فاز اول یا بالایی: حاوی پلاسمای خون به رنگ زرد

فاز دوم: حاوی سلول‌های تک‌هسته‌ای، کدر رنگ، خیلی نازک (در حدود ۳-۱ میلی‌متر)

فاز سوم: فایکول

فاز چهارم یا پایینی: گلبول‌های قرمز به همراه گرانولوسیت‌ها

شکل ۳-۱: روش فایکول و فازهای تشکیل شده آن

به‌منظور جداسازی سلول‌های تک‌هسته‌ای، فاز میانی را با استفاده از سمپلر ۱۰۰ میکرو به‌آرامی، بدون اینکه منجر به هم زدن فازها گردیم، جدا کرده و به یک لوله فالکون جدید انتقال می‌دهیم. در این مرحله سعی شد که تمام محتویات فاز میانی به لوله جدید منتقل گردد.

به‌منظور جداسازی پلاسمای خون نیز فاز بالایی را با استفاده از سمپلر ۱۰۰۰ میکرو برداشته و به یک میکروتیوب ۲ میلی‌لیتری منتقل شد.

برای شستشو دادن سلول‌ها، حجم سلول‌های تک‌هسته‌ای برداشت‌شده را توسط PBS به ۱۰ میلی‌لیتر می‌رسانیم. پس از افزودن PBS روی سلول‌ها، چندین بار لوله را وارونه می‌کنیم تا محتویات درون لوله به‌خوبی مخلوط گردند.

نمونه سلول‌ها که توسط PBS رقیق شده‌اند را دوباره درون دستگاه سانتریفیوژ گذاشته و با سرعت ۸۰۰G به مدت ۱۰-۵ دقیقه سانتریفیوژ گردیدند.

سوپرناتانت آن را دور ریخته، سلول‌های رسوب داده شده به‌منظور استخراج RNA یا DNA برداشته می‌شود. در صورتی که سلول‌ها حاوی گلبول قرمز باشند، مرحله قبل یعنی شستشو دوباره تکرار می‌شود.

 

۳-۸- مراحل مربوط به استخراج DNA:

 سندرم بهجت

شکل ۳-۲: روش استخراج DNA

 

۳-۹- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده:

پس از استخراج DNA، لازم است کیفیت و کمیت DNA استخراج‌شده تعیین گردد. برای تعیین مقدار DNA معمولاً از دو روش اسپکتروفتومتری یا الکتروفورز بر روی ژل آگارز استفاده می‌شود.

 

۳-۹-۱- روش اسپکتروفتومتری:

برای این کار از دستگاه نانودراپ استفاده گردید، بطوریکه حجم معینی از DNA استخراج شده را با آب مقطر یا بافر TE (همان حلالی که DNA داخل آن حل شده است) رقیق کرده و به حجم خاصی رسانده شد. نسبت مذکور فاکتور رقت ۱۱ نامیده می‌شود، سپس با استفاده از نانودراپ کیفیت DNA معین شد. مقادیر کمتر از ۱/۸ نشانگر وجود آلودگی‌های پروتئینی، فنلی و یا دیگر جذب‌کننده‌های اشعه‌ی ماوراءبنفش است. مقادیر بیشتر از ۲ نیز نشانگر وجود  RNA در نمونه‌ی استخراج‌شده است. پس از انتخاب محلول‌هایی که نسبت جذبی آن‌ها در محدوده‌ی موردنظر باشد، از اعداد مربوط به طول‌موج ۲۶۰ نانومتر جهت محاسبه میزان غلظت DNA طبق روابط زیر استفاده می‌گردد:

از آنجائی که هر یک واحد جذب در طول ۲۶۰ نانومتر متناظر با حدود ng/ml 50 از DNA دو رشته‌ای می‌باشد، برای تعیین مقدار DNA می‌توان از فرمول زیر استفاده کرد.

۲۶۰A × ng/ml 50× ضریب رقت = (ng/ml) غلظت DNA

نمونه‌های  DNAاستخراج شده به کمک دستگاه نانودراپ بررسی گردید. در بیشتر موارد کیفیت نمونه‌ها مطلوب بود، یعنی نسبت ۲۸۰A/ 260A، مناسب و بین ۱/۸ تا ۲ بود.

برای بهینه کردن PCR، ابتدا PCR استاندارد را انجام داده و سپس با توجه به محصولات PCR اقدام به تغییر شرایط PCR نمودیم. در مرحله اول با دادن دامنه حرارتی متفاوت، بهترین دمای اتصال آغازگرها به رشته الگو بدست آمد و در مرحله بعد جهت ظهور باکیفیت باندها، غلظت MgCl2 و DNA ژنومی بهینه‌سازی شد.

 

۳-۱۰- روش qMS-PCR:

DNA ی مربوط به سلول‌های تک‌هسته‌ای نمونه‌ها، بر اساس پروتکل شرکت ســــازنده کیت با روش Salting out استخراج شده و برای اندازه‌گیری سطح متیلاسیون ژن‌هـــا از تکنیــک MSP (Methylation specific PCR) استفاده شد.

PCR خاص متیلاسیون (MS-PCR) متکی به آمپلیفیکاسیون برای ارزیابی وضعیت متیلاسیون در جایگاه‌های CpG خاص می‌باشد. موفقیت با این سیستم بستگی به آمپلیفیکاسیون افتراقی میان پرایمرهای طراحی‌شده برای نواحی متیله با نواحی غیرمتیله دارد. درحالی‌که بیشتر ملاحظات برای طراحی پرایمر در این روش نیز یکسان است، اما تریتمنت نواحی CpG در درون پرایمر کاملاً متفاوت می‌باشد. برای MSP، در پرایمرهای متیله؛ وجود سیتوزین‌ها در انتهای ʹ۳ جایگاه‌های CpG پرایمرها و در پرایمرهای غیرمتیله، وجود تیمین‌ها در انتهای ʹ۳ پرایمرها خیلی ضروری است.

به‌منظور اجرای موفق این روش‌ها، مهم‌ترین گام، طراحی پرایمرها برای DNAی مدیفای شده می‌باشد. وجود برنامه‌هایی برای PCR استاندارد نمی‌تواند طراحی پرایمر را برای PCR خاص BSP راه‌اندازی کند، بدین منظور برای طراحی پرایمر برای BSP، ناحیه درون پرایمرها نباید حاوی جایگاه CpG باشد، در حالی که در پرایمرهای مربوط به MSP، حتماً باید حاوی یک جایگاه CpG باشد.

 سندرم بهجت

شکل ۳-۳: روش qMS-PCR

خلاصه شماتیک مربوط به تکنیک متیلاسیون

 

در این روش در ابتدا DNA توسط سدیم بی‌سولفیت تریت شد که باعث تبدیل رزیدوهای سیتوزینی به یوراسیل در تک‌رشته DNA می‌گردد. تحت این شرایط جایگاه‌های ۵mC بدون تغییر باقی مانده، در صورتی که جایگاه‌های حاوی سیتوزین غیرمتیله به یوراسیل تبدیل شدند، سپس توسط نرم‌افزارهای طراحی پرایمر خاص MSP، هم برای توالی‌های متیله و هم برای توالی‌های فاقد جایگاه متیله پرایمر طراحی گردید. در این روش همچنین به‌منظور کمی‌سازی میزان متیلاسیون جایگاه موردنظر، به دنبال ژل الکتروفورز، مقادیر کمی جایگاه‌های متیلاسیون و غیرمتیلاسیون توسط روش Real-time PCR مورد آنالیز قرار گرفتند. سپس توسط مقادیر CT[7] که توسط دستگاه ارائه شد، مورد آنالیز قرار گرفتند. همچنین به‌منظور کنترل اینکه نمونه‌ها به دنبال تیمار بی‌سولفیت، تحت تأثیر قرار می‌گیرند یا نه و اینکه پرایمرهای متیله و غیرمتیله ما واقعاً به جایگاه‌های موردنظر متصل می‌شوند یا نه، نیاز به نمونه‌های DNAی کنترل متیله و غیرمتیله داشتیم. تا در نهایت به دنبال ژل الکتروفورز، مشخص گردد که پرایمرهای متیله ما فقط به جایگاه‌های متیله و پرایمرهای غیرمتیله فقط به جایگاه‌های غیرمتیله متصل می‌شوند.

همچنین در این روش، به‌منظور بالا بردن اختصاصیت پرایمرها، توسط نرم‌افزارهای مختلفی همانند Oligo مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت به‌منظور سنتز، به شرکت‌ها سفارش داده شد. با این وجود در صورت مشاهده اتصالات غیراختصاصی پرایمرهای طراحی‌شده، سریعاً پرایمرها را مورد ارزیابی قرار داده و به دنبال تغییرات موردنیاز، دوباره سفارش داده شد.

متیلاسیون جایگاه‌های موردنظر توسط تکنیک QMS-PCR مورد بررسی قرار گرفت. خلاصه روش اجرای مطالعه به‌صورت فلوچارت در شکل زیر نشان داده شده است (شکل ۳-۴).

 

۳-۱۱- پروتکل مربوط به qMSP-PCR کیت Zymo:

این کیت قادر است تمامی نقاطی که به‌صورت CpG-rich هستند را در کمتر از ۳ ساعت بی‌سولفیته کند.

مرحله مربوط به واکنش دناتوراسیون/تبدیل همراه با گرما، تبدیل سیتوزین‌های غیرمتیله به یوراسیل را بسیار مؤثر و کارآمد عمل می‌کند.

رسوب DNA حذف شده است. در عوض، DNA در یک مرحله با استفاده از میکروتیوب‌های ستونی هم دسولفیته می‌شود و هم پاکسازی می‌شود.

DNAی فوق‌العاده خالص و رقیق‌شده برای استفاده آنالیزهای مولکولی ایده‌آل است.

 

نکات آماده‌سازی:

به ازای هر واکنش CT conversion، ۹۰۰ میکرولیتر آب، ۳۰۰ میکرولیتر M-Dilution buffer و ۵۰ میکرولیتر M-Dissolving buffer قبل از استفاده اضافه می‌کنیم.

۹۶ میکرولیتر از اتانول ۱۰۰% روی ۲۴ میکرولیتر بافر M-Wash اضافه می‌کنیم.

 سندرم بهجت

شکل ۳-۴: شماتیک تریت کردن DNA در پروتکل مربوط به کیت زایمو

 

خصوصیات کیت:

DNAی ورودی: نمونه‌ها باید حاوی ۵۰۰ پیکوگرم تا ۲ میکروگرم DNA باشند. بهترین حالت میزان DNAی ورودی ۵۰۰-۲۰۰ نانوگرم می‌باشد.

بازده تبدیل: بیش از ۹۹% سیتوزین‌های غیرمتیله به یوراسیل تبدیل می‌شوند و بیش از ۹۹% محافظت از سیتوزین‌های متیله را انجام می‌دهد.

میزان DNA Recovery: بیش از ۷۵%

 

۳-۱۲- تهیه واکنشگرها:

آماده کردن واکنشگر تبدیل CT:

این ماده در داخل کیت به‌صورت ماده جامد می‌باشد که بایستی قبل از استفاده به‌صورت محلول تهیه شود. برای همین طبق پروتکل زیر عمل می‌کنیم:

افزودن ۹۰۰ میکرولیتر آب، ۳۰۰ میکرولیت M-Dilution Buffer و ۵۰ میکـــــــــــــــــــــرولیتر M-Dissolving Buffer در تیوب‌های مخصوص واکنشگر تبدیلCT  و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق توسط ورتکس یا شیکر مخلوط می‌کنیم.

توجه ۱: معمول است که مقدار کمی از ماده به‌صورت غیرمحلول در تیوب دیده شود. هرکدام از تیوب‌های واکنشگر برای تریت کردن ۱۰ نمونه در نظر گرفته شده است.

توجه ۲: این محلول نسبت به روشنایی حساس است و بنابراین باید تا حد امکان به دور از روشنایی باشد. برای گرفتن نتایج مطلوب، بهترین حالت این است که به‌محض آماده‌سازی محلول، فوراً استفاده شود. همچنین این محلول را می‌توان به‌صورت شبانه در دمای اتاق به‌منظور استفاده فوری نیز نگهداری کرد؛ اما در صورت نگهداری به مدت یک هفته بهتر است در دمای اتاق و نگهداری به مدت یک ماه در دمای منفی ۲۰ درجه نگهداری شود. قبل از استفاده از این محلول در دمای ۳۷ باید گرم شود و سپس ورتکس گردد.

 

آماده‌سازی M-Wash buffer:

مقدار ۹۶ میلی‌لیتر از اتانول ۱۰۰% را روی تیوب مربوط به M-Wash Buffer می‌ریزیم.

 

۳-۱۳- پروتکل اصلی:

اضافه کردن ۱۳۰ میکرولیتر از واکنشگر CT روی ۲۰ میکرولیتر از نمونه DNA در تیوب PCR. اگر حجم نمونه DNA کمتر از ۲۰ میکرولیتر ‌باشد، مابقی آن توسط آب کامل خواهد شد. نمونه‌ها توسط فلیکینگ تیوب یا پیپتینگ و آپ و داون کردن مخلوط می‌گردد، سپس سانتریفیوژ می‌گردد (۱۳۰ میکرولیتر از CT + 3 لاندا DNAی محلول در آب + ۱۷ لاندا آب= ۱۵۰).

نمونه‌های آماده‌شده را در داخل ترموسایکلر قرار داده و طبق پروتکل زیر PCR انجام می‌دهیم:

۹۸ ˚C for 10 minutes

۶۴ ˚C for 2.5 hours

۴ ˚C storage up to 20 hours

برای برخی از نمونه‌ها روش‌های جایگزین پیشنهاد شده است.

به مقدار ۶۰۰ میکرولیتر M-Binding buffer در داخل ستون‌های Zymo-Spin IC ریخته و ستون را درون یک تیوب جمع‌آوری قرار می‌دهیم.

نمونه‌ها (آماده‌شده در مرحله ۲) را درون ستون Zymo-Spin IC حاوی M-Binding buffer لوود کرده، درب ستون را بسته و توسط وارونه کردن ستون، چندین بار نمونه‌ها را مخلوط می‌کنیم.

با سرعت بیش از g 10000 به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ می‌کنیم. مایع ریخته‌شده به تیوب پایینی را دور می‌ریزیم.

به مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از بافر M-Wash را درون ستون می‌ریزیم. سپس با تمام سرعت به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ می‌کنیم.

با افزودن ۲۰۰ میکرولیتر از بافر M-Desulphonation درون ستون، اجازه دهید به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه در دمای اتاق (۳۰-۲۰) قرار گیرد. پس از انکوباسیون، به مدت ۳۰ ثانیه با تمام سرعت سانتریفیوژ کنید.

سپس افزودن ۲۰۰ میکرولیتر بافر M-Wash در ستون و سانتریفیوژ با تمام سرعت به مدت ۳۰ ثانیه. ۲۰۰ میکرولیتر دیگر از بافر M-Wash را افزوده و به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ کنید.

ستون را درون تیوب میکروسانتیرفیوژ قرار دهید. ۱۰ میکرولیتر بافر M-Elution را به‌طور مستقیم در زمینه ستون بریزید. با تمام سرعت به مدت ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ کنید.

 

۳-۱۴- تهیه ژل آگارز و الکتروفورز محصولات PCR

آگارز یک پلی‌ساکارید است که از واحد‌های تکرارشونده آرابینوز دی‌ساکارید تشکیل شده است. پودر آگارز در اثر حرارت در بافر مخصوص خود به شکل ژله‌ای درمی‌آید، در واقع شکل مولکو‌ل‌های پلیمر از حالت حلقوی نامنظم به شکل مولکول‌های مارپیچی دوتایی تبدیل می‌شود. این پلیمر، یک شبکه از منافذ با قطر ۱۰۰ الی ۳۰۰ نانومتر ایجاد می‌کند که اندازه این منافذ به عوامل متفاوتی بستگی دارد. غلظت بالاتر آگارز منافذ ریزتر به وجود می‌آورد که قدرت تفکیک اندازه DNA را بالاتر می‌برد. با توجه به وزن مولکولی قطعات تکثیرشده، سرعت حرکت آن‌ها نیز متفاوت می‌باشد. قطعات کوچک‌تر سرعت بیشتر و قطعات بزرگ‌تر سرعت کمتری دارند.

برای تهیه ژل آگارز پس از تعیین حجم و غلظت ژل مقدار موردنیاز، پودر آگارز را وزن کرده و سپس به‌اندازه کافی به آن بافر X1TBE افزوده و تا دمای جوش حرارت داده تا رنگ محلول کاملاً شفاف شود. مدتی صبر کرده تا ژل اندکی سرد شده و دمای آن به حدود ۴۰ درجه سانتی‌گراد برسد، سپس ماده ایمنی[۸] متناسب با حجم و غلظت ژل (مطابق دستور شرکت سازنده) افزوده می‌شود. ماده ایمنی یک ماده چند حلقه‌ای خاص می‌باشد که قادر است به بازهای آلی متصل شود. این ماده به‌تنهایی فاقد خاصیت فلوئورسانس است ولی زمانی که به بازهای آلی متصل می‌شود خاصیت فلوئورسانس پیدا می‌کند و در مقابل نور UV به رنگ نارنجی دیده می‌شود. با قرار دادن شانه بر روی سینی، ژل را در سینی ریخته و بعد از سرد شدن، ژل در داخل تانک قرار داده می‌شود. سپس نمونه‌های موردنظر برای الکتروفورز درون چاهک‌ها بار‌گذاری می‌شوند. برای بار‌گذاری نمونه‌ها در داخل چاهک‌ها، به نسبت پنج به یک از نمونه و بافر بارگذاری مخلوط و درون چاهک‌ها ریخته می‌شوند. با استفاده از بافر بارگذاری ویسکوزیته نمونه افزایش می‌یابد و انتقال نمونه به چاهک آسان می‌شود. با ایجاد رنگ در نمونه، انتقال آن‌ها به چاهک با اطمینان بیشتری انجام می‌شود. رنگ‌های مورد استفاده در بافر بار‌گذاری، خود نیز باردار شده و همراه نمونه به سمت آند حرکت می‌نمایند.

بعد از انتقال نمونه‌ها به ژل، دستگاه الکتروفورز روشن شده و با ولتاژ ۱۰۰ و به مدت ۴۰ دقیقه الکتروفورز شد. بعد از برقراری ولتاژ، قطعات DNA از سمت قطب منفی به سمت قطب مثبت حرکت می‌نمایند. سرعت حرکت  DNAبا ولتاژ نسبت مستقیم دارد، البته این نسبت خطی نیست. ژل‌ها معمولاً در میدان الکتریکی
V/cm 4-10 الکتروفورز می‌شوند که منظور از سانتیمتر فاصله میان دو الکترود ژل است. اگر شدت میدان الکتریکی از اندازه معمول بالاتر باشد، ژل آگارز تخریب شده و باندهای DNA منتشر می‌شوند. پس از اینکه قطعات DNA به‌اندازه کافی حرکت کردند، دستگاه خاموش و ژل از تانک الکتروفورز خارج می‌شود. سپس درون دستگاه نور ماوراءبنفش گذاشته شده و به‌وسیله دوربین پلاروید از آن عکس تهیه می‌گردد.

 

۳-۱۵- استخراج RNA:

استخراج RNA طبق دستورالعمل ترایزول و طی مراحل زیر انجام شد:

به دنبال شمارش سلول‌های تک‌هسته‌ای، روی رسوب سلول‌های استخــراج شده، مقدار ۱ میلی‌لیتر ترایزول می‌افزاییم، سپس محتویات آن را با سروته کردن میکروتیوب حاوی نمونه‌ها و آپ‌داون کردن نمونه توسط سمپلر، کاملاً هم می‌زنیم. در نهایت نمونه‌ها را در دمای اتاق به مدت ۱۰-۵ دقیقه انکوبه می‌کنیم.

روی نمونه‌ها در حدود ۲۰۰ میکرولیتر (یک‌پنجم مقدار ترایزول) کلروفرم ریخته و به مدت ۱۵ ثانیه با سرعت تمام هم می‌زنیم، سپس به مدت ۵-۲ دقیقه در دمای اتاق انکوبه می‌کنیم.

نمونه‌ها را با سرعت ۱۲۰۰۰g به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ می‌کنیم.

به دنبال سانتریفیوژ نمونه‌ها، ۳ فاز تشکیل می‌شود:

  • فاز بالایی (شفاف رنگ): حاوی RNA
  • فاز میانی (کدر و سفیدرنگ): حاوی DNA
  • فاز پایینی (صورتی رنگ): حاوی پروتئین

فاز بالایی را توسط سمپلر زرد به‌آرامی جدا کرده و به داخل میکروتیوب جدید انتقال می‌دهــیم. در حدود ۴۰۰-۳۰۰ میکرولیتر نمونه خواهد شد.

افزودن ۵۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانول سرد روی نمونه‌ها به‌منظور رسوب دادن RNA انجام می‌شود.

نمونه‌ها را به‌طور محکم هم می‌زنیم و سپس به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌کنیم.

نمونه‌ها را با سرعت ۱۲۰۰۰g به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۸-۲ درجه سانتریفیوژ می‌کنیم.

سپس محلول رویی دور ریخته شده و توسط اتانول ۷۵% (تهیه‌شده توسط DEPC WATER) به مقدار ۱۰۰۰ میکرولیتر شستشو می‌دهیم. (سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه با دور ۷۵۰۰g).

نکته: به دنبال سانتریفیوژ و اضافه کردن محلول‌های ایزوپروپانول و اتانول ریخته شده، توسط شیکر به‌آرامی رسوب را از ته میکروتیوب جدا می‌کنیم و سپس به‌منظور سانتریفیوژ، به داخل دستگاه منتقل می‌کنیم.

در نهایت به دنبال شستشو، به مدت ۲۰-۱۰ دقیقه در زیر هود و در دمای اتاق، درب میکروتیوب‌ها را باز گذاشته تا به‌طور کامل خشک شوند. (در صورت باقی ماندن الکل، کیفیت استخراج پائین خواهد آمد.)

در مرحله آخر، مقدار ۵۰-۳۰ میکرولیتر آب RNase free روی نمونه داخل میکروتیوب اضافه می‌کنیم، همچنین به مدت ۱۰ دقیقه درون بن‌ماری در دمای ۵۶ درجه می‌گذاریم. در نهایت به‌منظور نگهداری RNA استخراج‌شده به یخچال ۷۰- منتقل می‌کنیم.

 

۳-۱۶- ساخت cDNA:

ابتدا تمام وسایل موردنیاز شامل سمپلرها، سرسمپلرها، رک‌ها، میکروتیوب‌ها، دستکش و محلول‌ها استریل شده و زیر هود قرار داده شدند، سپس برای تمام مراحل کار، میکروتیوب‌های موردنظر شماره‌گذاری شدند. مابقی آزمایش طبق روش مندرج در پروتکل کیت شرکت Thermo انجام شد که شامل مراحل زیر می‌باشد:

تمامی مراحل زیر بر روی پک یخ انجام می‌شوند.

افزودن غلظت مناسب RNA به داخل تیوب

به تعداد نمونه‌ها، مقدار مناسبی از استوک مربوط به پرایمرOligo  (برای هر نمونه ۱ میکرولیتر) را در یک میکروتیوب جداگانه درست می‌کنیم.

برای هر نمونه ۱ میکرولیتر پرایمر Oligo اضافه می‌کنیم.

حجم تمام نمونه‌ها را با RNAse water به ۱۲ می‌رسانیم.

نمونه‌ها را به مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار می‌دهیم.

از محلول‌های موردنظر به تعداد نمونه‌ها استوک تهیه می‌کنیم، بطوریکه به ازای هر واکنش، ۴ میکرولیتر Reaction Buffer، ۱ میکرولیتر Ribolock، ۲ میکرولیتر dNTP و ۱ میکرولیتر آنزیم RT اضافه می‌کنیم. قبل از اضافه کردن محلول‌ها، آن‌ها را به‌آرامی مخلوط و سانتریفیوژ می‌کنیم.

به دنبال تهیه استوک محلول‌ها، برای هر نمونه به مقدار ۸ میکرولیتر از استوک اضافه می‌کنیم.

در نهایت نمونه‌ها را توسط اسپینر، اسپین می‌کنیم تا نمونه‌ها در کف میکروتیوب جمع گردند.

قبل از قرار دادن در دستگاه ترموسایکلر، دستگاه را طبق پروتکل خودمان که شامل مراحل زیر می‌باشد، تنظیم می‌کنیم:

  • مرحله اول: ۴۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۶۰ دقیقه
  • مرحله دوم: ۷۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه

در نهایت نمونه‌ها را از دستگاه ترموسایکلر درآورده و در یخچال فریزر در دمای ۲۰- نگهداری می‌کنیم.

 

۳-۱۷- تکنیک Real-time PCR:

تفاوت اصلی این روش با PCR معمولی در این است که PCR معمولی تنها نقطه پایان قابل بررسی و گزارش است، در صورتی که در Real-time PCR امکان مشاهده پیشرفت مرحله به مرحله (به عبارتی سیکل به سیکل) وجود دارد. اصول انجام روش Real-Time PCR بر مبنای خاصیت فلوروسنت استوار است؛ بدین ترتیب که با اندازه‌گیری فلوروسانس ایجادشده در هر مرحله پیشروی واکنش قابل اندازه‌گیری است.

استفاده از رنگ SYBER Green مهم‌ترین، پرکاربردترین و معمول‌ترین روش‌های انجام Real-time PCR است. رنگ SYBER Green از طریق اتصال به شیار کوچک DNA دو رشته‌ای، نور فلوروسانس منتشر می‌کند. به همین لحاظ هرچه واکنش پیش می‌رود و محصول بیشتر تکثیر می‌یابد SYBER Green به میزان بیشتری قادر به اتصال به محصول DNA بوده و در نتیجه میزان فلورسانس افزایش خواهد یافت. در این روش از ژن بتا اکتین برای نرمالیزه کردن میزان بیان ژن در مقایسه دو گروه کنترل و گروه تحت تیمار استفاده می‌گردد، زیرا بیان ژن بتا اکتین در سلول ثابت است.

رنگ SYBER Green به‌طور غیراختصاصی به دایمر-پرایمرهای موجود در ظرف واکنش متصل می‌شود که باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب می‌شود. راه‌حل این مشکل استفاده از نمودار دمای ذوب (Melting Curve) است. برای رسم این نمودار بعد از اتمام واکنش، دما به‌تدریج از ۵۰ درجه سانتی‌گراد به ۹۵ درجه سانتیگراد افزایش می‌یابد. دردمای پایین تمام DNA دو رشته‌ای است و فلورسانس حداکثر مقدار را دارد، اما با گذشت زمان و افزایش دما، فلورسانس به دلیل دناتوره شدن DNA دو رشته کم می‌شود، به‌طوریکه در نهایت به صفر می‌رسد. با توجه به این‌که هر محصولی از PCR ازلحاظ توالی، طول مختص به خود را دارد، در نتیجه در دمای متفاوت و اختصاصی ذوب شده و باعث تولید یک پیک اختصاصی می‌شود. با استفاده از منحنی ذوب وجود دایمر –پرایمر و یا هرگونه محصول غیراختصاصی با ایجاد پیک‌های متفاوت مشخص می‌شود .این نمودار صحت و اعتبار واکنش و محصول بدست‌آمده را تأیید می‌کند (۵۴).

 سندرم بهجت

شکل ۳-۵: اصول انجام Real-time PCR به روش SYBER Green

الف) در مرحله دناتوراسیون، در اثر حرارت پیوندهای هیدروژنی بین بازهای مکمل، دو زنجیره DNA شکسته شده و دو زنجیره جدا از هم تشکیل می‌گردد. ازآنجایی که تمام DNA به‌صورت تک‌رشته‌ای است هیچ SYBER Greenی به DNA اتصال نمی‌یابد، چون SYBER Green فقط قادر به اتصال به DNA دو رشته‌ای است و لذا هیچ فلورسانسی منتشر نمی‌کند. ب) در مرحــله اتصال پرایمر به DNA به‌تدریج SYBER Green به پرایمر و DNA سنتزشده اتصال یافته و نشر فلورسانس آغاز می‌شود ج) در مرحله تکثیر که طول DNA دو رشته به‌تدریج افزایش می‌یابد، میزان اتصال SYBER Green نیز بیشتر شده و در نتیجه فلورسانس بیشتری منتشر می‌گردد.

مراحل انجام Real-time PCR:

بعد از آماده‌سازی مخلوط فوق، برنامه زیر به دستگاه داده شد:

 

جدول ۳-۳: مراحل و دمای استفاده شده در Real-time PCR

 

۳-۱۸- آنالیز اطلاعات بیان ژنی

سیکل آستانه (CT) برای هر نمونه محاسبه شد. میزان بیان در هر نمونه بــــرای ژن‌های BCL2، BAX و β-actin با استفاده از مقدارهای CT محاسبه شد. بیان ژن BCL2 و BAX نسبت به بیان ژن β-actin اندازه گرفته و در واقع نرمالیزه شد. مقادیر نرمالیزه (واحد نسبی) توسط نمونه‌های کنترل هر آزمایش استانداردسازی شدند. مقادیر تغییریافته بیان ژن‌های BCL2 و BAX در نمونه‌های تیمارشده نسبت به نمونه‌ی کنترل که به‌وسیله‌ی میزان بیان ژن β-actin نرمالیزه شده است، با استفاده از روش –ΔΔCT 2 محاسبه شد.

فرمول‌های محاسبات به شرح ذیل است:

ΔCT = CTtarget – CTreference

ΔΔCT = ΔCTtest sample – ΔCTcontrol sample

Relative expression: 2 –ΔΔCT

 

۳-۱۸-۱٫ رسم منحنی استاندارد

برای رسم منحنی استاندارد از یکی از نمونه‌های cDNA با نسبت‌های ۱ به ۵ رقت سریال تهیه نموده و طبق شرایط ذکرشده در جدول ۴ عمل شد.

 

۳-۱۹- ملاحظات اخلاقی:

این مطالعه روی بیماران مبتلا به سندرم بهجت (بر اساس معیارهای تشخیصی ICBD) مراجعه‌کننده به پزشک متخصص روماتولوژی، در بیمارستان امام رضا و کلینیک درمانی آتیه در سال‌های ۹۶-۹۴ انجام شد. با مشورت مشاور آماری طرح، تعداد نفرات مورد مطالعه ۴۰ نفر از افراد مبتلا و ۶۰ نفر گروه کنترل فاقد بیماری بهجت مراجعه‌کننده به آزمایشگاه به‌طور تصادفی انتخاب شدند. قبل از خون‌گیری تمامی افراد مورد مطالعه از روند تحقیق آگاه شده و از آن‌ها به‌منظور حفظ و رعایت اخلاق در تحقیق، فرم رضایت‌نامه گرفته شد.

در ابتدای مطالعه اهداف به‌طور کامل به بیماران توضیح داده شد و فرم رضایت‌نامه کتبی توسط افراد شرکت‌کننده در مطالعه تکمیل شد. اطلاعات دریافت شده کاملاً محرمانه بوده و در صورت عدم تمایل فرد به ادامه همکاری هیچ‌گونه محدودیتی وجود نداشت.

 

فصل چهارم:

نتایج

 

جمع‌آوری داده‌های عمومی پژوهش بر اساس فرم جمع‌آوری اطلاعات گروه‌های مختلف بیماران صورت گرفت و جمع‌آوری نتایج و داده‌های دو گروه از طریق آزمایش‌های ذکرشده در فصول قبل. تجزیه و تحلیل داده‌ها از طریق نرم‌افزار SPSS20 و با استفاده از آزمون‌های آماری Tukey’s test و کای دو انجام پذیرفت.

 

۴-۱ نتیجه بررسی نمونه‌های استخراج شده

DNA و RNA به ترتیب با استفاده از ترایزول و پروتکل RGDE[9] استخراج شده و با استفاده از دستگاه نانودراپ مقدار و خلوص DNA تعیین و جذب نوری (OD: optical density) در طول‌موج‌های مشخص شده و نمونه‌هایی که نسبت  ، میان ۲/۳- ۱/۸ و نسبت ، میـان ۱/۹- ۱/۷ داشتند جهت انجام Real-time PCR و qMSP استفاده شدند (جدول ۴-۱).

 

 

جدول ۴-۱: برخی از مقادیر ۲۸۰/۲۶۰ OD و غلظت Total DNA استخراج شده

 سندرم بهجت

شکل ۴-۱: مربوط به منحنی OD نمونه‌های داده شده توسط دستگاه نانودراپ

 

همانطوریکه در شکل ۴-۲ نیز مشخص می‌باشد، یکی از نمونه‌های سنجیده شده، جهت تأیید در اینجا آورده شده است. غلظت آن ۲۸۹ نانوگرم در هر میکرولیتر می‌باشد و مقدار ODی ۲۶۰/۲۸۰ آن نیز در حدود ۱٫۹ می‌باشد.

 سندرم بهجت

شکل ۴-۲: منحنی OD نمونه‌های داده شده به دستگاه نانودراپ

همچنین برخی از نمونه‌های استخراج‌شده به‌منظور بررسی کیفیت نمونه‌های RNA توسط ژل الکتروفورز مورد بررسی قرار می‌گیرد. بدین منظور از ژل آگارز ۲ درصد استفاده خواهد شد.

 سندرم بهجت

شکل ۴-۳: تصویر ژل الکتروفورز

ستون اول لدر، ستون‌های ۱ تا ۶ نمونه‌های RNAی جداسازی شده می‌باشند. این آزمایش به‌منظور نشان دادن کیفیت RNAهای استخراج شده انجام‌ شده است. همانطوریکه در شکل نیز مشخص می‌باشد، باندهای ۲۸SrRNA و ۱۸srRNA کاملاً واضح می‌باشند

۴-۲ نتایج Real-time PCR مربوط به نمونه‌های متیله و غیرمتیله در qMSP:

به دنبال انجام Real-time، نتایج آن مورد آنالیز و ارزیابی قرار گرفته و در صورت داشتن هرگونه ایراد، آن‌ها دوباره تکرار شدند. همچنین تمامی نمونه‌ها به‌صورت تریپلیکیت (سه باره) انجام شدند.

به‌منظور آنالیز دقیق Real-time، از نمودارها و اشکال مربوط به تشعشع فلورسانت، شکل‌های مربوط به اعداد CT و نمودار دمای ذوب (Melting Curve) استفاده شد. همانطوریکه در شکل مربوط به فلورسانت مشخص می‌باشد، این اشکال بایستی به‌صورت سیگموئیدی و شارپ برای هر نمونه باشد (شکل ۴-۴). در این شکل هرچقدر مقادیر اولیه (copy number) بیشتر باشد، نمودار زودتر شروع به بالا رفتن می‌کند. در همین راستا، شکل و نمودار مربوط به اعداد CT نیز به همین منوال می‌باشد، به‌صورتی‌ که در مورد نمونه‌های غیرمتیله (بیشتر در نمونه‌های گروه کنترل)، از آنجایی که در این ژن یعنی Bax بیشتر به‌صورت غیرمتیله بوده، مقادیر (میزان بیان) آن‌ها بالا بوده و CTی آن‌ها کوچک‌تر (سریع‌تر بالا می‌روند) می‌باشد (شکل ۴-۵).

 سندرم بهجت

شکل ۴-۴: منحنی مربوط به cycling green در پرایمرهای متیله و غیرمتیله

 

 سندرم بهجت

شکل ۴-۵: منحنی مربوط به اعداد CT (Cycling threshold) در نمونه‌ها با پرایمرهای متیله و غیرمتیله

 

شکل و نمودار مربوط به دمای ذوب (شکل ۴-۶) به‌عنوان یکی از مهم‌ترین خروجی‌های مربوط به Real-time می‌باشد. این شکل نشان‌دهنده اختصاصیت پرایمرهای مورد استفاده در PCR می‌باشد. همانطوریکه در شکل پایین نیز مشخص می‌باشد، در این آزمایش، برای تک‌تک نمونه‌ها، از دو جفت پرایمر متیله و غیرمتیله استفاده گردید. همانطوریکه در شکل پایین نیز مشخص است، برای بیشتر نمونه‌ها پرایمرهای غیرمتیله کاملاً اختصاصی چسبیده و دارای پیک‌های شارپ می‌باشند؛ یعنی اینکه اکثر نمونه‌ها، به‌صورت غیرمتیله می‌باشند.

 سندرم بهجت

شکل ۴-۶: نمودار مربوط به Melting curve که نشان‌دهنده اختصاصیت پرایمرها و نمونه‌های موردنظر است

 

 سندرم بهجت

شکل ۴-۷: نمودار HRM مربوط به پرایمرها و محصولات (متیله و غیرمتیله)

 

 

 

جدول ۴-۲: جدول خروجی مربوط به برخی از نمونه‌ها و مقادیر efficiency در Real-time

 سندرم بهجت

همچنین با توجه به اینکه این دستگاه قابلیت این را دارد که برای تک‌تک نمونه‌ها Efficiency جداگانه‌ای را با توجه به Slope منحنی‌ها بکشد، درنتیجه دیگر نیازی به رسم منحنی استاندارد به‌منظور پیدا کردن میزان Efficiency برای کل آزمایش نیست.

 

۴-۳ نتایج مربوط به اطلاعات دموگرافیک و بالینی بیماران:

بر اساس تجزیه و تحلیل داده‌های دموگرافیک، تفاوت معنی‌داری در میانگین سن و همچنین جنس در بین دو گروه بیماران مبتلا به بهجت و افراد سالم مشاهده نگردید؛ در گروه بیماران ۲۴ نفر مرد و ۱۶ نفر زن وجود داشت که میانگین سنی آن‌ها در حدود ۱۰٫۲۵± ۳۸٫۲ بود. در گروه سالم ۳۷ نفر مرد و ۲۳ نفر زن حضور داشتند که میانگین سنی آن‌ها ۸٫۵ ± ۳۷٫۴بود (جدول ۴-۳).

جدول ۴-۳: اطلاعات دموگرافیک و مشخصات بالینی افراد بیمار و گروه سالم

 

۴-۴ میزان بیان ژن‌ها و متیلاسیون Bax و Bcl2:

به‌منظور آنالیز مقایسه میانگین بیان ژن و میزان متیلاسیون با توجه به نرمال بودن توزیع مقادیر مربوط به بیان ژن و میزان متیلاسیون در ژن‌های Bax و Bcl2، از آزمون تی مستقل (independent samples T-test) استفاده گردید. در مورد ژن Bax، نتایج مشخص کرد که میانگین بیان ژن در گروه بیمار (۰٫۱۳±۰٫۸۹) و در گروه سالم (۰٫۱۲±۱٫۹۳) بود که با همدیگر اختلاف معنی‌دار آماری داشتند (p<0.05) (نمودار ۴-۱). همچنین میزان متیلاسیون در گروه بیمار (۰٫۲۴±۵٫۶۸) و در گروه سالم (۰٫۱۷±۳٫۲) بود که با همدیگر اختلاف معنی‌دار آماری داشتند (p<0.001) (نمودار ۴-۲).

 سندرم بهجت

نمودار ۴-۱: میزان بیان ژن Bax

مقایسه میزان بیان ژن Bax در دو گروه افراد با بیماری بهجت و گروه افراد سالم بر اساس جنسیت، مشخص کرد که میزان بیان ژن در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم کاهش دارد

 

 سندرم بهجت

نمودار ۴-۲: میزان متیلاسیون Bax

مقایسه میزان متیلاسیون Bax در دو گروه افراد با بیماری بهجت و گروه افراد سالم بر اساس جنسیت مشخص کرد که میزان متیلاسیون در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم افزایش دارد

 

در مورد ژن Bcl2، نتایج مشخص کرد که میانگین بیان ژن در گروه بیمار (۰٫۷۶±۲٫۷۷) و در گروه سالم (۰٫۶۵±۲٫۶۲) بود که با همدیگر اختلاف معنی‌دار آماری نداشتند (p>0.05) (نمودار ۴-۳)؛ اما میزان متیلاسیون در گروه بیمار (۰٫۴۸±۱٫۷۷) و در گروه سالم (۰٫۴۳±۲٫۰۸) بود که با همدیگر اختلاف معنی‌دار آماری نداشتند (p>0.05) (نمودار ۴-۴).

 سندرم بهجت

نمودار ۴-۳: میزان بیان ژن Bcl2

مقایسه میزان بیان ژن Bcl2 در دو گروه افراد با بیماری بهجت و گروه افراد سالم مشخص کرد که میزان بیان ژن در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم هیچ‌گونه تغییری نشان نداده است

 

 سندرم بهجت

نمودار ۴-۴: میزان متیلاسیون Bcl2

مقایسه میزان متیلاسیون Bcl2 در دو گروه افراد با بیماری بهجت و گروه افراد سالم مشخص کرد که میزان متیلاسیون در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم تفاوت معنی‌دار آماری نداشت

 

۴-۵ ارتباط میزان بیان ژن و متیلاسیون با مشخصات کلینیکوپاتولوژی بیماران:

در نمونه‌های بیمار، ما به بررسی ارتباط میان بیان ژن و میزان متیلاسیون با مشخصات بالینی نیز پرداختیم. همانطوری که نتایج نشان داده است، میزان بیان ژن فقط از نظر شدت بیماری بهجت (severe BD) با همدیگر اختلاف معنی‌داری دارند، بطوری که در افراد با severe BD مثبت نسبت به افراد گروه منفی کاهش معنی‌دار نشان داده است (p-value<0.05). همچنین نتایج مشخص کرد که میزان متیلاسیون در هیچ‌کدام از زیرگروه‌های اشاره‌شده در جدول، تفاوت معنی‌داری نداشتند (p-value>0.05) (جدول ۴-۴).

 

جدول ۴-۴: ارتباط میزان بیان ژن و متیلاسیون آن با مشخصات بالینی و آزمایشگاهی بیماران

 

با توجه به نتایج مربوط به میزان بیان و متیلاسیون Bax در این مطالعه، ممکن است که یکی از مکانیسم‌های تنظیمی دخیل در تنظیم بیان ژن، متیلاسیون ژن باشد، با توجه به اینکه در گروه بیمار با کاهش میزان بیان Bax، میزان متیلاسیون آن افزایش نشان داده است (هایپرمتیلاسیون)، درصورتی‌که در افراد گروه سالم با افزایش میزان بیان ژن Bax، میزان متیلاسیون آن‌ها در مقایسه با افراد گروه بیمار کاهش نشان می‌دهد (هیپومتیلاسیون)، همچنین همین نتایج در مورد ارتباط میزان بیان ژن، متیلاسیون آن و ویژگی‌های بالینی صدق می‌کند، بطوریکه در مورد بیماران با شدت بالا (مربوط به مشخصه بالینی Severe BD)، میزان بیان ژن آن‌ها کاهش نشان داد. درصورتی‌که در مورد افراد با شدت بیماری پایین این نتایج برعکس می‌باشد (جدول ۴-۴). همچنین در مورد شاخص سن، همانطوریکه در جدول نیز مشخص می‌باشد، با افزایش سن بیماران از ۴۵، میزان بیان ژن Bax در آن‌ها کاهش یافته اما میزان متیلاسیون در این افراد افزایش نشان داده است، بطوریکه این افزایش نسبت به افراد با سن کمتر از ۴۵ سال معنی‌دار بود.

 

فصل پنجم:

بحث و نتیجه‌گیری

 

اعتقاد بر این است که بیماری بهجت با فاکتورهای محیطی مثل عوامل میکروبی در افراد دارای زمینه ژنتیکی خاص شروع می‌شود. واکنش متقابل بین ژنتیک و فاکتورهای محیطی ممکن است اساس بیماری‌زایی در افراد مبتلا به این بیماری باشد. شیوع سندرم بهجت عمدتاً در کشورهایی است که در طول جاده ابریشم قرار گرفته‌اند (۷۴, ۷۵). تحقیقات اخیر نشان داده است که علاوه بر ژنتیک، شواهدی قوی مبنی بر نقش اپی‌ژنتیک در پاتوژنز بیماری‌های خود ایمنی وجود دارد. اپی‌ژنتیک به درک و شناخت بیماری‌های پیچیده کمک می‌کند (۷۶). یکی از بیومارکرهای اپی‌ژنتیکی که به‌خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است، متیلاسیونDNA  است. مطالعات اپیژنتیکی در جمعیت‌های مختلف نشان داده است که بین فاکتورهای کلینیکوپاتولوژیک و الگوی متیلاسیون ژنوم ارتباط وجود دارد (۷۷).

سایتوکاین‌ها نقش بسیار حیاتی در ایمنی ذاتی و اکتسابی بازی می‌کنند. با این حال، افزایش سایتوکاین‌ها یا اختلال سیگنالینگ آن‌ها موجب بیماری‌های مختلفی مانند آلرژی، بیماری‌های خودایمنی، التهابی و سرطانی می‌گردد. مطالعات قبلی به‌طور واضحی به اهمیت و نقش محوری سایتوکاین‌ها در پاتوفیزیولوژی بیماری بهجت اشاره کرده‌اند. بیماری بهجت به‌عنوان یک بیماری خودالتهابی، به‌طور عمده توسط التهاب چشم، آفت‌های دهانی و ژنیتال و زخم‌های پوستی طبقه‌بندی شده است.

نتایج مربوط به فراوانی اطلاعات بالینی-آزمایشگاهی مشخص کرد که بیشترین فراوانی مربوط به علائم بالینی مربوط به آفت‌های دهانی بود که در حدود ۹۵% از افراد مثبت گزارش شد، ضمن اینکه مشخص شد که در حدود ۶۳% افراد از نظر دارا بودن شدت علائم (Severe BD) و ۴۹ درصد نیز از نظر زخم‌های ژنیتال مثبت بودند.

 

در مطالعه کنونی ۴۰ بیمار مبتلا به بیماری بهجت با محدوده سنی ۶۰-۱۶ سال بودند، سطح متیلاسیون پروموتر ژن‌های Bax و Bcl2 و ارتباط آن‌ها با مشخصات کلینیکوپاتولوژی و عوامل خطر مانند جنسیت، شدت بیماری و مارکرهای التهابی مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج مشخص کرد که میزان بیان ژن Bax در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم کاهش دارد، در صورتی که میزان بیان ژن Bcl2 در دو گروه افراد با بیماری بهجت و گروه افراد سالم مشخص کرد که میزان بیان ژن در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم هیچ‌گونه تغییری نشان نداده است. همچنین میزان متیلاسیون Bax در افراد مبتلا به بهجت در مقایسه با افراد گروه سالم افزایش نشان داد (هایپرمتیلاسیون)، در صورتی که میزان بیان Bcl2 در دو گروه افراد با بیماری بهجت و گروه افراد سالم مشخص کرد که میزان متیلاسیون در گروه افراد بیمار نسبت به گروه سالم تفاوت معنی‌دار آماری نداشت. در یک مطالعه که توسط Itoh J انجام شد، نتایج نشان دادند که میزان بیان Bax به‌عنوان یکی از پروتئین‌های آپوپتوز، در سلول‌های مختلف T یعنی سلول‌های خون محیطی با مخاطی در بیماران مبتلا به کرون و کولیت متفاوت می‌باشد، بطوریکه در سلول‌های خون محیطی نسبت به سلول‌های مخاطی افزایش نشان داده بود. ضمن اینکه میزان بیان آن در بیماران کرون نسبت به افراد سالم کاهش نشان داده بود، درحالکیه در افراد مبتلا به کولیت بدون تغییر باقی مانده بود (۷۳). در یک مطالعه دیگر توسط Lee Yeong مشخص گردید که بیان Bax به‌عنوان پروتئین پیش‌التهابی کاهش یافته، درحالی‌که میزان بیان Bcl2 به‌عنوان فاکتور آنتی‌آپوپتوز در فیبروبلاست‌های بیماران مبتلا به آرتریت روماتوئید در مقایسه با بیماران استئوآرتریتی افزایش نشان داده بود (۷۱). در یک مطالعه دیگر توسط Xinxin Wang و همکاران مشخص گردید که بیان ژن‌های Fas، Bax و Bcl2 در گروه استئوآرتریت نسبت به گروه سالم با استفاده از تکنیک ایمونوهیستوشیمی افزایش نشان می‌دهد و همچنین میزان متیلاسیون مربوط به جایگاه پروموتر در این ژن‌ها کاهش نشان داده بود که احتمال دارد این کاهش متیلاسیون منجر به افزایش بیان ژن‌های موردنظر باشد و از این طریق در آپوپتوز سلول‌های کندروسیت دخالت داشته باشند (۷۲).

با توجه به نتایج مطالعه ما و سایر مطالعات، ژن‌های دخیل در آپوپتوز از طریق دخالت در تنظیم مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول‌های درگیر در سیستم ایمنی و بیماری‌های ایمنی، می‌توانند منجر به ایجاد بیماری و یا تشدید آن گردند. آثار ناشی از آپوپتوز وابسته به محیطی است که در آن مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول رخ می‌دهد. سایتوکاین‌های مختلفی می‌توانند در راه‌اندازی این فرآیند پیچیده واسطه‌گری کنند که از آن جمله می‌توان به انترفرون‌ها، TNF-α و IL-1β اشاره کرد (۷۸, ۷۹). امروزه با به‌کارگیری ژن‌های القاکننده آپوپتوز و در مواردی با به‌کارگیری ژن‌های مهارکننده این فرآیند، هدایت سیستم ایمنی به سمت دلخواه در تعادل میان پاسخ‌های ایمنی سلولی و هومورال به‌کار گرفته می‌شود. همچنین از این ژن‌ها در درمان سرطان، بیماری‌های خودایمنی و آلرژی استفاده می‌گردد (۸۰-۸۳).

.

نتیجه‌گیری نهایی:

با توجه به نتایج مربوط به میزان بیان و متیلاسیون Bax در این مطالعه، ممکن است یکی از مکانیسم‌های تنظیمی دخیل در تنظیم بیان ژن، متیلاسیون ژن باشد. با توجه به اینکه در گروه بیمار با کاهش میزان بیان Bax، میزان متیلاسیون آن‌ها نیز تغییر پیدا کرده بودند، بطوریکه میزان متیلاسیون Bax در افراد گروه بیمار افزایش نشان داده است (هایپرمتیلاسیون) درصورتی‌که در افراد گروه سالم با افزایش میزان بیان Bax، میزان متیلاسیون آن‌ها در مقایسه با افراد گروه بیمار کاهش نشان می‌دهد (هیپومتیلاسیون)، درحالی‌که میزان بیان ژن و متیلاسیون مربوط به ژن Bcl2 در گروه بیمار نسبت به افراد سالم تغییر چشمگیری به دنبال نداشت، همچنین نتایج مربوط به ارتباط میزان بیان ژن، متیلاسیون آن و ویژگی‌های بالینی صدق می‌کند، بطوریکه در مورد Bax، در بیماران با شدت بالا، میزان بیان ژن آن‌ها کاهش نشان داده و به دنبال آن میزان متیلاسیون آن‌ها افزایش دارد. درصورتی‌که در مورد افراد با شدت بیماری پایین، این نتایج برعکس می‌باشد، همچنین با توجه به نتایج بدست‌آمده، شاید بتوان با توجه به میزان بیان ژن و الگوی متیلاسیون Bax در سنین مختلف روش‌های تشخیصی مناسبی را ارائه داد.

 

پیشنهاد‌ها:

  • بررسی این مطالعه با حجم نمونه بیشتر و همچنین در دیگر نژادها و اقوام ایرانی و مقایسه آن‌ها با همدیگر
  • بررسی میزان متیلاسیون و بیان ژن سایر ژن‌های درگیر در مسیر آپوپتوز در بیماران و مقایسه آن‌ها با افراد سالم
  • بررسی میزان متیلاسیون ژن‌های آپوپتوز از طریق روش‌های دقیق‌تر مانند توالی‌یابی آن‌ها
  • بررسی تغییرات بیان ژن و متیلاسیون ژن‌های درگیر در آپوپتوز در مدل‌های جانوری که در آن‌ها برخی از ژن‌ها ناک‌اوت شده
  • بررسی تغییرات بیان ژن‌های درگیر در مسیر التهاب در رده‌های سلولی مختلف و مقایسه آن‌ها در افراد مبتلا به بهجت

 

References:

  1. Hirohata S, Kikuchi H. Behçet’s disease. Arthritis Res Ther. 2003;5(3):1.
  2. Imamura Y, Kurokawa M, Yoshikawa H, Nara K, Takada E, Masuda C, et al. Involvement of Th1 cells and heat shock protein 60 in the pathogenesis of intestinal Behcet’s disease. Clinical & Experimental Immunology. 2005;139(2):371-8.
  3. Annunziato F, Cosmi L, Liotta F, Maggi E, Romagnani S. Type 17 T helper cells—origins, features and possible roles in rheumatic disease. Nature Reviews Rheumatology. 2009;5(6):325-31.
  4. Mizuki N, Ota M, Katsuyama Y, Yabuki K, Ando H, Goto K, et al. Association analysis between the MIC-A and HLA-B alleles in Japanese patients with Behcet’s disease. Arthritis & Rheumatism. 1999;42(9):1961-6.
  5. Akman-Demir G, Tüzün E, İçöz S, Yeşilot N, Yentür SP, Kürtüncü M, et al. Interleukin-6 in neuro-Behçet’s disease: association with disease subsets and long-term outcome. Cytokine. 2008;44(3):373-6.
  6. Chi W, Zhu X, Yang P, Liu X, Lin X, Zhou H, et al. Upregulated IL-23 and IL-17 in Behcet patients with active uveitis. Investigative ophthalmology & visual science. 2008;49(7):3058-64.
  7. Liu X, Yang P, Wang C, Li F, Kijlstra A. IFN-α blocks IL-17 production by peripheral blood mononuclear cells in Behçet’s disease. Rheumatology. 2010:keq330.
  8. Sugita S, Kawazoe Y, Imai A, Yamada Y, Horie S, Mochizuki M. Inhibition of Th17 differentiation by anti-TNF-alpha therapy in uveitis patients with Behcet’s disease. Arthritis research & therapy. 2012;14(3):1.
  9. Murray PJ. The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration. The Journal of Immunology. 2007;178(5):2623-9.
  10. O’Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAKs and STATs in immunity, immunodeficiency, and cancer. New England Journal of Medicine. 2013;368(2):161-70.
  11. O’Shea JJ, Plenge R. JAK and STAT signaling molecules in immunoregulation and immune-mediated disease. Immunity. 2012;36(4):542-50.
  12. Durant L, Watford WT, Ramos HL, Laurence A, Vahedi G, Wei L, et al. Diverse targets of the transcription factor STAT3 contribute to T cell pathogenicity and homeostasis. Immunity. 2010;32(5):605-15.
  13. Kim J, Park J, Lee E, Lee Y, Song Y, Lee E. Imbalance of Th17 to Th1 cells in Behcet’s disease. Clin Exp Rheumatol. 2010;28(4 Suppl 60):S16-9.
  14. Cooney RN. Suppressors of cytokine signaling (SOCS): inhibitors of the JAK/STAT pathway. Shock. 2002;17(2):83-90.
  15. Sadreddini S, Noshad H, Molaeefard M, Noshad R. Treatment of retinal vasculitis in Behcet’s disease with rituximab. Modern Rheumatology. 2008;18(3):306-8.
  16. Lee S, Kim B, Kim T, Kim W. Differential diagnosis of intestinal Behcet’s disease and Crohn’s disease by colonoscopic findings. Endoscopy. 2009;41(1):9-16.
  17. Khabbazi A, Noshad H, Shayan FK, Kavandi H, Hajialiloo M, Kolahi S. Demographic and clinical features of Behcet’s disease in Azerbaijan. International journal of rheumatic diseases. 2014.
  18. Abdel Galil SM, Hagrass HA. The Role of CTLA-4 Exon-1 49 A/G Polymorphism and Soluble CTLA-4 Protein Level in Egyptian Patients with Behçet’s Disease. BioMed Research International. 2014;2014.
  19. Vaccarino L, Triolo G, Accardo-Palombo A, Scola L, Palmeri M, Bova M, et al. Pathological Implications of Th1/Th2 Cytokine Genetic Variants in Behçet’s Disease: Data from a Pilot Study in a Sicilian Population. Biochemical genetics. 2013;51(11-12):967-75.
  20. Idil A, Gürler A, Boyvat A, Caliskan D, Özdemir Ö, Isik A, et al. The prevalence of Behçet’s disease above the age of 10 years The results of a pilot study conducted at the Park Primary Health Care Center in Ankara, Turkey. Ophthalmic Epidemiology. 2002;9(5):325-31.
  21. Azizlerli G, Akdağ Köse A, Sarıca R, Gül A, Tutkun İT, Kulaç M, et al. Prevalence of Behçet’s disease in Istanbul, Turkey. International journal of dermatology. 2003;42(10):803-6.
  22. Sakane T, Takeno M, Suzuki N, Inaba G. Behçet’s disease. New England Journal of Medicine. 1999;341(17):1284-91.
  23. Poon W, Verity D, Larkin G, Graham E, Stanford M. Behçet’s disease in patients of west African and Afro-Caribbean origin. British journal of ophthalmology. 2003;87(7):876-8.
  24. Tursen U, Gurler A, Boyvat A. Evaluation of clinical findings according to sex in 2313 Turkish patients with Behçet’s disease. International journal of dermatology. 2003;42(5):346-51.
  25. Bang D, Lee JH, Lee ES, Lee S, Choi JS, Kim YK, et al. Epidemiologic and clinical survey of Behcet’s disease in Korea: the first multicenter study. Journal of Korean medical science. 2001;16(5):615.
  26. Koné-Paut I, Geisler I, Wechsler B, Ozen S, Ozdogan H, Rozenbaum M, et al. Familial aggregation in Behçet’s disease: high frequency in siblings and parents of pediatric probands. The Journal of pediatrics. 1999;135(1):89-93.
  27. Yesudian P, Edirisinghe D, O’Mahony C. Behçet’s disease. International journal of STD & AIDS. 2007;18(4):221-7.
  28. Mizuki N, Ota M, Katsuyama Y, Yabuki K, Ando H, Shiina T, et al. HLA‐B* 51 allele analysis by the PCR‐SBT method and a strong association of HLA‐B* 5101 with Japanese patients with Behçet’s disease. Tissue Antigens. 2001;58(3):181-4.
  29. Ota M, Mizuki N, Katsuyama Y, Tamiya G, Shiina T, Oka A, et al. The critical region for Behcet disease in the human major histocompatibility complex is reduced to a 46-kb segment centromeric of HLA-B, by association analysis using refined microsatellite mapping. The American Journal of Human Genetics. 1999;64(5):1406-10.
  30. Kaneko F, Oyama N, Yanagihori H, Isogai E, Yokota K, Oguma K. The role of streptococcal hypersensitivity in the pathogenesis of Behçet’s disease. European Journal of Dermatology. 2008;18(5):489-98.
  31. Ergun T, Gürbüz O, Harvell J, Jorizzo J, White W. The histopathology of pathergy: a chronologic study of skin hyperreactivity in Behçet’s disease. International journal of dermatology. 1998;37(12):929-33.
  32. Inaloz HS, Evereklioglu C, Unal B, Kirtak N, Eralp A, Inaloz S. The significance of immunohistochemistry in the skin pathergy reaction of patients with Behçet’s syndrome. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 2004;18(1):56-61.
  33. Masuda K, Urayama A, Kogure M, Nakajima A, Nakae K, Inaba G. Double-masked trial of cyclosporin versus colchicine and long-term open study of cyclosporin in Behçet’s disease. The Lancet. 1989;333(8647):1093-6.
  34. Kurokawa MS, Yoshikawa H, Suzuki N, editors. Behcet’s disease. Seminars in respiratory and critical care medicine; 2004: Copyright© ۲۰۰۴ by Thieme Medical Publishers, Inc., 333 Seventh Avenue, New York, NY 10001, USA.
  35. Pay S, Şimşek İ, Erdem H, Dinç A. Immunopathogenesis of Behçet’s disease with special emphasize on the possible role of antigen presenting cells. Rheumatology international. 2007;27(5):417-24.
  36. Hirohata S, Hashimoto T. Abnormal T cell responses to bacterial superantigens in Behçet’s disease (BD). Clinical and experimental immunology. 1998;112(2):317-24.
  37. Mendes D, Correia M, Barbedo M, Vaio T, Mota M, Gonçalves O, et al. Behçet’s disease–a contemporary review. Journal of autoimmunity. 2009;32(3):178-88.
  38. Zhou Z, Chen S, Shen N, Lu Y. Cytokines and Behcet’s disease. Autoimmunity reviews. 2012;11(10):699-704.
  39. Dilek K, O# zcimen A, Saricaoglu H, Saba D, Yucel A, Yurtkuran M, et al. Cytokine gene polymorphisms in Behçet’s disease and their association with clinical and laboratory findings. Clinical and Experimental Rheumatology-Including Supplements. 2009;27(2):S73.
  40. Dalghous A, Freysdottir J, Fortune F. Expression of cytokines, chemokines, and chemokine receptors in oral ulcers of patients with Behcet’s disease (BD) and recurrent aphthous stomatitis is Th1‐associated, although Th2‐association is also observed in patients with BD. Scandinavian journal of rheumatology. 2006;35(6):472-5.
  41. Hamzaoui K, Hamzaoui A, Guemira F, Bessioud M, Hamza MH, Ayed K. Cytokine profile in Behçet’s disease patients. Scandinavian journal of rheumatology. 2009.
  42. Mantas C, Direskeneli H, Oz D, Yavuz S, Akoglu T. IL-8 producing cells in patients with Behcet’s disease. Clinical and experimental rheumatology. 2000;18(2):249-51.
  43. Ishizu T, Osoegawa M, Mei F-J, Kikuchi H, Tanaka M, Takakura Y, et al. Intrathecal activation of the IL-17/IL-8 axis in opticospinal multiple sclerosis. Brain. 2005;128(5):988-1002.
  44. Matsui T, Kurokawa M, Kobata T, Oki S, Azuma M, Tohma S, et al. Autoantibodies to T cell costimulatory molecules in systemic autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 1999;162(7):4328-35.
  45. Sadoul R, Quiquerez AL, Martinou I, Fernandez P, Martinou JC. p53 protein in sympathetic neurons: cytoplasmic localization and no apparent function in apoptosis. Journal of neuroscience research. 1996;43(5):594-601.
  46. Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide‐ranging implications in human disease. Journal of internal medicine. 2005;258(6):479-517.
  47. Bratton SB, MacFarlane M, Cain K, Cohen GM. Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis. Experimental cell research. 2000;256(1):27-33.
  48. D’Amelio M, Tino E, Cecconi F. The apoptosome: emerging insights and new potential targets for drug design. Pharmaceutical research. 2008;25(4):740-51.
  49. Placzek W, Wei J, Kitada S, Zhai D, Reed J, Pellecchia M. A survey of the anti-apoptotic Bcl-2 subfamily expression in cancer types provides a platform to predict the efficacy of Bcl-2 antagonists in cancer therapy. Cell death & disease. 2010;1(5):e40.
  50. Dlamini Z, Mbita Z, Zungu M. Genealogy, expression, and molecular mechanisms in apoptosis. Pharmacology & therapeutics. 2004;101(1):1-15.
  51. Yip K, Reed J. Bcl-2 family proteins and cancer. Oncogene. 2008;27(50):6398.
  52. Kroemer G. Mitochondrial control of apoptosis: an introduction. Biochemical and biophysical research communications. 2003;304(3):433-5.
  53. Faber AC, Ebi H, Costa C, Engelman JA. Apoptosis in targeted therapy responses: the role of BIM. Advances in pharmacology. 65: Elsevier; 2012. p. 519-42.
  54. Boya P, Roumier T, Andreau K, Gonzalez-Polo R-A, Zamzami N, Castedo M, et al. Mitochondrion-targeted apoptosis regulators of viral origin. Biochemical and biophysical research communications. 2003;304(3):575-81.
  55. Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W. Epigenetic reprogramming in mammals. Human molecular genetics. 2005;14(suppl_1):R47-R58.
  56. Safronova O, Morita I. Transcriptome remodeling in hypoxic inflammation. Journal of dental research. 2010;89(5):430-44.
  57. Jones PA, Liang G. Rethinking how DNA methylation patterns are maintained. Nature Reviews Genetics. 2009;10(11):805-11.
  58. Robertson KD. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 2002;21(35):5361.
  59. Sánchez-Pernaute O, Ospelt C, Neidhart M, Gay S. Epigenetic clues to rheumatoid arthritis. Journal of autoimmunity. 2008;30(1):12-20.
  60. Matouk CC, Marsden PA. Epigenetic regulation of vascular endothelial gene expression. Circulation research. 2008;102(8):873-87.
  61. Medzhitov R, Horng T. Transcriptional control of the inflammatory response. Nature Reviews Immunology. 2009;9(10):692-703.
  62. Trenkmann M, Brock M, Ospelt C, Gay S. Epigenetics in rheumatoid arthritis. Clinical reviews in allergy & immunology. 2010;39(1):10-9.
  63. King ON, Li XS, Sakurai M, Kawamura A, Rose NR, Ng SS, et al. Quantitative high-throughput screening identifies 8-hydroxyquinolines as cell-active histone demethylase inhibitors. PloS one. 2010;5(11):e15535.
  64. Alipour S, Nouri M, Sakhinia E, Samadi N, Roshanravan N, Ghavami A, et al. Epigenetic alterations in chronic disease focusing on Behçet’s disease. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2017;91:526-33.
  65. Mikeska T, Craig JM. DNA methylation biomarkers: cancer and beyond. Genes. 2014;5(3):821-64.
  66. Lu Q. The critical importance of epigenetics in autoimmunity. Journal of autoimmunity. 2013;41:1-5.
  67. Mewar D, Wilson A. Autoantibodies in rheumatoid arthritis: a review. Biomedicine & pharmacotherapy. 2006;60(10):648-55.
  68. Wilson AG. Epigenetic regulation of gene expression in the inflammatory response and relevance to common diseases. Journal of Periodontology. 2008;79(8S):1514-9.
  69. Panasiuk A, Dzieciol J, Panasiuk B, Prokopowicz D. Expression of p53, Bax and Bcl-2 proteins in hepatocytes in non-alcoholic fatty liver disease. World journal of gastroenterology: WJG. 2006;12(38):6198.
  70. Dibbert B, Weber M, Nikolaizik WH, Vogt P, Schöni MH, Blaser K, et al. Cytokine-mediated Bax deficiency and consequent delayed neutrophil apoptosis: a general mechanism to accumulate effector cells in inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999;96(23):13330-5.
  71. Lee S-Y, Kwok S-K, Son H-J, Ryu J-G, Kim E-K, Oh H-J, et al. IL-17-mediated Bcl-2 expression regulates survival of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis through STAT3 activation. Arthritis research & therapy. 2013;15(1):R31.
  72. Wang X, Tang D, Shen P, Xu H, Qiu H, Wu T, et al. Analysis of DNA methylation in chondrocytes in rats with knee osteoarthritis. BMC musculoskeletal disorders. 2017;18(1):377.
  73. Itoh J, de La Motte C, Strong S, Levine A, Fiocchi C. Decreased Bax expression by mucosal T cells favours resistance to apoptosis in Crohn’s disease. Gut. 2001;49(1):35-41.
  74. Kaya TI. Genetics of Behçet’s disease. Pathology research international. 2011;2012.
  75. Karasneh J, Gül A, Ollier WE, Silman AJ, Worthington J. Whole‐genome screening for susceptibility genes in multicase families with Behçet’s disease. Arthritis & Rheumatism. 2005;52(6):1836-42.
  76. Hatchwell E, Greally JM. The potential role of epigenomic dysregulation in complex human disease. TRENDS in Genetics. 2007;23(11):588-95.
  77. Jiang R, Jones MJ, Chen E, Neumann SM, Fraser HB, Miller GE, et al. Discordance of DNA Methylation Variance Between two Accessible Human Tissues. Scientific reports. 2015;5.
  78. Viard-Leveugle I, Gaide O, Jankovic D, Feldmeyer L, Kerl K, Pickard C, et al. TNF-α and IFN-γ are potential inducers of Fas-mediated keratinocyte apoptosis through activation of inducible nitric oxide synthase in toxic epidermal necrolysis. Journal of Investigative Dermatology. 2013;133(2):489-98.
  79. Takikita S, Takano T, Narita T, Takikita M, Ohno M, Shimada M. Neuronal apoptosis mediated by IL-1β expression in viral encephalitis caused by a neuroadapted strain of the mumps virus (Kilham Strain) in hamsters. Experimental neurology. 2001;172(1):47-59.
  80. Lin L-L, Huang H-C, Juan H-F. Revealing the molecular mechanism of gastric cancer marker annexin A4 in cancer cell proliferation using exon arrays. PLoS One. 2012;7(9):e44615.
  81. Nicholson DW. From bench to clinic with apoptosis-based therapeutic agents. Nature. 2000;407(6805):810.
  82. Castillo JP, Kowalik TF. Human cytomegalovirus immediate early proteins and cell growth control. Gene. 2002;290(1):19-34.
  83. Lebedeva IV, Su Z-Z, Sarkar D, Fisher PB, editors. Restoring apoptosis as a strategy for cancer gene therapy: focus on p53 and mda-7. Seminars in cancer biology; 2003: Elsevier.

[۱] Cerebrospinal fluid

[۲] Human Leukocyte Antigen

[۳] major histocompatibility complex

[۴] Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4

[۵] Fibroblast-like synoviocytes

[۶] Rapid Genomic DNA Extraction

[۷] Cycle Threshold

[۸]Safestain

[۹]Rapid Genomic DNA Extraction

اپی‌ژنتیک و سرطان

برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • qMSP-PCR
  • ژن‌های BAX
  • ژن‌های BCL-2
  • سندرم بهجت
  • شاهین اسعدی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *