مباحثی پیرامون استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی
قسمت اول: تعاریف و پیش‌نیازها
دکتر محمدرضا ملک، PhD بیوشیمی از مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک دانشگاه تهران
مشاور و مدرس سیستم‌های مدیریت کیفیت در آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی
مقدمه:
روش‌های ایمونواسی که بر اساس اتصال آنتی‌بادی اختصاصی به آنتی‌ژن مربوطه عمل می‌نمایند، از جمله رایج‌ترین و کاربردی‌ترین روش‌های سنجش در آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی هستند که برای اندازه‌گیری آنالیت‌هایی مانند هورمون‌ها، تومورمارکرها، آنتی‌بادی‌های میکروبی، اتوآنتی‌بادی‌ها و مقادیر کم پروتئین‌های موجود در خون و سایر مایعات بدن استفاده می‌شوند. بر همین اساس و با توجه به تنوع روش‌های ایمونواسی، توجه به مقوله استانداردسازی از اهمیت بسزایی برخوردار است. این مسئله با وجود چالش‌هایی چون عدم تولیدپذیری داده‌های اندازه‌گیری، بروز واکنش‌های غیراختصاصی و واکنش‌های متقاطع، تداخل عوامل مداخله‌گر و سایر عوامل مؤثر در اندازه‌گیری به روش‌های ایمونواسی به عنوان یکی از مهم‌ترین و بحث‌برانگیزترین مسائل امروز آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی در سراسر کشور مطرح است. علی‌رغم پیشرفت‌های تکنولوژی در زمینه توسعه آنالایزرهای ایمونواسی و به‌کارگیری روش‌هایی چون کمی‌لومینسانس و الکتروکمی‌لومینسانس و بهبود خصوصیات عملکردی این روش‌ها نسبت به روش‌های نسل‌های پیشین، لیکن به دلیل وجود موانعی که جهت استانداردسازی برخی آنالیت‌های تشخیصی وجود دارد، شاهد آن هستیم که بعضاً در اندازه‌گیری یک آنالیت مانند یک تومورمارکر یا آنتی‌بادی بر روی یک نمونه بیمار که با استفاده از روش‌های مختلف ایمونواسی مورد سنجش قرار گرفته است، نتایج مختلفی حاصل می‌شود که علاوه بر ایجاد اشکال در تفسیر نتایج توسط پزشکان، برای بیماران و آزمایشگاه نیز سؤال‌برانگیز و مسئله آفرین می‌گردد. در سلسله مباحث پیش رو، قصد براین است تا موضوع استانداردسازی روش‌های ایمونواسی را از جوانب مختلف بررسی نموده و با مطرح نمودن برخی از موانع و چالش‌های موجود پیرامون این موضوع، زمینه‌ای را برای بحث‌های بیشتر در آینده فراهم آوریم.
علم مترولوژی یا اندازه‌گیری
نقشی که تشخیص پزشکی در نظام سلامت ایفا می‌نماید، جایگاهی را برای آزمایشگاه‌ها فراهم آورده که بدون آن نمی‌توان حوزه بهداشت و درمان را متصور شد. سلامت و بهداشت جامعه و نحوه درمان بیماران به شکل قابل‌توجهی به اندازه‌گیری‌های درست و قابل اطمینانی که در مراحل تشخیصی در آزمایشگاه انجام می‌شود، وابسته است. این قابلیت اطمینان را می‌توان با بهبود خصوصیات عملکردی روش‌های اندازه‌گیری و کالیبراسیون‌های قابل ردیابی به استانداردهای مرجع تضمین نمود. بر همین اساس، توجه به علم مترولوژی و دانش اندازه‌گیری و آگاهی از عوامل مؤثر بر خصوصیات عملکردی روش‌های اندازه‌گیری از اهمیت بالایی برخوردار است.
اهمیت داده‌های اندازه‌گیری
داده‌های اولیه حاصل از اندازه‌گیری یک آنالیت، کمیت‌های عددی هستند که کاربرد آنها به تنهایی معمولاً مفهوم خاصی را القا نمی‌نماید، اما هنگامی که همین داده‌های خام مورد تجزیه و تحلیل قرار بگیرند و اصطلاحاً تبدیل به اطلاعات شوند، می‌توانند به عنوان مبنایی جهت ارزیابی عملکرد یک روش اندازه‌گیری باشند. به بیانی دیگر، اطلاعات، همان داده‌های فشرده شده‌ای هستند که دارای کاربرد هستند. تعیین شاخص‌های آماری نظیر میانگین، انحراف از معیار و ضریب تغییرات مثال‌هایی از تبدیل داده‌های اولیه حاصل از یک اندازه‌گیری به اطلاعات کاربردی هستند. بر اساس این تعاریف، توجه به کیفیت داده‌های اندازه‌گیری و نحوه جمع‌آوری آنها، در ارزیابی خصوصیات عملکردی یک روش اندازه‌گیری دارای اهمیت فراوانی است.
خصوصیات عملکردی روش‌های اندازه‌گیری
از جمله مهم‌ترین خصوصیات عملکردی روش‌های اندازه‌گیری می‌توان به دقت، صحت، محدوده خوانش، حد تشخیص، حد اندازه‌گیری و ویژگی یا اختصاصی بودن روش اشاره کرد. همانطوریکه بیان شد در علم مترولوژی مهم‌ترین موضوع، داده‌ها یا همان مقادیر حاصل از اندازه‌گیری یک آنالیت هستند و در بررسی داده‌های اندازه‌گیری نیز، موضوع ارزیابی دقت از اهمیت بالایی برخوردار است. میزان نزدیکی داده‌های حاصل از انجام آزمایش‌های تکراری یک آنالیت را دقت (Precision) می‌گویند. در مقابل معیار دقت، واژه عدم دقت (Imprecision) یا میزان پراکندگی داده‌های حاصل از انجام آزمایش‌های تکراری یک آنالـــیت را داریم کـــــه با شاخص‌های انحراف از معیار (Standard of Deviation) و ضریــــب تغییرات (Coefficient of Variation) بیان می‌شود که منعکس‌کننده خطاهای اتفاقی یا تصادفی (Random Error) هستند. برای ارزیابی عدم دقت داده‌ها از آزمون تکرارپذیری (Repeatability) استفاده می‌شود که می‌تواند به صورت‌هـــای (Intra-Assay) یا (Within-Run) که مربوط به انجام آزمون تکرارپذیری در یک دور آزمایش یا یک سری کاری است و همچنین به صورت (Inter-Assay) یا (Between-Run) که مربوط به انجام آزمون تکرارپذیری در دورهای مختلف آزمایش است، انجام گردد. در کنار بررسی دقت به صورت درون آزمایشگاهی، دقت بین آزمایشگاهی یا تولیدپذیری (Reproducibility) نیز که به نزدیکی داده‌های حاصل از انجام آزمایش‌های تکراری یک آنالیت بر روی یک نمونه بیمار که توسط آزمایشگاه‌های مختلف که از روش‌های اندازه‌گیری مختلف بهره می‌گیرند، اطلاق می‌گردد، حائز اهمیت است؛ بنابراین در تعریفی کامل‌تر، دقت شامل هر دو معیار تکرارپذیری و تولیدپذیری داده‌ها است. یکی از چالش‌ها در خصوص استانداردسازی روش‌های ایمونواسی، وجود نتایج مختلف آزمایش حاصل از اندازه‌گیری برخی از آنالیت‌های تشخیصی نظیر برخی از تومورمارکرها در یک بیمار است که علی‌رغم تکرارپذیری مطلوب درون آزمایشگاهی، نتایج از دقت بین آزمایشگاهی یا تولیدپذیری مطلوب برخوردار نیستند و همانطوری که قبلاً نیز اشاره شد این مسئله بعضاً برای کادر درمان و بیماران سؤال‌برانگیز می‌شود.
معیار صحت (Accuracy) نشان‌دهنده نزدیک بودن میانگین داده‌های حاصل از اندازه‌گیری‌های مکرر یک آنالیت با مقدار واقعی آن است و در مقابل آن عدم صحت (Inaccuracy) است که بیانگر میزان اختلاف عددی بین میانگین داده‌های حاصل از اندازه‌گیری‌های مکرر یک آنالیت و مقدار واقعی آن است که با شاخص بایاس یا بایاس درصد (Bias or Bias%) بیان شده و منعکس‌کننده خطاهای سیستماتیک (Systematic Error) است.
دامنه اندازه‌گیری آزمایش (Analytical Measurement Range) عبارت است از محدوده‌ای شامل کمترین و بیشترین مقداری از یک آنالیت که با دقت و صحت قابل قبول و بدون هرگونه آماده‌سازی نمونه، قابل گزارش باشد. این دامنه را با استفاده از آزمون خطی بودن (Linearity) می‌توان مورد ارزیابی قرار داد. کمترین میزان قابل تشخیص از یک آنالیت موجود در یک نمونه را که احتمالاً با دقت و صحت قابل قبول تعیــــین مقدار نمی‌شــــــود، حـــــد تشخیص (Limit of detection) یا (Analytical sensitivity) گویند. در مقابل، حد اندازه‌گیری (Limit of Quantitation) یا حساسیت عملکردی (Functional sensitivity) است که نشان‌دهنده کمترین میزانی از یک آنالیت موجود در یک نمونه است که با دقت و صحت قابل قبول تعیین مقدار شده است. حساسیت عملکردی بر اساس کمترین غلظتی از یک آنالیت که در آن ضریب تغییرات 20 درصد باشد، تعریف می‌گردد. معیار حساسیت در کارایی روش‌های کیفی (Qualitative) نیز عاملی تأثیرگذار است. به‌طور کلی هر چه حساسیت روش اندازه‌گیری بالاتر باشد احتمال وقوع نتایج منفی کاذب (False Negative) کمتر خواهد بود. در آزمایش‌های غربالگری (Screening Test) معمولاً از یک روش اندازه‌گیری با حساسیت بالا برای شناسایی افراد بیمار استفاده می‌شود. در این آزمایش‌ها، نتایج مثبت باید به‌وسیله یک روش تأییدی با ویژگی بالا مورد تأیید قرار بگیرد.
یکی از معیارهای مهم در روش‌های اندازه‌گیری و از جمله روش‌های ایمونواسی ویژگی یا اختصاصی بودن (Specificity) روش است. در برخی از روش‌های کمی (Quantitative)، نتایج اندازه‌گیری به‌صورت کاذب، افزایش یا کاهش می‌یابد که به دلیل تداخل مواد دیگری غیر از آنالیت موردنظر در آزمایش است که به مثابه آنالیت وارد واکنش می‌شوند. در واقع در یک روش اندازه‌گیری با درجه ویژگی بالا، سیگنال‌های ایجادشده در طی واکنش به‌طور اختصاصی به آنالیت موردنظر مربوط بوده و تداخل عوامل مداخله‌گر وجود نداشته یا بسیار کم است. کارایی و عملکرد روش‌های کیفی (Qualitative) نیز تحت تأثیر پارامتر ویژگی قرار می‌گیرد. به‌طور کلی هر چه میزان اختصاصی بودن روش اندازه‌گیری بیشتر باشد، تعـــــــداد جواب‌های مثبت کاذب (False Positive) کمتر خواهد بود.
مواد و روش‌های مرجع
مواد استاندارد (Standards) در آزمایشگاه تشخیص پزشکی، محلول‌هایی با غلظت ثابت و مشخص هستند که به عنوان مبنای سنجش و تعیین مقدار سایر نمونه‌های مورد آزمایش استفاده می‌شوند.
بر اساس نظر فدراسیون بین‌المللی بیوشیمی بالینی (IFCC) استانداردها به دو گروه استانداردهای اولیه (Primary Standard) و استانداردهای ثانویه (Secondary Standard) تقسیم می‌گردند. استانداردهای اولیه از پایداری و درجه خلوص بسیار بالایی برخوردار بوده و برای ساخت سایر محلول‌های استاندارد با غلظت مشخص استفاده می‌شوند که خالص‌ترین آنها به عنوان مواد مرجع استاندارد (Standard Reference Materials) شناخته می‌شود. استانداردهای ثانویه محلول‌هایی هستند که غلظت ماده موردنظر در آنها با استفاده از یک روش مرجع (Reference Method) یا استفاده از استانداردهای اولیه تعیین مقدار شده است و در مقایسه با استانداردهای اولیه از قطعیت کمتری برخوردار بوده و معمولاً برای کالیبراسیون (Calibration) روش‌های اندازه‌گیری استفاده می‌شوند. مواد کالیبراتور (Calibrator) که برای تنظیم سیستم‌های اتوآنالایزر استفاده می‌شوند، معمولاً قابل ردیابی (Traceable) به مواد مرجع استاندارد هستند. روش مرجع (Reference Method)، روشی است که میزان خطای کلی شامل عدم دقت و عدم صحت در آن مشخص بوده و برای ارزیابی صحت روش‌های دیگر یا تهیه مواد مرجع مورد استفاده قرار می‌گیرد. جهت تأیید روش‌های مرجع، از روش‌های قطعی(Definitive Method) که از قابلیت اطمینان بالایی برخوردار بوده و حداکثر کیفیت را دارند، استفاده می‌شود.
پیش‌نیازهای استانداردسازی
استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی با هدف افزایش قابلیت اطمینان نتایج آزمایش و بهبود خصوصیات عملکردی روش‌های اندازه‌گیری از جمله دقت، صحت، حساسیت و ویژگی دنبال می‌شود. این موضوع، به دلیل تسهیل در فرآیند تأیید و تفسیر نتایج و با توجه به وجود سیستم‌ها و روش‌های مختلف ایمونواسی که جهت اندازه‌گیری آنالیت‌ها با مقاصد غربالگری، تشخیصی و تأییدی وجود دارند، از اهمیت بسزایی برخوردار است. موضوع استانداردسازی روش‌های اندازه‌گیری در دنیای تشخیص بالینی، یک مفهوم نسبتاً جدید است که علی‌رغم پیشرفت‌های علم آزمایشگاه، هنوز موانع و چالش‌های زیادی بر سر راه آن وجود دارد. به‌طور کلی، فرآیند استانداردسازی در روش‌های ایمونواسی، در مقایسه با روش‌های متداول بیوشیمیایی که دسترسی بیشتری به استانداردها و روش‌های مرجع به عنوان پیش‌نیازهای اصلی استانداردسازی، دارند، توفیقات کمتری داشته است. در این بین موانع و چالش‌های استانداردسازی روش‌های ایمونواسی برای آنالیت‌های مختلف، یکسان نبوده و به عوامل مختلفی وابسته است. به عنوان مثال مشکلات استانداردسازی در مورد ترکیبات پپتیدی و پروتئینی، به علت غیریکنواختی یا هتروژنی (Heterogeneity) ساختار آنها، بیشتر به علت فقدان مواد و روش‌های مرجع است، در صورتی که در مورد هورمون‌های استروئیدی علی‌رغم وجود استانداردهای خالص و روش‌های مرجع، وجود واکنش‌های متقاطع (Cross-Reactions) به عنوان عامل اصلی شناخته می‌شود.
در پایان امید است تا با ادامه این مبحث در شماره‌های آینده، جزئیات بیشتری را مورد بررسی قرار دهیم.
تکنیک‌های بررسی برهمکنش‌های پروتئین- پروتئین در تحقیقات پروتئومیکس
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام