کنترل کیفی در آزمایشگاه میکروب شناسی

کنترل کیفی در آزمایشگاه میکروب شناسی 

مریم ترابی رپو-کارشناس ارشد میکروب شناسی – بیمارستان شهید بهشتی شیراز

مواظبت کردن از وسایل آزمایشگاهی از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. اگر وسایلی را که استفاده می‌کنیم از نظر کیفیت وضعیت خوبی نداشته باشند یا به طور مطلوب نگهداری نشوند کیفیت آزمایش‌ها را تحت تأثیر قرار می‌دهد.

این گفتار دستگاه‌ها و وسایل کار را از دیدگاه کنترل کیفی مورد بررسی قرار می‌دهد.

 

انکوباتور

انکوباتور محفظه عایق بندی شده‌ای است که دما و رطوبت را کنترل کرده و محیط را برای رشد میکروارگانیسم‌ها فراهم می‌سازد. برخی از انکوباتورها برای نگهداری میزان مطلوب از دی‌اکسیدکربنCo₂  برای میکروب‌هایی که برای رشد به CO2 نیاز دارند (Capnophilic) در دسترس هستند.

– انکوباتور بدون Co₂:

در این انکوباتور نمونه‌ها باید بطور مناسب روی سینی‌ها یا قفسه‌ها قرارگیرد.

می‌توان با قرار دادن یک مخزن آب در کف انکوباتور، رطوبت مورد نیاز را حفظ کرد.

– انکوباتور Co₂دار:

دراین انکوباتور برای تأمین دی‌اکسید کربن مورد نیاز از کپسول گازCO2  استفاده می‌شود.

در صورت اتمام کپسول گاز Co₂، تا زمان شارژ مجدد می‌توان جهت انکوباسیون نمونه‌های نیازمند Co₂ از جار بیهوازی یا کندل جار که از سوزاندن شمع به عنوان منبع CO2 استفاده می‌شود بصورت جایگزین استفاده کرد.

– مراقبت از انکوباتور:

• همه انکوباتورها باید بطور ماهانه با محلول صابون ملایم تمیز شوند.
• کپسول‌های Co₂ به منظور رعایت موارد ایمنی، باید به صورت ایستاده با زنجیر سنگین به دیوار محکم شوند.

زمانی که از سیلندرها استفاده نمی‌شود، سوپاپ‌ها و درپوش‌ها باید به طور محکم بسته شوند. سیلندرهای خالی را روی حمل کننده سیلندر گاز به طور محکم با زنجیر نگهداری کنید. هرگز سیلندرهای گاز را در دمای بالاتر از ۵۲ درجه سانتیگراد یا ۱۲۵ درجه فارنهایت نگهداری نکنید. جهت جلوگیری از نشت، سیلندرها را در وضعیت افقی قرار ندهید.

برای کنترل وضعیت CO2 انکوباتور، یک کشت از نیسریا گونوره در انکوباتور قرار دهید، هر روز آن را پاساژ داده و رشدش را بررسی نمایید. این ارگانیسم به  Co₂ نیاز کامل دارد.

 

اتوکلاو

اگر چه اتو کلاو بهترین وسیله برای استریلیزاسیون است، ولی طولانی شدن مرحله گرمایی، سبب کاهش کیفیت مواد مغذی در محیط‌های کشت کمپلکس محتوی قند، مواد معدنی و فلزی می‌شود و در نتیجه به محیط‌های کشت زیان وارد می‌کند، بنابراین در چرخه‌ی استریلیزاسیون باید از زمان کوتاهتر و دمای بالاتر استفاده کنیم تا علاوه بر آنکه آسیب کمتری به محیط کشت وارد شود، برای ارگانیسم کشنده‌تر باشد.

– انواع استریلیزاسیون

• استریلیزاسیون محیط‌های کشت و محلول‌ها
• استریلیزاسیون مواد مصرفی آلوده
• استریلیزاسیون مواد خشک بسته بندی شده

نکات کاربردی:

• بهتر است از لوله و ارلن با در پیچ‌دار شل که بیشتر از آن پرنشده است استفاده کنید.
• جهت برقراری جریان مناسب سفارش می‌شود که از قرار دادن اشیا بر روی یکدیگر بپرهیزید و باید فاصله اشیا از یکدیگر و از دیواره‌های اتوکلاو حداقل ۵ سانتیمتر باشد.
• چرخه‌ی استریلیزاسیون باید متناسب با زمان نفوذ گرما در نظر گرفته شود، برای مثال محتویات یک ظرف یک لیتری محیط کشت باید طی ۱۵ دقیقه از زمان رسیدن محفظه به دمایc ˚۱۲۱، به این دما برسد.

 

• استریلیزاسیون مواد مصرفی آلوده
• مواد مصرفی آلوده را جدا نموده و در کیسه‌های قابل اتوکلاو قرار دهید و بر روی آنها برچسب خطر بیولوژیک (Biohazard) نصب کنید.
• برای اطمینان از نفوذ بخار به همه قسمت‌های کیسه، یا گره آن را شل کنید یا قبل از محکم کردن گره، یک پیمانه (۰٫۳ لیتر) آب به آن اضافه کنید.
• برای جلوگیری از مسدود شدن آبگذر اتاقک اتوکلاو توسط آگار مذاب، کیسه‌ها را داخل سطل فلزی قرار دهید.
• زمان لازم برای استریلیزاسیون زباله، ۶۰-۳۰ دقیقه در ۱۲۱ درجه سانتیگراد یا ۳۰-۱۵ دقیقه در ۱۳۴ درجه سانتیگراد می‌باشد.
• استریلیزاسیون مواد خشک بسته بندی شده از قبیل سوآب و لوله آزمایش:
• بسته‌ها را طوری در اتوکلاو قرار دهید که حداکثر چرخش بخار در بین آنها ایجاد شود وبا دیواره‌های اتوکلاو نیز تماسی نداشته باشند.
• کنترل اتوکلاو با تست شیمیایی:
• نوار کاغذی TST Tempreture ,Steam ,Time)): این نوار در هر سری کاری سه عامل زمان، بخار و دما را کنترل می‌کند و از زرد به بنفش تغییر رنگ می‌دهد.
• کنترل اتوکلاو با تست بیولوژیک:

استفاده از ویال حاوی اسپور باسیلوس استئاروترموفیلوس ATCC 79 53 بطور هفتگی سفارش می‌شود، زیرا اسپورهای این باکتری به عنوان مقاوم‌ترین اسپورها به حرارت در اتوکلاو با درجه حرارت ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه از بین می‌روند. پس از پایان استریلیزاسیون، ویال را خارج کرده و با فشار به جداره آن محوطه درونی حاوی اسپور را می‌شکنند تا اسپورها در محیط کشت آزاد شوند؛ سپس این محیط را در حرارت ۵۵ درجه سانتیگراد قرار داده و در مدت یک هفته از نظر تغییر رنگ اندیکاتور موجود محیط کشت را کنترل می‌کنند. در صورتی که تغییر رنگ مشاهده نشد یعنی اسپورها در اثر استریلیزاسیون مرده‌اند و استریلیزاسیون کامل صورت گرفته است در صورت تغییر رنگ اندیکاتور محیط کشت یعنی اسپورها زنده مانده‌اند.

• راهبردهای ایمنی هنگام کار با اتوکلاو:
• از دستکش مقاوم به حرارت و محافظ چشم استفاده کنید.
• بعد از اتمام کار وقتی فشار اتاقک اتوکلاو به صفر رسید درب آنرا باز کنید. منتظر بمانید تا ظروف کمی خنک شوند، سپس آنها را حمل کنید.
• هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه اقدام به بارگذاری یا خارج نمودن وسایل و مواد ننمایید.
• هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه و اتصال الکتریکی آن به پریز، اقدام به تمیز نمودن آن نکنید.
• هرگز پیچ‌های محکم کننده‌ی درب را در هنگام کار دستگاه شل و سفت نکنید.

 

 فور (OVEN):

فور برای استریل کردن وسایلی که نباید بطور کامل تحت نفوذ بخار قرار گیرند، اما می‌توانند دمای بالای مورد نیاز مثـل ۱۶۰-۱۸۰˚c را تحــمل کنند، به کار می‌رود. فور بویژه برای ظروف شیشه‌ای مثل لوله آزمایش، پتری‌ دیش، پیپت و نیز برای آلات فلزی مثل پنس، اسکالپل و قیچی به کار می‌رود.

فور باید دارای فن (جهت چرخش هوای متراکم در سراسر اتاقک)، نشانگر درجه حرارت، ترموستات و تایمر، طبقات مشبک، قفل داخلی درب و عایق بندی مناسب جداره‌ها باشد.

استریلیزاسیون در فور:

• برای بسته بندی وسایل جهت استریل نمودن آنها در فور می‌توان از فویل آلومینیومی یا کاغذ کرافت (کرافت به آلمانی معنی قدرت را می‌دهد و کاغذ کرافت از نظر مقاومت، ماده‌ای قوی محسوب می‌شود) استفاده نمود.
• حدود ۲ سانتیمتر از انتهای فوقانی پیپتها را با پنبه‌ی غیر جاذب ببندید و آنها را در ظروف فلزی قرار داده، درب آنها را ببندید.
• در صورتی می‌توان بطری‌های درپوش‌دار را در آون استریل کرد که درپوش و آستری آنها از موادی مثل فلز، پلی‌پروپلین یا لاستیک سیلیکون ساخته شده ‌باشد تا در دمای استریلیزاسیون از شکل طبیعی خارج نشوند.
• پودر، چربی، روغن و گریس مثل پارافین را در ظرف شیشه‌ای یا فلزی استریل نمایید.
• قبل از قرار دادن ظروف شیشه‌ای در آون، از خشک بودن آنها مطمئن شوید. مواد را به گونه‌ای در آون قرار دهید که هوای داغ در اطراف و مابین آنها در جریان باشد.
• زمان استریلیزاسیون از وقتی آغاز می‌شود که اتاقک به دمای استریل انتخابی برسد و نیز مدتی هم بیشتر در نظر گرفته می‌شود تا همه قسمت‌های اتاقک و مواد داخل آن به دمای مورد نظر برسند (c˚۱۸۰-۱۶۰ به مدت ۲ ساعت).
• به دلیل عایق بودن دستگاه، چند ساعت طول می‌کشد تا اشیاء داخل آن خنک شود، مگر آن که مجهز به فن باشد. درب آون را باز نکنید تا اتاقک، ظروف و مواد داخل آن تا دمای حدود۶۰ ˚c خنک شوند. اگر هوای سرد ناگهان وارد دستگاه شود ممکن است ظروف شیشه‌ای ترک بخورند.

کنترل فور با تست بیولوژیک:

استفاده از ویال حاوی اسپور باسیلوس استئاروترموفیلوس ATCC 7953

برای ارزیابی فور نوار بیولوژیک را در یک لوله آزمایش گذاشته و در محل‌هایی با تراکم بیش از حد وسایل و نقاط کور دستگاه قرار می‌دهیم و پس از طی شدن فرایند استریلیزاسیون آنها را برای کشت به آزمایشگاه ارسال می‌کنیم، اگر کشت مثبت اعلام گردید نشانه ناکارآمدی دستگاه است.

• ایمنی:

استفاده از دستکش مقاوم به حرارت و محافظ چشم

 

کنترل کیفی محیط‌های کشت:

محیط‌های کشت نقش اساسی را در آزمایشگاه میکروب شناسی ایفا می‌کنند و بطور گسترده‌ای جهت جدا‌سازی ارگانیزم‌ها، تعیین سوش و آنتی‌بیوگرام میکروارگانیسم‌های بیماریزا بکار می‌روند. بسیاری از آزمایشگاه‌ها بطور روتین محیط‌های کشت مورد نیاز برای مصارف تشخیصی و تحقیقاتی را خودشان تهیه می‌نمایند؛ با این همه اطمینان از اینکه محیط‌های کشت، کیفیت خوب و نتایج مطلوبی داشته باشند بایستی در تهیه و مصرف محیط‌های کشت معیارهای زیر را در نظر گرفت:

• مواد خام

کیفیت محیط‌ها بطور مستقیم بستگی به کیفیت مواد خام مورد استفاده در تهیه آنها دارد. آب یکی از مهم‌ترین مواردی است که در تهیه محیط‌های کشت بکار می‌رود. سه معیار مهم آب مورد استفاده در تهیه محیط‌های کشت شامل وجود یون‌های مس، قدرت هدایت الکتریکی وpH  می‌باشد. در شرایط ایده‌آل نباید یون‌های مس در آب مورد استفاده جهت تهیه محیط‌های کشت وجود داشته باشد چون خاصیت مهار کنندگی برای میکرو‌ارگانیسم‌ها را دارد. pH آب مورد استفاده بهتر است کمی اسیدی باشد ولی در هر حال نباید کمتر از ۵/۵ باشد.

• پتری دیش:

کیفیت پتری دیش‌های مورد استفاده در تهیه محیط نیز اهمیت دارد. معمولأ پتری دیش‌ها را با اتیلن اکساید و یا اشعه گاما استریل می‌کنند. در صورت استفاده از پتری دیش‌هایی که با اتیلن اکساید استریل شده باشند بایستی به روش کروماتوگرافی وجود یا بقایای این ماده بررسی شود. اتیلن اکساید دارای خاصیت مهار کنندگی برای میکروارگانیسم‌ها می‌باشد.

• استریل کردن محیط‌های کشت:

استریل کردن، یک مرحله اساسی در تهیه محیط‌های کشت است. معمولأ برای استریل کردن محیط‌های کشت از اتوکلاو استفاده می‌کنند، با این همه ارتباط نزدیکی بین مدت زمان لازم جهت استریل کردن و حجم محیط وجود دارد. حرارت بیش از حد ممکن است منجر به تخریب محیط‌های کشت گردد، بنابراین تنظیم دما و مدت زمان آن اهمیت ویژه‌ای دارد. در شرایط معمولی دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه برای استریل کردن یک لیتر محیط کشت کافی است. در صورتیکه حجم محیط کشت بیش از یک لیتر باشد ممکن است مدت زمان بیشتری لازم باشد.

-پارامترهای فیزیکی:

محیط کشت‌های تهیه شده باید از لحاظ فیزیکی و ظاهری بررسی شوند. معیارهای ظاهری قابل بررسی شامل وجود حباب، حفره، ناصافی سطح محیط، ترک خوردگی و یخ زدگی می‌باشد. ضخامت محیط نیز اهمیت دارد. ضخامت محیط کشت در پلیت ۴ میلیمتر است.

• نگهداری محیط‌های کشت تهیه شده:

طول عمر محیط‌های کشت بستگی به محتویات محیط کشت، نحوه نگهداری و انبار کردن آنها دارد. تمامی محیط‌های کشت باید دور از نور آفتاب نگهداری شوند. تابش نور به محیط‌های کشت موجب تشکیل مواد باکتریواستاتیک و باکتریوساید مانند پراکسیداز می‌گردد. حداقل طول عمر پلیت‌های کشت در دمای ۴ درجه سانتیگراد یک هفته می‌باشد، ولی اگر در داخل کیسه‌های پلاستیکی بسته بندی شوند بطوریکه هوا داخل آنها نفوذ نکند ۴-۳ هفته قابل مصرف هستند. طول عمر محیط‌ کشت‌های حاوی آنتی‌بیوتیک بستگی به پایداری آنتی‌بیوتیک موجود در آن دارد. در مجموع محیط‌های حاوی آنتی‌بیوتیک را در عرض یک هفته باید مصرف کرد. از سوی دیگر با گذشت زمان اینگونه محیط‌های کشت رطوبت خود را از دست داده، بدلیل افزایش غلظت آنتی‌بیوتیک قدرت انتخابی آنها افزایش می‌یابد. دمای پلیت‌ها را باید قبل از مصرف به دمای اتاق رساند. اگر پلیت محیط کشت بیش از ۸ ساعت در دمای اتاق باقی بماند برای مصرف مناسب نیست. محیط‌های کشت تهیه شده در لوله در مقایسه با محیط‌های کشت پلیتی عمر طولانی دارند. اگر این محیط‌های کشت تهیه شده در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند ۶-۳ ماه قابل مصرف می‌باشند.

 

اشکالات رایج در محیط‌های کشت

اشکال	علت
نرم بودن آگار	حرارت بیش از حد، pH پایین که موجب هیدرولیز آگار می‌گردد. اشتباه در وزن کردن، مخلوط نکردن خوب و عدم حل شدن
pH نامناسب	استفاده از شیشه‌های قلیایی، آب ناخالص، حرارت بیش از حد، آلودگی شیمیایی، اندازه‌گیریpH  در حرارت نامناسب، استفاده از pH متر استاندارد نشده و استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده
رنگ نامناسب	ناخالص بودن آب، استفاده از شیشه آلات کثیف، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده، حرارت دادن بیش از حد و pH نامناسب
تیره شدن محیط	حرارت دادن بیش از حد، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده
رشد ضعیف ارگانیسم	استفاده از آب و یا شیشه آلات آلوده، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده، توزین غلط و عدم بهم زدن کافی محیط و حرارت بیش از حد.
افتراق رنگی ضعیف محیط کشت با رشد میکروب‌ها	استفاده از آب و یا شیشه آلات آلوده، استفاده از پودرهای محیط کشت خراب شده، توزین غلط و عدم بهم زدن کافی محیط و حرارت بیش از حد.

 

 

نگهداری دیسک‌های آنتی بیوتیکی

• دیسک‌ها باید در دمای-۸ تا -۱۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
• تمامی دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی گروه بتالاکتام مانند پنی‌سیلین، آمپی‌سیلین، کربنی‌سیلین، تیکارسیلین، اگزاسیلین و نسل اول، دوم و سوم سفالوسپورین‌ها و… باید در فریزر نگهداری شوند و فقط می‌توان مقداری از آن را بر اساس کار روزانه آزمایشگاه حداکثر به مدت یک هفته در یخچال معمولی نگهداری نمود.
• دیسک‌ها باید در ظروف دارای درپوش محکم و حاوی مواد جاذب رطوبت نگهداری شوند.
• دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی باید یک تا دو ساعت قبل از استفاده از یخچال یا فریزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند.

 

تست حساسیت:

تست حساسیت با توجه به رشد نمونه و اهمیت ارگانیسم توسط روش نیمه مک فارلند یا روش استاندارد دیسک دیفیوژن کربی‌بایر انجام می‌شود.

– نگهداری طولانی مدت

برای نگهداری سویه‌های باکتری می‌توان از روش‌های طولانی و کوتاه مدت استفاده نمود.

بهترین روش‌های نگهداری طولانی مدت شامل لیوفیلیزاسیون (Freeze drying) و نگهداری در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد یا پایین‌تر (در دیپ‌فریز یا در نیتروژن مایع) می‌باشد.

در صورت عدم دسترسی به فریزر ۷۰- درجه می‌توان سویه‌های با رشد سریع را در فریزر ۲۰- درجه نیز نگهداری نمود. در این شرایط توجه به نکات زیر ضروری است:

سویه‌های سخت رشد مانند هموفیلوس آنفلوآنزا و نیسریا گنوره در این دما قابل نگهداری نمی‌باشند و باید در فریزر ۷۰- درجه نگهداری شوند.

روش دیگر استفاده از روغن معدنی در دمای اتاق می‌باشد که در این روش روغن معدنی (یا پارافین مایع) را در حرارت خشک (۱۷۰ درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت) استریل می‌نمایند و سپس میکروب مورد نظر را روی محیط کشت داده و بعد از بدست آوردن کشت کافی، روغن استریل را به مقدار cc 1 روی سطح محیط می‌ریزند.

 

کشت خون

بروز سپسیس در سراسر جهان دارای ابتلا و مرگ و میر در حال افزایشی است. آشکار سازی سریع و دقیق باکتریمی برای بهبود وضعیت بیمار ضروری است. مراقبین بهداشتی، پرستاران و احتمالاً بسیاری از کارکنان آزمایشگاهی آموزش لازم و کافی در تکنیک‌های صحیح کشت خون را فرا نگرفته‌اند. از دیرباز پزشکان و میکروبیولوژیست‌ها به اهمیت کشت خون بعنوان یکی از مهم‌ترین تست‌های آزمایشگاهی برای تشخیص بیماری‌های مهلک پی برده بودند. در سال‌های اخیر مشخص شده که کشت‌های خون آلوده شده (ورود و حضور یک پاتوژن از خارج از جریان خون) که منجر به نتایج مثبت کاذب می‌شوند شایع هستند. کشت‌های خون آلوده شده حدود نصف و یا بیشتر از نیمی از موارد تمام کشت‌های خون مثبت را در بعضی مراکز به خود اختصاص می‌دهند و این مسئله هم موجب تحمیل هزینه‌های بسیار برای بیماران و نیز سیستم مراقبت بهداشتی و درمانی شده و همچنین باعث سردرگمی تکنیسین‌ها شده است.

دلائل متعددی وجود دارد که چرا کشت‌های خون غالباً آلوده می‌شوند؛ احتمالاً مهم‌ترین فاکتور مربوط به نحوه‌ی نمونه‌گیری است که پرستار یا نمونه‌گیر از تکنیک مناسب آسپتیک استفاده نمی‌کند. مطالعات مختلف نشان می‌دهند که فلبوتومیست‌های آموزش‌دیده و یا تیم‌های کشت خون نسبت به سایرین دارای میزان کمتری از کشت‌های خون آلوده هستند. فاکتور دوم مربوط به ماده‌ی آسپتیک به تنهائی است، تنتور ید و کلرهگزیدین گلوکونات (chlorhexidine gluconate) برای استریلیزاسیون پوست نسبت به یدوفورها مثل پوویدون ایوداین (povidone iodine) بسیار مؤثرتر هستند. فاکتور سوم طریقه فراهم کردن نمونه‌ی خون برای کشت است. در سالیان اخیر تمایلی برای بدست آوردن نمونه از طریق کاتترهای داخل رگی و یا از طریق دستگاه‌های دیگر مثل پورت‌ها پدید آمده و کشت‌های خون بدست آمده از این طریق بیشتر از نمونه‌هائی که از طریق خونگیری از عروق محیطی صورت گرفته آلودگی نشان داده‌اند. چهارمین علت سیستم‌های کشت خون مدرن و محیط‌های کشتی است که در آنها از رزین‌های باند شده به آنتی‌بیوتیک و یا ذغال فعال استفاده می‌کنند. این سیستم‌ها اگرچه پاتوژن‌های بیشتری را آشکار می‌کنند اما از طرف دیگر استافیلوکوک‌های کوآگولاز منفی را بعنوان شایع‌ترین آلوده‌کننده‌ی کشت خون افزایش داده‌اند.

برای کشت خون معمولاً یک ست نمونه به بطری کشت هوازی و دیگری به بطری کشت غیرهوازی اضافه می‌شود. نخست نمونه را با سرنگ به بطری بی‌هوازی اضافه کرده و چنانچه حباب هوا در سرنگ باشد ابتدا به بطری هوازی خون اضافه می‌شود. مقدار خون دریافتی لازم از بزرگسالان ۱۰ الی ۲۰ میلی‌لیتر می‌باشد. از کودکان و نوزادان ۱ الی ۵ میلی‌لیتر خون دریافت می‌شود. محیط‌های کشت خون در داخل بطری‌های شیشه‌ای در اندازه‌های متفاوت بصورت هوازی و میکرو                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                       آئروفیلیک و بیهوازی توسط شرکت‌های مختلف تولید می‌شوند. مقدار تلقیح نمونه خون باید به نسبت یک به پنج تا یک به ده در نظر گرفته شود.

آلوده کننده‌های کشت های خون:

با ضدعفونی کردن محل خونگیری، رعایت کامل شرایط سترونی و استاندارد در موقع خون‌گیری و تلقیح مستقیم خون به داخل بطری کشت خون می‌توان تا حد زیادی از آلوده شدن کشت‌های خون جلوگیری نمود، هر چند حتی با رعایت این موازین و در بهترین شرایط کاری حدود ۳% تا ۵% کشت‌های خون در معرض آلودگی قرار می‌گیرند. این آلودگی می‌تواند منشأ پوستی یا محیطی داشته باشد. با این حال، چنین ارگانیسم‌هایی گاهی به عنوان عامل بیماریزای واقعی عمل نموده و می‌توانند موجب اندوکاردیت شوند. شرایطی که یک عفونت واقعی را ترسیم می‌کنند بدین شرح است:

– اگر یک ارگانیسم در هر دو بطری کشت رشد نماید.

-اگر همان ارگانیسم در محیط‌های کشتی که با بیش از یک نمونه بیمار کشت مجدد شده باشد، رشد نماید.

– اگر رشد سریع باشد (در عرض ۴۸ ساعت).

– اگر ایزوله‌های مختلف یک گونه عیناً همان الگوی بیوتیپ و حساسیت دارویی را نشان دهند.

احتیاط‌های ایمنی:

برای اجتناب از بروز عفونت نباید از یک محل دو بار اقدام به خونگیری شود. در مورد خون اخذ شده از بیماران مبتلا به عفونت‌های جدی (هپاتیت و ایدز) هنگام تزریق خون به درون شیشه‌های کشت خون باید دقت نمود تا سرسوزن در دست فرد خونگیر فرو نرود. سر‌سوزن‌های استفاده شده بدون گذاشتن درپوش آن، در ظروف خاص قرار داده می‌شود.

زمان نمونه‌گیری:

خونگیری از بیمار حتی‌المقدور قبل از تجویز آنتی‌بیوتیک باید انجام گیرد، گرچه بهترین زمان خونگیری دقیقاً قبل از شروع تب و لرز بیمار است، ولی آنچه که مهم است حجم خون کافی برای کشت است. توصیه می‌شود ۲ تا ۳ نمونه خون به فاصله یک ساعت از بیمار گرفته و کشت داده شود. خونگیری بیش از ۳ بار ندرتاً لازم می‌شود. اگر فرصت کافی قبل از شروع درمان وجود نداشته باشد از دو ناحیه بطور جداگانه مقدار ۳۰ میلی‌لیتر خونگیری انجام می‌گیرد. در موارد تب با علت ناشناخته FUO، انجام ۴ کشت خون جداگانه (در دو روز و هر روز ۲ کشت) می‌تواند اکثر عوامل بیماریزا را مشخص سازد.

نگهداری و انتقال:

انتقال نمونه خون در عرض ۲ ساعت در حرارت اتاق انجام می‌گیرد. در صورتی که تأخیر بین گرفتن نمونه و کشت بیشتر باشد باید نمونه در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد گذاشته شود. شیشه‌های کشت خون تلقیح شده  نبایستی در یخچال نگهداری شود. محیط‌های کشت خون تهیه شده بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شده و در انکوباتور (گرمخانه) قرار داده می‌شود.

 

مایع نخاع

آزمایش مایع نخاع یک گام ضروری در تشخیص مننژیت باکتریال و قارچی است و CSF نمونه‌ای است که باید هرچه سریعتر آزمایش شود. مایع نخاع به طور طبیعی استریل و شفاف بوده و معمولاً حـــــاوی ۵ لکوسیت تک هسته‌ای یا کمتر در میلی‌متر مکعب می‌باشد و هیچ گلبول قرمزی ندارد. ترکیب سلولی و شیمیایی مایع نخاع با التهاب مننژ یا مغز مانند مننژیت یا انسفالیت تغییر می‌کند.

اگر CSF خیلی کدر باشد می‌توان بدون سانتریفیوژ آزمایش کرد. در موارد دیگر CSF را در یک لوله استریل درپیچ‌دار به مدت ۱۵-۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کرده و محلول روئی را با پیپت پاستور استریل خارج نموده و آن را در لوله استریل دیگری برای انجام تست‌های شیمی و سرولوژی می‌ریزیم و رسوب را برای میکروب شناسی نگه می‌داریم.

از رسوب تهیه شده حتماً یک لام گرم تهیه کرده و کاملاً بررسی می‌کنیم. حساسیت رنگ‌آمیزی گرم در تشخیص میکروب‌ها ۹۰-۶۰ درصد و وابسته به نوع و تراکم میکروب است. برای بیمارانی که در نمونه CSF تعداد زیادی گلبول سفید دارند ولی در رنگ گرم میکروبی مشاهده نمی‌شود، استفاده از رنگ‌آمیزی آکریدین نارنجی حساس‌تر است.

ممکن است در سطح نمونه CSF توبرکلوزی یا سلی یک لایه شبیه به رشته‌های تار عنکبوت (Cob-Web) مشاهده گردد که سفارش به کشت و رنگ‌آمیزی اسیدفست بر روی همین لایه می‌شود.

اگر در رنگ‌آمیزی گرم باکتری مشاهده شد باید روی محیط کشت مناسب برده شود، مثلاً برای جداسازی هموفیلوس آنفلوانزا از آگار خوندار، از یک کشت استافیلوکوک اورئوس که رشد آن را تحریک کند استفاده می‌کنیم. پلیت‌های آگار خوندار و شکلات آگار باید در ۳۵ درجه سانتیگراد در اتمسفر غنی از CO2 کشت داده شود. همه محیط‌ها را باید به مدت ۳ روز در اتو نگهداری کرد.

کریپتوکوکوس نئوفرمنس روی محیط آگار خوندار رشد می‌کند ولی باید محیط کشت را به مدت یک هفته در ۳۵ درجه نگهداری کرد.

خلط

جهت تشخیص سل ریوی «خلط» بهترین نمونه است.

نمونه خلط خوب:

مواد ترشحی حاصل از ریه‌ها پس از سرفه عمیق نمونه مناسبی برای آزمایش خلط می‌باشد.

نمونه‌ای که از حلق یا بینی ترشح می‌شود فقط آب دهان بوده و نمونه خوبی نیست. تعداد باسیل‌ها در خلط‌های دفع شده در زمان‌های مختلف متفاوت می‌باشد. آزمایش تنها یک نمونه خلط برای تشخیص کافی نیست؛ بنابراین باید حتماً «سه نمونه از خلط» مورد آزمایش قرار گیرد.

سه نمونه خلط جهت آزمایش:

«نمونه اول» در اولین مراجعه بیمار به واحد بهداشتی دریافت می‌شود.

«نمونه دوم» خلط صبحگاهی است، برای جمع‌آوری این نمونه بیمار قبل از برخاستن از جای خود، پس از یک نفس عمیق، با سرفه، خلط خارج شده را در ظرف می‌ریزد.

«نمونه سوم» همزمان با مراجعه بیمار برای تحویل نمونه دوم (خلط صبحگاهی) به واحد بهداشتی‌ـ درمانی، دریافت می‌شود.

بهتر است حجم خلط بین ۳ تا ۵ میلی‌لیتر باشد.

تهیه نمونه خلط:

بیمار ابتدا دهان خود را شسته و دندان‌های خود را بدون خمیردندان مسواک کرده و دندان‌های مصنوعی را بردارد تا احتمال آلودگی نمونه کاهش پیدا کند و سرفه‌های عمیق انجام دهد و در صورت نداشتن سرفه چند بار نفس عمیق از بینی می‌تواند به ایجاد سرفه کمک کند. گاهی بخور آب در ابتدای صبح درست پس از بیدار شدن از خواب قبل از شستشوی صورت گرفتن نمونه را راحت‌تر می‌کند و شستشوی دهان با سرم فیزیولوژی یا حتی غرغره نمودن آب خالی قبل از نمونه‌گیری نیز به کم شدن فلور باکتری‌ها کمک می‌کند. خلط خارج شده در یک ظرف دهان گشاد دردار و دارای مشخصات که آزمایشگاه داده است ریخته شود. بهتر است نمونه خلط در سه ظرف جداگانه و در سه روز متوالی، صبح‌ها جمع‌آوری گردد. در روش‌های غربالگری جدید دو نمونه ابتدای صبح در دو روز متوالی پیشنهاد می‌شود.

 

نمونه‌گیری به وسیله سواب از حلق

از کشت حلق برای شناسایی عوامل باکتریایی فارنژیت استفاده می‌کنیم که مهم‌ترین عامل آن، استرپتوکک بتاهمولیتیک گروه Aاست.کورینه باکتریوم دیفتریه هم معمولاً یک غشاء سفید مایل به خاکستری در محل عفونت (حلق، لوزه و …) به وجود می‌آورد. همچنین فارنژیت گنوککی در برخی از کشورها دیده می‌شود

آنژین ونسانت: عفونتی است که توسط برخی باکتری‌های گرم منفی بیهوازی به ندرت در حلق ایجاد می‌شود و ممکن است ایجاد غشاء کاذب نیز بنماید. در رنگ‌آمیزی گرم باسیل‌های گرم منفی Fusiform  و اسپیروکت‌ها دیده می‌شوند که باید با عبارتFusospirochetal complex  گزارش شوند.

کاندیدوز دهانی: کاندیدا به تعداد کم جزء فلور طبیعی دهان است اما در افرادی که از نظر ایمنی ضعیف می‌باشند باعث بیماری می‌شود.

بوسیله سواب استریل در حالی که زبان با آبسلانگ نگه داشته شده است از لوزه‌ها و قسمت خلفی حلق و هر جایی که التهاب و چرک باشد با کمی فشار نمونه برداری بعمل آید.

کشت در محیط ژلوز خوندار انجام می‌شود و در تست آنتی‌بیوگرام هم یک دیسک کوتریموکسازول و یک دیسک باسیتراسین قرار می‌دهیم که لازم به ذکر است که استرپ گروه آ حساس به باسیتراسین و مقاوم به کوتریموکسازول است. همچنین قرار دادن پلیت در جار شمع همولیز را واضح‌تر می‌کند. پس از ۱۸ ساعت و مجدداً پس از ۴۸ ساعت باید بدنبال کلنی‌های ریز که بوسیله یک هاله نسبتاً وسیع همولیز احاطه شده‌اند جستجو نمود.

 

نمونه برداری از ناحیه نازوفارنکس

نمونه برداری از حفره‌های بینی بیشتر برای مشخص کردن حاملین استافیلوکوک‌های آرئوس مقاوم به متی‌سیلین و مطالعات اپیدمیولوژیک برای کورینه باکتریوم دیفتری و مننگوکوک انجام می‌شود. در سایر موارد کشت حفره‌های بینی ارزش تعیین کننده‌ای ندارد.

نمونه‌گیری از نازوفارنکس روش انتخابی برای جداکردن بوردتلا پرتوسیس می‌باشد. یک اپلیکاتور کنار و داخل حفره‌های بینی کشیده و آن را در لوله کشت استریل قرار داده و به آزمایشگاه ارسال می‌شود. نمونه از پشت سوراخ‌های بینی در مواردی مثل بیماری سیاه سرفه بهتر است از یک اپلیکاتور فنری که از سوراخ‌های بینی وارد شود و پس از عبور از راه‌های هوایی از پشت سوراخ‌های بینی در ناحیه حلق وارد شود تهیه گردد. اپلیکاتور بهتر است ۳۰ ثانیه در محل بماند تا ترشحات بر روی آن جمع شود. سپس آهسته اپلیکاتور را خارج کرده و در لوله کشت به آزمایشگاه منتقل ‌شود.

نکاتی در مورد جمع‌آوری نمونه‌های ژنیتال

برای جمع‌آوری این نمونه‌ها از یک سوآب با قطر کم یا یک لوپ استریل استفاده می‌کنیم. وضعیت سر و بدنه سوآب جهت اینکار مهم است. برای کشت نایسریا گنوره از سوآب‌هایی از جنس داکرون یا ریون استفاده می‌شود زیرا سواب‌های آلژینات کلسیم و بعضی سواب‌های پنبه‌ای مهار کننده نایسریا بوده، لذا بهتر است از سواب داکرون استفاده شود.

نمونه بعد از برداشت باید سریعاً کشت داده شود. اگر کشت فوری نمونه و انکوباسیون آن به به طور سریع امکان‌پذیر نباشد باید از یک محیط نگاهدارنده مانند آمیز (Amies) یا محیط استوآرت استفاده نموده و باید توجه داشت که نمونه را نباید در یخچال نگهداری کرد.

آسپیراسیون آبسه‌ها و کشت آنها:

آسپیراسیون آبسه فقط باید توسط پزشک صورت گیرد.

پوست روی آبسه/ خیارک بوسیله ایزو پروپیل الکل ۷۰% ضد عفونی شده و مایع به وسیله آسپیراسیون توسط سرنگ استریل جمع‌آوری می‌گردد.

نمونه را به طریق آسپتیک به لوله استریل حاوی محیط انتقالی منتقل کنید. نمونه‌ها جهت بررسی باکتریولوژیک باید در محیط استوارت یا آمیس و سواب‌های مشکوک به عوامل ویروسی در محیط انتقالی ویروس منتقل گردد.

در صورتی که نتوان نمونه‌ها را تا مدت ۲ ساعت بررسی نمود، نمونه‌های باکتریایی به مدت ۲۴ ساعت در دمای محیط قابل نگهداری هستند. نمونه‌ها جهت جداسازی عوامل ویروسی در محیط انتقالی منــاسب در دمای °C8-4 قابل نگهداری بوده و در اسرع وقت باید به آزمایشگاه منتقل گردد.

 

نمونه‌گیری جهت عوامل باکتریایی مولد اسهال

• نمونه مدفوع: حداقل ۵ گرم مدفوع باید در ظرف درپیچ‌دار تمیز، عاری از مواد ضدعفونی کننده و یا شوینده جمع‌آوری گردد.
• سواب مقعدی: سواب را با فرو بردن در محیط انتقالی سترون، مرطوب کرده به اندازه ۳-۲ سانتیمتر در داخل اسفنکتر رکتوم فرو برده و بچرخانید. سواب را بیرون کشیده پس از اطمینان از آغشتگی به مدفوع، سریعاً به داخل محیط انتقال (کری‌بلر) فرو برید. سپس لوله‌های انتقال را در یخچال یا یخدان قرار دهید.
• در موارد اسهال ناشی از باکتری‌های مهاجم مانند شیگلا، ساییدن سواب به مخاط انتهایی روده جهت جمع‌آوری نمونه بسیار مهم است.
• سواب مدفوع: در صورت لزوم به نگهداری نمونه مدفوع بیش از ۲ ساعت، مقدار اندکی از مدفوع و هرگونه بلغم یا تکه‌های مخاط پوششی روده را با فرو کردن سواب سر پنبه‌ای یا سر پلی‌استری به‌ درون مدفوع سریعاً به لوله حاوی محیط انتقالی تلقیح کنید و در یخچال یا یخدان قرار دهید.

 

محیط‌های انتقالی

• کری‌بلر: این محیط برای انتقال بسیاری از عوامل بیماریزا کاربرد دارد. این محیط نیمه جامد بوده، حمل و نقل آن آسان و پس از تهیه تا یکسال در دمای اتاق قابل نگهداری است (به شرطی که حجم آن کاهش نیافته و علائم آلودگی و تغییر رنگ در آن مشاهده نگردد).

 

• آب پپتونه قلیایی ((Alkalane Peptone Water=APW: این محیط را می‌توان برای انتقال ویبریو استفاده نمود ولی این محیط نسبت به کری‌بلر برتری ندارد و فقط در صورت عدم دسترسی به محیط کری‌بلر باید مورد استفاده قرار گیرد (در صورتی که کشت بیش از ۶ ساعت از زمان نمونه‌گیری به تعویق بیافتد نباید از این محیط استفاده گردد). محیط فوق در دمای °C4 تا ۶ ماه قابل نگهداری است.

 

• سالین گلیسرول بافر (Buffered Glycerol Saline=BGS): این محیط برای شیگلا مورد استفاده قرار می‌گیرد و برای انتقال ویبریو مناسب نیست. این محیط مایع بوده، لذا در حمل آن باید دقت شود. همچنین تا ۱ ماه پس از تهیه قابل استفاده است.

 

نگهداری:

• نمونه‌های مدفوع حداکثر تا ۲ ساعت در یخچال قابل نگهداری است. نمونه‌هایی را که نمی‌توان به فاصله ۲ ساعت از نمونه‌گیری کشت داد، باید در محیط انتقالی قرار داده و سریعاً در یخچال نگهداری نمود.
• محیط انتقالی حـاوی سـواب مـدفـوع یا مقعد را می‌توان حداکثر ۷۲-۴۸ ساعت در دمای °C4 نگهداری کرد. در غیر این صورت این محیط می‌بایست ترجیحاً در دمای (°C70-) و یا در صورت عدم دسترسی، در دمای (°C20-) قرار داد (یا حداقل در فریزرهای خانگی نگهداری شود).
• نمونه‌های مدفوع که از بیماران مبتلا به وبا گرفته می‌شود و در محیط انتقالی قرار می‌گیرد نیازی به نگهداری در دمای یخچال ندارند، مگر آن که نمونه‌ها در معرض دمای بالا (بیش از °C40) قرار داشته باشند.

 

ادرار

نمونه ادرار برای بررسی‌های شیمیایی، سلول شناسی و میکروب شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرد. نحوه نمونه‌گیری و ظروف جمع‌آوری ادرار از عوامل مهم در کیفیت نمونه می‌باشد.

جهت بررسی‌های معمول و میکروبیولوژیک نمونه ادرار باید حداکثر تا دو ساعت پس از جمع‌آوری (در دمای اتاق) مورد بررسی قرار گیرد. پس از این مدت ترکیبات شیمیایی ادرار تغییر کرده و عناصر تشکیل دهنده آن شروع به تخریب می‌کنند. سیلندرها، گلبول‌های قرمز و گلبول‌های سفید در نمونه‌های با وزن مخصوص پایین و PH  قلیایی بسیار مستعد لیز هستند.

جهت بررسی‌های باکتری شناسی از نمونه ادرار تمیز استفاده می‌شود؛ بدین صورت که بیمار ابتدا دست‌های خود را با آب و صابون شسته و سپس ناحیه تناسلی خود را با پنبه آغشته به آب و صابون تمیز می‌نماید، بخش اول ادرار را دور ریخته و بخش میانی ادرار را با رعایت شرایط استریل در درون ظرف جمع‌آوری ادرار می‌ریزد و سپس بقیه ادرار را دور می‌ریزد.

نگهدارنده‌ها در خصوص نمونه‌های ادرار و مدفوع

انواع نگهدارنده‌ها در خصوص نمونه‌های ادرار و مدفوع به شرح زیر می‌باشد:

• جهت کشت ادرار و شمارش کلنی، اسید بوریک مناسب است. با استفاده از نگهدارنده نمونه ادرار تا ۲۴ ساعت در دمای اتاق جهت بررسی باکتریولوژیک قابل نگهداری است.
• نمونه مدفوع جهت کشت عوامل باکتریایی را در صورتی که نتوان سریعاً به آزمایشگاه ارسال نمود تا ۲ ساعت در دمای °C4 قابل نگهداری است، در غیر این صورت نمونه‌ها را می‌توان در محیط‌های نگهدارنده و انتقالی نظیر استوارت، آمیس و کری‌بلر منتقل نمود. در بعضی مواقع می‌توان با اضافه نمودن زغال به محیط استوارت و آمیس اسیدهای چرب موجود در سواب‌های پنبه‌ای، که بازدارنده ارگانیسم‌های سخت رشد نظیر نایسریا گونوره و بوردتلا پرتوسیس می‌باشند را جذب نمود.

نگهداری نمونه:

در صورتی که نتوان نمونه‌ها را در اسرع وقت پس از دریافت مورد بررسی قرار داد، باید آنها را در شرایط مناسب نگهداری کرد. دماهای متفاوت مورد استفاده، دمای اتاق (°C22)، دمای یخچال (°C4)، دمای بدن (°C37) و دمای فریزر (°C20- °C70-) می‌باشند که بسته به نوع محیط انتقالی (درصورت استفاده) و عامل اتیولوژیک عفونت متفاوت است.

بعضی نمونه‌ها نظیر ادرار، مدفوع، نمونه جهت بررسی عوامل ویروسی، خلط، سواب‌ها (به غیر از عوامل بیهوازی) و وسایل خارجی نظیر کاتتر را می‌توان در دمای °C4 نگهداری نمود.

• پاتوژن‌هایی که به سرما حساسند باید در دمای اتاق نگهداری شوند. این عوامل ممکن است در نمونه‌هایی که حاوی باکتری‌های بیهوازی بوده و همچنین در اکثر مایعات استریل بدن، نمونه‌های ژنیتال، سواب گوش و چشم نیز موجود باشند.
• نگهداری طولانی مدت بافت‌ها یا نمونه‌ها در دمای °C70- صورت می‌گیرد.
• مایع مغزی نخاعی در صورتی که سریعاً مورد بررسی قرار نگیرد تا ۶ ساعت در دمای °C35 قابل نگهداری است.

 

رفرانس:

• Quality Assurance for commercially prepared Microbiological Culture Media-Second Edition ; Approved standard.- Third edition document M22-A3. Vol. 24 No.19; 2006.
• Oxoid company- General Guide to the use of Oxoid culture Media.
• تکنیک‌های عملی در آزمایشگاه میکروب شناسی، دکتر سیدعلی مهبد، انتشارات کتاب امیر، ۱۳۸۶
• نکاتی پیرامون آزمایشگاه میکروبیولوژی، مؤلف cappoccino& Sherman، مترجم مریم محمدی، انتشارات جنگل، ۱۳۸۰
• Diagnostic microbiology, Elmer W.Koneman,5^th edition, 2006: page 96
• Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Ninth Edition (2006).M2- A9.
• Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Seventh Edition (2006).M7-A7
• Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard— Third Edition (2004).M22-A3
• Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement (2006).M100-S16
• باکتری شناسی عملی، هادی صفدری، جهاد دانشگاهی مشهد، ۱۳۸۲

 

• National committee for clinical laboratory atandards: quality assurance for commercially prepared microbiology culture media ed2 Approved standards; (M22-A22) Wayne, pa 1996 NCCLS
• Mohon CR. Manuselis. Text book of diagnostic Microbiology ed2 –W.B Saunder Company. 2000: pag 257-298
• Clinical dignosis and management by laboratory method, henry, john Bernard, 21 th edition 2007: 154- 177
• Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. 2^nd edition, who, 2003
• مباحث عملی میکروبیولوژی عمومی، مجتبی محمدی، انتشارات مهدیس، ۱۳۸۱
• محیط‌های کشت آزمایشگاهی (موارد مصرف وکنترل کیفی) به انضمام اطلس رنگی محیط‌های کشت؛ گرد‌آوری و ترجمه مهناز صارمی– محمدعلی صارمی؛ آزمایشگاه مرجع سلامت، وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی؛ ۱۳۸۷

 

 

برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید