تایپینگ سوش‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده در بیماران با استفاده از Spoligotyping
مرجان مجابی، کارشناس ارشد میکروبیولوژی Mojabi.Marjan@yahoo.com
مقدمه:
تا اواخر دهه گذشته تنها شاخص‌های در دسترس برای مطالعه اپیدمیولوژی سل، پروفایل‌های حساسیت دارویی و تیپ بندی بر اساس فاژ بوده که استفاده از هر دو روش دارای محدودیت بود. پروفایل حساسیت دارویی سویه‌های مایکوباکتریوم به شدت ناپایدار هستند چرا که سویه‌ها مکرراً مقاومت به داروهای ضد سل در طول درمان را کسب می‌کنند. ارزش نتایج فاژتایپینگ برای ارتباط دادن به سل محدود است، چرا که تنها انواع محدودی از فاژها می‌توانند در بین ایزوله‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شناسایی شوند. در بیشتر مناطق جغرافیایی یک نوع فاژ در بین ایزوله‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس غالب است که بر این اساس موارد مرتبط و غیر مرتبط می‌توانند از یکدیگر متمایز شوند. در سال‌های اخیر تعداد زیادی از روش‌های انگشت نگاری DNA برای تعیین انواع ایزوله‌های مایکوباکتریوم مطرح شدند. این روش‌ها به دو دسته تقسیم می‌شوند: روش‌هایی که پروفایل انگشت نگاری تولید می‌کنند مانند RFLR و IS6110 و روش‌هایی که در سال ۱۹۹۰ برای هدف اپیدمیولوژی مولکولی بیماری سل به کار برده شد (روش‌هایی مثل اسپولیگوتایپینگ و VNTR – IS6110 که اساس آن PCR می‌باشد).
روش RFLR:
در سال ۱۹۹۰ برای هدف اپیدمیولوژی مولکولی بیماری سل به کار برده شد. اساس RFLR مبتنی بر وجود ترانسپوزون‌هایIS6110 بوده که به طور اختصاصی در طول ژنوم کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به تعداد متنوع و در جایگاه‌های مختلف وجود دارد. تعداد و موقعیت این باندها در طول ژنوم گونه‌های مختلف مایکوباکتریوم توبرکلوزیس باعث الگوی انگشت نگاری ژنتیکی می‌شود و به عنوان وسیله‌ای مناسب برای تعیین گونه مورد استفاده قرار می‌گیرد.
از معایب این روش این است که نمی‌تواند گونه‌هایی که دارای تعداد کم یا یکسانی از نسخه‌های IS6110 باشند را شناسایی نماید؛ به همین خاطر امروزه از روش (Variable Number Tandem Repeat) که مخفف آن VNTR می‌باشد استفاده می‌کنند. بیشتر برای تایپینگ سویه‌های مایکوباکتریوم به کار می‌رود و روش سریعی است و آنالیز آن به صورت چشمی صورت می‌گیرد و بسیار پایدار است. در طی مطالعاتی که توسط ساوین و همکارانش انجام شد پایداری الگوی VNTR در بیماران مبتلا به سل در طی ۶ سال مورد بررسی قرار گرفت که نشان داد الگوی VNTR برای پایش بیماران در مدت طولانی روش مناسبی است؛ بدین صورت که اگر تغییری در الگوی VNTR بیمار مشاهده شود نشان دهنده عفونت مجدد با منشأ خارجی است.
در مطالعه دیگری که توسط بارلو و همکارانش در رابطه با مقایسه سویه‌های بیجینگ از غیر بیجینگ با روش VNTR انجام گرفت با استفاده از لوکوس‌های مشخص سویه‌های بیجینگ را از غیر بیجینگ متمایز کردند. امروزه سویه بیجینگ مایکوباکتریوم توبرکلوزیس توجه زیادی را در دنیا به خود معطوف کرده است چرا که ویژگی‌های پاتوژنیک مهمی از جمله مقاومت چند دارویی دارد که این امر احتمالاً به علت وجود آلل‌های مستعد جهش در ژن‌های Mut T می‌باشد.
بررسی الگوی ژنتیکی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از بیماران مبتلا به سل ایرانی و افغانی با استفاده از تایپینگ VNTR:
هدف: متمایز کردن الگوی ژنتیکی سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ایرانی و افغانی با استفاده از هفت لوکوس ژنی با استفاده از روش تایپینگ VNTR
روش بررسی: ۱۹۱ سویه جدا شده از بیماران سل ریوی از نظر الگویVNTR مورد بررسی قرار گرفتند. بین سال‌های ۸۷-۸۵ و با استفاده از پروتوکل استاندارد آنالیز شدن، در نهایت تنوع آللی هر یک از پرایمر‌ها در سویه ایرانی و افغانی محاسبه گردید. بیماران از نظر کلاسیک اپیدمیولوژی که شامل جنس، سن، مقاومت آنتی‌بیوتیکی و سابقه بیماری است و همچنین بیماران بدون سابقه اسمیر مثبت جدید و HIV بررسی شدند.
یافته‌ها: مقایسه تنوع آللی بین سویه‌های ایرانی و افغانی نشان می‌دهد که الگوی VNTR در سویه‌های افغانی نسبت به سویه‌های ایرانی کمتر است، البته به جز لوکوس ETR-E که دارای تنوع بیشتری است. بر اساس شاخص افتراق کل سویه‌ها، لوکوس ETR-A به عنوان لوکوس بسیار افتراق دهنده HGI≥ ۰٫۶ و لوکوس‌های ETR –A و ETR-B و ETR- C و ETR-E و ETR- F به عنوان لوکوس‌های افتراق دهنده متوسطHGI≥۰٫۴ و لوکوسETR-D به عنوان ضعیف‌ترین لوکوس افتراق دهنده شناسایی شدند.
مقاومت آنتی‌بیوتیکی و بیماران با سابقه در سویه‌های افغانی بیشتر از سویه‌های ایرانی بود
نتیجه گیری:
این روش سریع و ساده و دارای حساسیت بالا بوده و در هر بار انجام این روش تعداد ۵۰ نمونه را می‌توان از هم متمایز کرد پس با به کار بردن تعداد لوکوس‌های بیشتر می‌توان قدرت افتراق روش VNTR را افزایش داد.
از این روش برای مطالعات اپیدمیولوژی در سطح وسیع‌تر و بر روی مقادیر کم DNA استخراج شده از کشت‌های اولیه مایکوباکتریایی می‌توان استفاده کرد.