جداسازی و تخلیص اسیدهای نوکلئیک

جداسازی و تخلیص اسیدهای نوکلئیک

جداسازی و تخلیص اسیدهای نوکلئیک

 دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا…(عج))

زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)

دکتر رضا میرنژاد (استاد دانشگاه)

 

 

اولین قدم در ژنتیک،‌ جداسازی و تخلیص DNA و RNA است. این کار دارای مراحلی است که در ادامه به آن اشاره می‌شود.

DNA را می‌توان از منابع مختلفی از جمله خون کامل حاوی ضد انعقاد، لخته خون، گلبول سفید، رده سلولی، میکروارگانیسم‌های مختلف و … جدا نمود. به‌منظور استخراج DNA از خون کامل بهتر است از خون تازه استفاده شود. اگر امکان استخراج سریع وجود نداشته باشد، نمونه به‌صورت کامل و استریل در دمای اتاق نگهداری می‌شود. اگر این تأخیر بیش از یک هفته باشد نمونه را در میکروتیوب‌ها توزیع کرده و در دمای۷۰-/۲۰- حداکثر به مدت یک سال نگهداری می‌کنند. برای نگهداری طولانی مدت نمونه‌ها می‌توان لنفوسیت‌های خون را جدا کرده و در محیط حاوی DMSO[1] درون نیتروژن مایع قرار داد.

 

نکات قابل توجه

  1. احتمال آلودگی و عفونت در نمونه‌های خون مورد استفاده وجود دارد؛ بنابراین هنگام کار با این نمونه‌ها نکات ایمنی را رعایت کنید.
  2. ضدانعقاد EDTA یا سیترات برای کار با DNA مناسب است، اما هپارین مهارکننده PCR است. نمونه‌هایی که بیش از یک هفته از تهیه آن‌ها گذشته است، از لحاظ کمّی و کیفی DNA خوبی نمی‌دهند؛ مگر این‌که فریز شده باشند. میزان DNA حاصل، بستگی به تعداد گلبول‌های سفید نمونه دارد. هر میلی‌لیتر از خون کامل حاوی حدود ۱۰۰۰۰ گلبول سفید بوده و از آن gµ۱۰۰ نمونه DNA بدست می‌آید.
  3. هنگام تخلیص باید دقت شود تا آلودگی با دیگر نمونه‌ها، DNA و محصولات PCR به‌وجود نیاید، بدین منظور باید دو اتاق جدا تحت عنوان Pre-PCR و Post-PCR تعبیه شود. در اتاق Pre-PCR کارهایی از قبیل جداسازی DNA و PCR انجام شده و در اتاق دیگر بر روی محصول PCR کار می‌شود. وسایل و مواد از قبیل روپوش، سمپلر و بافرهای هر اتاق باید مجزا و مشخص باشد. کارهای اتاق Pre-PCR زیر هود انجام می‌شود.
  4. هنگام کار حتماً از دستکش استفاده شود. از لوله‌ها و میکروتیوب‌های یک بار مصرف و وسایل شیشه‌ای قابل اتوکلاو استفاده گردد. از مواد پلاستیکی (سرسمپلر، لوله، میکروتیوب) با جنس پلی‌پروپیلن استفاده شود. مواد با جنس نامرغوب می‌تواند DNA را به خود جذب کند.

 

مراحل جداسازی اسید نوکلئیک

شکستن سلول: از آنجا که DNA و RNA در داخل سلول قرار دارند، جهت جداسازی آن‌ها ابتدا باید سلول را شکست. برای این کار در مورد هر سلول باید روش خاص آن را به‌کار برد؛ برای مثال سلول‌های جانوری را معمولاً با استفاده از شوک اسمزی و یا دترجنت‌های یونی مثل SDS (سدیم دودسیل سولفات) و سلول‌های گیاهی را به دلیل داشتن دیواره سخت پکتینی و سلولزی، با استفاده از آنزیم‌های پکتیناز و سلولاز می‌شکنند. شکستن دیواره باکتری‌ها نیز با توجه به وابستگی آن‌ها به دو گروه عمده گرم مثبت و گرم منفی، با تکنیک‌های خاصی صورت می‌گیرد.

باکتری‌های گرم مثبت لایه پپتیدوگلیکان ضخیمی در دیواره سلولی خود دارند، بنابراین جهت شکستن دیواره آن‌ها از آنزیم لیزوزیم و مدت زمان نسبتاً زیاد استفاده می‌کنیم.

باکتری‌های گرم منفی در لایه بیرونی خود یک غشای خارجی نیز دارند که این غشاء مانع از عمل لیزوزیم بر روی دیواره آن‌ها می‌شود، بنابراین در این گروه از باکتری‌ها علاوه بر لیزوزیم از EDTA (اتیلن دی‌آمین تترا استیک اسید) استفاده می‌شود. EDTA باعث حل شدن غشای خارجی شده و در نتیجه دیواره سلولی در معرض لیزوزیم قرار می‌گیرد.

لازم به ذکر است که به دلیل شکنندگی رشته‌های RNA و DNA، شکستن سلول‌ها باید در داخل بافر انجام گیرد. این بافر شامل HCl Tris[2]– و SDS است. SDS دو خاصیت دارد: یکی باعث حل شدن چربی‌ها می‌شود و دیگر این‌که با اتصال به DNA باعث پایداری آن می‌گردد.

 

رسوب دادن DNA و RNA: با شکسته شدن سلول، محتویات آن شامل DNA و RNA پروتئین، چربی، قند و … آزاد می‌شود. در مرحله بعد باید DNA و RNA را خالص کرد. برای این کار از الکل استفاده می‌شود. الکل سرد را به سوسپانسیون حاصل از شکستن سلول اضافه کرده و در فریزر قرار می‌دهند. در این مرحله DNA و RNA رسوب می‌کنند.

 

جداسازی DNA  و RNA: برای این کار به‌طور معمول از میله شیشه‌ای استفاده می‌شود؛ به این صورت که میله را به‌آرامی داخل لوله فرو برده و می‌چرخانند. رشته‌های DNA و RNA به دور میله شیشه‌ای می‌چسبند، سپس میله را به‌آرامی خارج کرده و در یک لوله دیگر محتوی بافر فرو برده و تکان می‌دهند تا DNA و RNA دوباره در بافر حل شوند. این مرحله باید با ملایمت صورت گیرد تا DNA و RNA نشکنند.

 

رسوب پروتئین: DNA و RNA حاصل از مرحله قبل هرچقدر هم که خالص باشند، ولی باز هم حاوی کمی پروتئین خواهند بود. در این مرحله برای خالص کردن DNA و RNA باید پروتئین‌ها را رسوب دهیم. برای این کار از فنل و یا محلول غلیظ نمک‌های مختلف استفاده می‌کنند. این مواد باعث تغییر شکل پروتئین‌ها (دناچوره شدن) و در نتیجه رسوب آن‌ها می‌شود.

 

جدا کردن DNA و RNA از یکدیگر: در این مرحله با توجه به کاری که مدنظر است DNA و RNA جدا می‌شوند. اگر هدف بررسی DNA باشد با استفاده از آنزیم RNase، RNAها را تجزیه می‌کنند و اگر بخواهند RNA را بررسی کنند، از آنزیم DNase استفاده می‌کنند.

 

استخراج DNA به روش Salting out

مواد لازم در استخراج DNA:

  • ایزوپروپانول (موجب رسوب DNA می‌شود و باید در ۴ درجه سلسیوس نگهداری شود)
  • اتانول ۷۰% (موجب رسوب DNA می‌شود و باید در ۴ درجه سلسیوس نگهداری شود)
  • SDS 10% (این محلول پروتئین‌ها را حذف کرده و آن‌ها را رسوب می‌دهد)
  • نگهداری در دمای اتاق
  • آب مقطر سرد
  • TE برای حل کردن DNA (می‌توان DNA را در آب مقطر استریل نیز حل کرد، اما بافر TE برای نگهداری طولانی مدت مناسب‌تر است، زیرا pH اسیدی موجب دپورینه شدن DNA و pH قلیایی سبب تخریب DNA می‌شود. همچنین EDTA با حذف کاتیون‌های دو ظرفیتی، آنزیم DNAase را غیرفعال می‌کند).

 

– ۱۰ mM Tris-HCL

– ۰٫۲mM Na2EDTA

pH این بافر باید به ۷/۴ برسد و بعد از اتوکلاو در ۴ درجه سلسیوس نگهداری شود.

 

  • بافر لیز هسته
  • -۱۰ mM Tris-HCL

– ۴۰۰mM NaCl

– ۰٫۲mM Na2EDTA

pH این بافر باید به ۸/۴ برسد و بعد از اتوکلاو در ۴ درجه سلسیوس نگهداری شود.

  • محلول پروتئیناز K (آنزیم DNAase را غیرفعال می‌کند)
  • ۱mg/ml محلول پروتئینازk (این آنزیم در ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری می‌شود).

 

روش استخراج

ابتدا ۵ میلی‌لیتر خون حاوی EDTA را به مدت ۱۰ دقیقه در g1000 در دمای صفر درجه سلسیوس سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را به‌آرامی جدا کنید.

بر روی رسوب باقیمانده ۱۰ میلی‌لیتر آب مقطر استریل با دمای ۴ درجه سلسیوس ریخته و خوب مخلوط کنید، سپس ۱۰ دقیقه در دمای صفر درجه سلسیوس در g1000 سانتریفیوژ کرده و پس از آن مایع رویی آن را دور بریزید. این عمل را چندین بار تکرار کنید تا مایع رویی کاملاً شفاف و رسوب بدون رنگ باشد.

بر روی رسوب باقیمانده در انتهای لوله، ۴/۵ میلی‌لیتر بافر لیزکننده حاوی ۱۰ میلی‌مــــول Tris-HCL و ۱۵۰ میلی‌مول EDTA، ۱۰ میلی‌مول NaCL با pH=7.5 ریخته و به آن ۲۰ میکرولیتر پروتئیناز K (mg/ml10) و ۲۵۰ میکرولیتر SDS 10% اضافه کنید، سپس محلول حاصل را به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سلسیوس قرار دهید تا عمل هضم انجام پذیرد. پس از هضم سلول‌ها، جهت رسوب کردن پروتئین‌ ۱/۸ میلی‌لیتر محلول اشباع کلرید سدیم ۵M بر روی آن اضافه کرده و به‌آرامی تکان دهید. این محلول را به مدت ۲۵ دقیقه در g1000 در دمای ۲۱ درجه سلسیوس سانتریفیوژ نمایید. در صورتی‌که محلول رویی شفاف نبود، محلول رویی را جدا کرده و به آن مجدداً ۵۰۰ میکرولیتر کلرید سدیم اشباع افزوده و سانتریفیوژ کنید تا کاملاً شفاف گردد. محلول شفاف رویی را جدا کرده و به یک لوله تمیز انتقال دهید، سپس به‌آرامی بر روی آن ۵ میلی‌لیتر ایزوپروپانول خنک (۴ درجه) اضافه کنید تا کلاف DNA مشاهده شود. کلاف را به‌آرامی با سمپلر برداشته و به یک میکروتیوب منتقل کنید، سپس محلول اضافی روی آن را پس از میکروفیوژ کردن برداشته و ۴۰۰ میلی‌لیتر اتانول ۷۰% به آن اضافه کنید.

الکل اضافه را مجدداً پس از میکروفیوژ کردن با کمک سمپلر برداشته و میکروتیوب را در ۴۵ درجه سلسیوس قرار دهید تا الکل آن تبخیر گردد. سپس به میکروتیوب حاوی DNA، ۲۰۰ میکرولیتر بافر TE حاوی ۱۰ میلی‌مولار Tris-HCL و یک میلی‌مولار EDTA با pH=7.4 اضافه کنید تا DNA در آن حل شود. میکروتیوب را به مدت یک شب در دمای آزمایشگاه قرار داده و سپس در دمای ۴ درجه سلسیوس در یخچال نگهداری کنید. اگر فعلاً کاری بر روی DNA انجام نمی‌دهید، بهتر است آن را در ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری نمایید.

lµ۱۰ از محلول را به حجم lµ۱۰۰۰ رسانده و OD آن را در طول‌موج nm260 و nm280 بررسی کنید. نسبت  را محاسبه کنید. (خوانش OD توسط دستگاه نانودراپ)

 

نکات قابل توجه:

ضریب رقت در هنگام محاسبه غلظت فراموش نشود.

OD=1 در طول‌موج nm260 معادل µg50 از DNA دو رشته‌ای (ds DNA) می‌باشد.

OD=1 در طول‌موج nm260 معادل µg50 از DNA تک رشته‌ای (ss DNA) می‌باشد.

بهترین حالت برای نسبت OD260 به OD280، عددی در حدود ۱/۸ می‌باشد. (همانطور که در شکل زیر مشاهده می‌شود)

 اسیدهای نوکلئیک

اگر این نسبت بیشتر از ۱/۸ باشد، آلودگی با RNA وجود دارد و اگر از ۱/۸ کمتر باشد، DNA با پروتئین آلوده است.

برای اندازه‌گیری پروتئین موجود در نمونه برحسب mg/ml می‌توان از فرمول زیر استفاده کرد:

 

استخراج DNA از خون به روش فنل- کلروفرم

محلول‌های موردنیاز:

۱-Reticolocyte salin

۰٫۱۳M NaCl

۵mM KCl

۷٫۴mM MgCl2

۲- Lysis solution (10X)

۰٫۷۷M  NH4 Cl

۰٫۰۴۶M            KHCO3

۳- TE Buffer

۱۰mM Tris-HCl (pH=8.0)

۱mM   EDTA (pH=8.0)

۴- Lysis solution

۱۰۰mM           NaCl

۲۵mM EDTA (pH=8.0)

۵- SDS (10%)

۶- NaCl (5M)

۷- Ammonium Acetate (10M)

روش کار:

  • ۱۰ میلی‌لیتر خون حاوی EDTA را داخل لوله فالکون ۵۰ سی‌سی ریخته و ۲۰-۱۰ سی‌سی از محلول Reticolocyte salin را به آن اضافه کنید.
  • به مدت ۱ دقیقه با دور g1000(تقریباً ۳۰۰۰ دور در دقیقه) سانتریفیوژ نمایید.
  • به‌آرامی پلاسما را جدا کنید. دقت شود به لایه بافی‌کوت دست نزنید.
  • لوله فالکون را تا حجم ml50 با محلول لیز (x2) پر کرده و به مدت ده دقیقه مخلوط کنید تا گلبول‌های قرمز لیز شوند.
  • محلول فوق را ۱۰ دقیقه با دور g1000 سانتریفیوژ نمایید.
  • در این هنگام که رسوب گلبول‌های سفید در ته لوله تشکیل می‌گردد، به‌آرامی و با سمپلر مایع رویی را بردارید.
  • به رسوب سلولی مواد زیر را اضافه کنید:
  • – محلول لیز ml10

SDS  (۱۰%) ml0/5 –

– آنزیم K پروتئیناز  (mg/ml20) lµ۲۰

  • سپس محلول حاصل را خوب مخلوط کرده، حداقل ۴ ساعت (یا over night) در ۳۷ درجه سلسیوس انکوبه کنید.
  • سپس به اندازه نصف حجم محلول حاصل، از فنل متعادل‌شده با محلول تریس یک مولار (pH=8) و نصف دیگر از کلروفرم بریزید.
  • محلول را به مدت ۱۰ دقیقه با دور g3000 سانتریفیوژ کرده، لایۀ رویی که لایه آبی و حاوی اسید نوکلئیک است را به‌آرامی جدا کرده و در ظرف دیگری بریزید.
  • مرحله افزودن فنل کلروفرم را بار دیگر تکرار نمایید.
  • دوباره محلول رویی را خارج نموده و در لوله تمیز بریزید. سپس به اندازه نصف حجم محلول، به آن کلروفرم اضافه کرده و مطابق مرحله قبل سانتریفیوژ نمایید.
  • به محلول رویی جداشده به اندازه نصف حجم آن استات آمونیم ۱۰ مولار و دو برابر حجم آن اتانول ۹۶ درجه اضافه کنید. با سر و ته کردن لوله می‌توان کلاف DNA را مشاهده کرد.
  • لوله را ۵ دقیقه با دور g1000 سانتریفیوژ نمایید.
  • به‌آرامی محلول رویی را خارج کرده و رسوب را با اتانول ۷۰ درجه بشویید.
  • لوله را به مدت حداقل ۱۰ دقیقه در حرارت اتاق قرار داده تا کاملاً اتانول تبخیر شود. سپس رسوب را در ۱-۰/۵ میلی‌لیتر آب مقطر یا بافر TE حل کرده و در ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری نمایید.

 

تخلیص DNA از خون به روش جوشاندن

محلول‌های موردنیاز:

  • بافر R (بافر لیز)
  • ساکاروز ۰/۳۲ مول
  • تریس-HCl 10 میلی‌مولار
  • کلرید منیزیم ۵ میلی‌مولار
  • تریتون (X100) 1%

 

محلول ۱:

NaOH mM 50

 

محلول ۲:

تریس-HCl 1 مولار (۷/۵pH=)

 

روش کار:

  • مقدار ml0/5 خون را در یک میکروتیوب ml1/5  ریخته و به آن یک میلی‌لیتر از بافر R اضافه کرده، چند بار سروته کنید. به مدت یک تا دو دقیقه با دور rpm10000 سانتریفیوژ کنید. محلول رویی را دور بریزید
  • مقدار lµ۲۵۰ از بافر R را به رسوب اضافه کرده، ورتکس کنید و سپس lµ۷۵۰ دیگر از بافر R اضافه کرده و بعد از مخلوط کردن کامل، مشابه مرحلۀ فوق سانتریفیوژ نمایید. این کار را آن‌قدر ادامه دهید تا رسوب کاملاً سفید شود.
  • lµ۱۰۰ از محلول سود (NaOH) را به رسوب اضافه نموده و مخلوط کنید. سپس به مدت ۲۰ دقیقه بجوشانید (بعد از این مرحله هیچ رسوبی نباید در تیوب باقی بماند).
  • lµ۲۰ از محلول تریس یک مولار را به محلول فوق را اضافه کرده، مخلوط کنید.
  • دقیقاً ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ کنید.
  • برای حذف پروتئین می‌توانید lµ۵ پروتئیناز K را  اضافه کرده و بعد از مخلوط کردن به مدت یک ساعت در دمای ۵۵ درجه سلسیوس قرار دهید. در این مدت هر ۵ دقیقه یک بار میکروتیوب را سر‌وته نمایید.
  • مایع رویی حاوی DNA می‌باشد که برداشته شده و در ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری شود.

نکته: از معایب این روش خرد و قطعه‌قطعه شدن DNA می‌باشد، بنابراین DNA حاصل برای PCR قطعات بزرگ DNA مناسب نیست.

 

تخلیص DNA از خون به روش Salazar

محلول‌های موردنیاز:

  • بافر ۱ (بافر لیز گلبول قرمز)
  • تریس-HCl mM10 (pH=8)
  • کلرید پتاسیم (KCl) mM10
  • کلرید منیزیم (MgCl2) mM10
  • EDTA mM 2 (pH=8)
  • تریتون X 100 (2/5%)
  • بافر ۲ (لیز گلبول سفید)
  • تریس-HCl mM10 (pH=8)
  • کلرید پتاسیم (KCl) mM10
  • کلرید منیزیم (MgCl2) mM10
  • EDTA mM 2 (pH=8)
  • کلرید سدیم (NaCl) 0/4 مولار
  • SDS g/L10
  • کلرید سدیم ۵ مولار
  • بافر  TE(محلول نگهدارنده TE)
  • تریس-HCl mM10(pH=7.5)
  • EDTA mM1

 

روش کار:

  • یک سی‌سی از خون EDTAدار را داخل میکروتیوب ریخته و ۵ دقیقه با g1200 سانتریفیوژ کنید.
  • مایع رویی را دور بریزید.
  • گلبول قرمز را با ml1 از بافر ۱ لیز کنید.
  • بعد از سانتریفیوژ، رسوب را دوباره با بافر ۱ شستشو دهید. این کار را آن‌قدر ادامه دهید تا رسوب کاملاً سفید شود.
  • رسوب حاصل را که کاملاً سفید رنگ است با lµ۲۲۰ از بافر ۲ لیز کنید.
  • محلول حاصل را ۱۵ دقیقه در ۵۶ درجه سلسیوس انکوبه کنید.
  • در این مرحله lµ۱۰۰ از محلول کلرید سدیم ۵ مولار را اضافه کرده تا پروتئین‌ها رسوب داده شوند.
  • میکروتیوب را به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ نموده و مایع رویی را که حاوی DNA است، به‌آرامی با سمپلر جدا کنید.
  • دو برابر حجم برداشته شده از مرحله قبل، اتانول ۹۶ درجه اضافه کنید و به مدت ۱۵ دقیقه در کنار یخ یا در ۲۰- درجه سلسیوس قرار دهید تا کلاف DNA را مشاهده نمایید.
  • میکروتیوب را ۱۰ دقیقه با ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ کرده و رسوب را دو بار با اتانول ۷۰% شستشو دهید.
  • رسوب حاصل را پس از تبخیر کامل اتانول در lµ۱۰۰ از بافر TE حل کرده و در شرایط مناسب نگهداری نمایید.

 

استخراج به روش [۳]P.C.I  

هدف از این کار حذف پروتئین‌های موجود در محلول حاوی DNA می‌باشد. فنل (فنل متعادل‌شده با pH بیشتر از ۷/۵) موجب دناتوده شدن پروتئین‌ها می‌شود و کلروفرم نیز بقایای فنل را از محلول واکنش حذف می‌کند.

  • هم‌حجم محلول حاوی DNA، فنل اضافه کنید و مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ کنید (فنل متعادل‌شده به‌علت داشتن ماده آنتی‌اکسیدان ۸-hydroxyquinoline، زرد رنگ است و روی آن با یک لایه بافر تریس پوشانیده شده است. هنگام استفاده از فنل زیر بافر استفاده کنید)
  • مایع رویی (مایع شفاف) را به لوله تمیز دیگری انتقال دهید (فنل در زیر قرار می‌گیرد و پروتئین‌های دناتوره شده بین دو لایه قرار می‌گیرند).
  • هم‌حجم آن از مخلوط کلرفرم- ایزوآمیل الکل (۱:۲۴) اضافه کنید (ایزو آمیل الکل یک ماده Anti foamاست و مانع کف کردن محلول می‌شود) و مانند مرحله قبل ادامه دهید.
  • مایع رویی را به لوله تمیز دیگر انتقال دهید و یا مانند روش زیر می‌توان عمل نمود:
  • مخلوط فنل- کلرفروم- ایزو آمیل الکل(به نسبت  ۱:۲۴:۲۵) تهیه کنید.
  • حجم مساوی از مخلوط C.I به محلول حاوی DNA اضافه کنید و ۵ دقیقه سانتریفیوژ کنید.
  • محلول رویی را به لوله تمیز دیگر انتقال دهید و هم‌حجم آن I اضافه کنید و ۵ دقیقه سانتریفیوژ کنید.
  • محلول رویی را به لوله تمیز دیگر انتقال دهید (محلول حاوی DNA است)
  • اگر هنوز بوی فنل از آن متصاعد می‌شود مرحله ۷ را تکرار کنید.
  • DNA را با الکل رسوب دهید (تغلیظ DNA).

 

رسوب DNA با الکل (تغلیظ DNA)

هدف از این کار احیای DNA بعد از استخراج و یا بعد از استخراج P.C.I. می‌باشد و در مواقعی نیز که DNA خیلی رقیق باشد بدین وسیله آن را تغلیظ می‌کنیم.

  • حجم محلول حاوی DNA را تعیین کنید (تخمین بزنید).
  • استات سدیم با غلظت نهایی ۳M را به آناضافه کنید.
  • مقدار دو برابر حجم آن الکل مطلق سرد (۲۰- یا ۷۰-) اضافه نمائید.
  • مدت ۱۰ دقیقه با ۱۲۰۰۰g سانتریفیوژ کنید. رسوب سفید رنگ را می‌توان در ته لوله مشاهده نمود (لازم به ذکر است که DNA خالص تقریباً بی‌رنگ است).
  • با وارونه کردن لوله، مایع رویی را حذف کنید و لوله را به‌صورت وارونه روی کاغذ جاذب‌الرطوبه قرار دهید تا آب آن حذف شود.
  • مقدار ۱۰۰ میکرو لیتر الکل ۷۰ درجه به آن اضافه کنید و آن را ورتکس کنید تا رسوب DNA از ته لوله کنده شده و شناور گردد (اگر DNAبزرگ باشد ورتکس موجب شکسته شدن آن می‌شود).
  • مدت ۵ دقیقه آن را سانتریفیوژ کنید (شستن DNA).

الکل را خالی کرده و DNA را در ۷۰ درجه خشک‌کنید (چنانچه در این مرحله DNA خوب خشک نشود و الکل همراه آب داخل آن بماند، بعداً برای کار کردن با آنزیم‌ها دچار اشکال می‌شوید). DNA را در مقدار دلخواه بافر (آب) حل کنید.

 

احیای DNA از ژل آگارز

هدف از این قسمت کسب مهارت برای احیای DNA از روی ژل آگارز می‌باشد. این تکنیک در بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک اهمیت زیادی دارد و در همسانه‌سازی ژن و انتقال ژن استفاده می‌شود. لازم به ذکر است که از طرق مختلف این کار انجام می‌شود؛ ماننــــــــــــــد
Freeze- Squeeze ,paper elution ,Electro elution و… ولی در اینجا به توضیح دو روش بسنده می‌شود:

الف) احیای DNA از روی ژل توسط کاغذ (Paper elution) 

  • DNAموردنظر را با ژل آگاروز ۲-۱% الکتروفورز کنید و اجازه دهید تا نوارهای DNA به‌خوبی از همدیگر تفکیک شوند.
  • با نور UV (طول‌موج ۲۵۴ نانومتر موجب آسیب DNA می‌شود و بهتر است از طول‌موج ۳۱۲ نانومتر استفاده گردد) نوارهایموردنظر را مشاهده کرده و جلوی آن را با تیغ اسکالپر تمیز علامت‌گذاری کنید.
  • در جلوی باند یک حفره ایجاد کنید (عرض حفره مساوی عرض باند باشد).
  • یک قطعه کاغذ واتمن و یک قطعه کیسه دیالیز (Dialysis tubing) به اندازه حفره ببرید.
  • کاغذ واتمن را در جلو حفره و کیسه دیالیز را در پشت کاغذ قرار دهید.
  • الکترو فورز را ادامه دهید (بافر تانک را کمتر کنید به‌طوری‌که روی ژل را نپوشاند).
  • وقتی DNA وارد کاغذ شد، الکترو فورز را متوقف کنید.
  • کاغذ را جمع کرده و به لوله ۰/۵ میلی‌لیتری که انتهای آن سوراخ شده است، انتقال دهید.
  • توسط سمپلر مقدار مناسب از بافر زیر روی کاغذ بریزید: (pH=7.5)
  • ۱۵۰mM NaCl
  • ۲۰mM Tris
  • ۱mM EDTA
  • ۵%SDS

۱۰- لوله مذکور را داخل یک لوله بزرگ‌تر قرار دهید (۱/۵ میلی‌لیتر)، سانتریفیوژ کنید تا مایع از ته لوله کوچک به داخل لوله بزرگ‌تر حرکت کند، چند دفعه این کار را تکرار کرده تا موقعی که دیگر DNA روی کاغذ واتمن مشاهده نشود (با نور UV آزمایش شود).

  • این بافر را جمع‌آوری و با C.I استخراج کرده و با الکل تغلیظ کنید.

 

ب) احیای DNA از روی ژل آگارز Low Melting Point (LMP)

۱- DNA موردنظر را با آگارز LMP ۲% الکتروفورز کنید و اجازه دهید تا نوارهای DNA خوب تفکیک شوند.

۲- با نور UV باند موردنظر را مشاهده کنید.

۳- باند موردنظر را با تیغ اسکالپر تمیز علامت‌گذاری کنید.

۴- ژل را روی کاغذ سفید قرار داده و باند موردنظر را بریده به لوله تمیز دیگر منتقل کنید.

۵- قطعه ژل را یک شب در فریزر ۲۰- درجه قرار دهید.

۶- قطعه ژل را در حرارت اتاق قرار دهید و سپس ۵ دقیقه در آب ۶۵ درجه انکوبه کنید.

۷- محلول حاصل را به دمای اتاق رسانده و دو مرتبه با P.C.I استخراج کنید تا ژل از آن حذف شود.

  • استات سدیم (غلظت نهایی ۳M) را به محلول اضافه کرده با الکل رسوب دهید.

 

استخراج پلاسمید در مقیاس کم (Mini preparation)

استخراج پلاسمید با روش آلکالین و به‌صورت Mini preparation در موارد غربالگری کلنی[۴]  استفاده می‌شود، ولی برای کارهای حساس‌تر، پلاسمید به‌صورت حجم بالا[۵] استخراج می‌گردد. برای استخراج پلاسمید، سلول باکتری با محلول GTE (گلوکز، تریس، EDTA) لیز شده و محتویات آن آزاد می‌شود. DNA ژنومی و پروتئین‌های سلولی را با محلول قلیا (NaOH و SDS) دناتوره کرده (در این روش DNA سوپرکویل دناتوره نمی‌شود) و بلافاصله با اسیدی کردن محیط و ایجاد سرما DNA ژنومی و پروتئین‌ها را رسوب می‌دهیم. در این فرآیند پلاسمید به‌صورت محلول باقی می‌ماند که توسط سانتریفیوژ آن را از فاز آلی (پروتئین‌ها) جدا می‌کنیم.

 

روش کار:

  • مقدار ۱/۵ میلی‌لیتر کشت شبانه (باکتری حاوی پلاسمید) را به مدت ۵ دقیقه با ۴۵۰۰rpm سانتریفیوژ کنید.عده‌ای معتقدند چنانچه رسوب را با محلول STE سوسپانسیون کرده و دوباره سانتریفیوژ کنیم (شستشو دهیم) واکنش‌های آنزیمی بهتر انجام می‌شود.

STE: (pH=8)

  • ۱۰۰mM NaCl
  • ۱۰ mMTris
  • ۱mM EDTA
  • رسوب را در ۱۰۰μl محلول Iبه‌صورت سوسپانسیون درآورید (محلول روی یخ سرد شده باشد).

 

محلول I: (pH= 5)

  • ۸mM glucose
  • ۲۵mm Tris
  • ۱۰mM EDTA

۳-. میکروتیوب حاوی واکنش را مدت ۱۰-۵ دقیقه در هوای اتاق قرار دهید.

۴٫- مقدار ۲۰۰μl از محلول II تازه تهیه‌شده را به لوله واکنش اضافه کرده، درب لوله را ببندید و با وارونه کردن آن محلول را خوب مخلوط کنید و ۵ دقیقه روی یخ قرار دهید.

 

محلول II:

  • ۲N  NaOH
  • ۱%  SDS

۵- مقدار ۱۵۰μl از محلول III (سردشده روی یخ) را به لوله واکنش اضافه کنید. درب لوله را بسته و به آهستگی ۱۰ دفعه آن را وارونه کنید و مدت ۱۵ دقیقه روی یخ قرار دهید.

 

 محلول III:

  • ۶۰ میلی‌لیتر ۵M AcoK
  • اسید استیک ۱۱/۵ میلی‌لیتر
  • آب مقطر ۲۸/۵ میلی‌لیتر

این محلول دارای ۳ مولار پتاسیم و ۵ مولار استات است. وقتی این محلول به واکنش اضافه می‌شود باید یک رسوب سفید رنگ در داخل لوله پدیدار گردد.

۶- مدت ۲۰ دقیقه با ۱۲۰۰۰xg آن را سانتریفیوژ کنید.

۷- محلول رویی (تقریباً ۴۵۰ میکرولیتر) را به لوله دیگر انتقال دهید (حاوی پلاسمید می‌باشد).

۸- سدیم استات با غلظت نهایی ۰٫۳M را به آن اضافه کنید (عده‌ای این مرحله را ضروری نمی‌دانند).

۹- دو برابر حجم آن اتانل مطلق سرد اضافه کنید.

۱۰- مدت ۱۵ دقیقه آن را سانتریفیوژ کنید تا پلاسمید رسوب کند. الکل را حذف کنید (حتماً لوله را وارونه روی کاغذ جاذب‌الرطوبه قرار دهید).

۱۱- روی رسوب الکل ۷۰ درجه (۱۰۰ میکرلیتر) اضافه کنید و آن را ورتکس کنید، به‌طوری‌که رسوب کنده شده و در الکل شناور شود.

۱۲- مدت ۳ دقیقه در حرارت اتاق آن را سانتریفیوژ کنید (شستشو دادن با الکل).

۱۳- الکل را خالی کرده و رسوب را در حرارت ۷۰ درجه خشک‌کنید.

۱۴- رسوب را در ۵۰ میکرولیتر آب یا  بافر ( TE) حل کنید.

TE= pH 8

  • ۱۰mM Tris
  • ۱mM EDTA

 

استخراج پلاسمید در مقیاس بالا (Large scale Plasmid DNA preparation):

  1. مقدار ۵۰۰ میلی‌لیتر کشت شبانه را در ۴۰۰۰g به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را خالی کرده و لوله را وارونه روی کاغذ خشک‌کن قرار دهید تا خشک شود. رسوب را با STE سوسپانسیون نموده و دوباره سانتزیفیوژ کنید و سپس لوله را وارونه قرار داده تا خشک شود.

STE = (pH=8)

  • ۱۰۰mM NaCl
  • ۱۰ mMTris- base
  • ۱mM EDTA
  1. رسوب را در ۱۰ میلی‌لیتر محلول Iحل کنید.

 

Solution I: (pH=8)

  • ۵۰ mM glucose
  • ۲۵ mM Tris
  • ۱۰ mM EDTA
  1. آن را خوب سوسپانسیون کنید و ۱۰ دقیقه در هوای اتاق قرار دهید.
  2. مقدار ۲۰ میلی‌لیتر از محلول II تازه تهیه‌شده را به آن اضافه کرده، درب لوله را ببندید و با وارونه کردن آن محلول را خوب مخلوط کنید و ۵ دقیقه روی یخ قرار دهید.

 

Solution II:

  • ۲N  NaOH
  • ۱% SDS
  • ۵٫ مقدار ۱۵ میلی‌لیتر از محلول III به واکنش اضافه کنید و ۱۵ دقیقه لوله را روی یخ قرار دهید.

Solution III:

  • ۶۰ ml of 5M ACOK,
  • ۵ ml of Acetic Acid,
  • ۵ ml of ddH2O

(این محلول دارای ۳ مولار پتاسیم و ۵ مولار استات است). وقتی این محلول اضافه می‌شود باید یک رسوب سفید رنگ پدیدار گردد (می‌توان با پر و خالی کردن محلول توسط پیپت، پروتئین‌ها را شکست).

  1. مدت ۲۰ دقیقه با ۲۰۰۰۰xg آن را سانتریفیوژ کنید.
  2. محلول روییرا (تقریباً مقدار ۱۵ میلی‌لیتر) به لوله جدید انتقال دهید.
  3. مقدار ۰/۶ حجم اولیه (۱۲ میلی‌لیتر) ایزوپروپانلرا به آن اضافه کنید و خوب مخلوط کرده و ۱۵ دقیقه در حرارت اتاق قرار دهید.
  4. در حرارت اتاق و مدت ۱۵ دقیقه آن را سانتریفیوژ کنید تا پلاسمید در ته لوله رسوب کند (توجه: اگر در ۴ درجه انجام شود، نمک‌هارسوب می‌کنند).

مایع رویی را حذف کنید (حتماً لوله را وارونه قرار دهید) و رسوب را با الکل ۷۰ درجه و در حرارت اتاق شستشو دهید (مقدار ۱۰ میلی‌لیتر الکل ۷۰ درجه به هر لوله اضافه کرده و با g17000 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید). الکل را خالی کرده و آن را در حرارت ۷۰ درجه خشک‌ کنید. رسوب را با ۸ میلی‌لیتر آب یا بافر TE حل کنید.

 

[۱] Dimethyl sulfoxide

[۲] هیدروکسی اتیل آمینواتیل هیدروکلرید

[۳] Phenol/chloroform/isoamyl alcohol

[۴] Colony screening

[۵] Large scale

استخراج و خالص‌سازی DNA پلاسمیدی از سودوموناس آئروجینوزا

کاوشگرها

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید

برچسبها
  • اسیدهای نوکلئیک
  • دکتر رضا میرنژاد
  • دکتر مهدی فصیحی رامندی
  • زهرا کریمی

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *