آنالیز اسپرم (۲)

آنالیز اسپرم (۲)

دکتر حمیدرضا هجرانی

۴-۲ بررسی‌های میکروسکپی اولیه

برای بررسی نمونه مایع منی بطور مستقیم (بدون رنگ‌آمیزی) استفاده از میکروسکپ فازکنتراست توصیه می‌شود. ابتدا با بزرگنمایی ۱۰۰ (مثلاً عدسی ۱۰ شیئی و ۱۰ چشمی) موارد زیر را بررسی می‌کنیم:

• وجود رشته‌های موکوس
• تجمع (aggregation) و بهم چسبیدن (agglutination) اسپرم‌ها
• وجود سلول‌های غیر اسپرم مثل سلول‌های اپی‌تلیال و سلول‌های گرد(round cells) در نمونه، سلول‌های گرد شامل گلبول‌های سفید و سلول‌های زایای نابالغ (immature germ cells) می‌باشند. گاهی ممکن است سرهای بدون دم و یا دم‌های بدون سر را نیز مشاهده نمود.

سپس با استفاده از بزرگنمایی ۲۰۰ یا ۴۰۰ موارد زیر را بررسی می‌کنیم:

• ارزیابی حرکت اسپرم‌ها (بخش ۵-۲)
• مشاهده اسپرم‌ها و تعیین رقت مناسب برای شمارش صحیح آنها (بخش ۸-۲)

۱-۴-۲- مخلوط کردن مایع منی و برداشتن نمونه از آن

در صورتی که مایع منی به خوبی مخلوط نشود برداشتن دو نمونه از قسمت‌های مختلف آن باعث می‌شود که نتایج متفاوتی در میزان حرکت، زنده بودن، غلظت و حتی مورفولوژی اسپرم حاصل گردد. مخلوط نمودن نمونه نباید آنقدر شدید باشد که ایجاد حباب نماید. برای این‌کار از یک پی‌پت پلاستیکی یکبار مصرف استفاده نموده و آن را ۱۰ بار در آن آسپیره می‌نماییم. قطر داخلی این پی‌پت باید حدوداً ۵/۱ میلی‌متر باشد. برای مخلوط کردن هرگز از ورتکس استفاده نکنید زیرا باعث تخریب اسپرم‌ها می‌گردد. در صورتی‌که نمونه بخوبی مخلوط شده باشد نتایج حاصل از تکرار آزمایش هم‌خوانی خواهند داشت. برای ارزیابی هم‌خوانی نتایج از توزیع پواسون (poisson distribution) و توزیع دو جمله ای (binomial distribution) استفاده می‌کنیم که شرح آنها در بخش‌های آینده خواهد آمد.

۲-۴-۲- تهیه لام مستقیم

ابتدا نمونه را بخوبی مخلوط نموده و قبل از این‌که اسپرم‌ها ته‌نشین شوند مقداری از آن را برای آزمایش برمی‌داریم. حجم نمونه‌ای که برداشته می‌شود و لامل مورد استفاده باید استاندارد باشد به نحوی‌که فضای زیر لامل حدوداً mμ۲۰ گردد. در این فضا اسپرم‌ها آزادانه حرکت خواهند کرد. برای این کار حدود Lμ۱۰ از نمونه را روی یک لام تمیز قرار داده و آن را با یک لامل ۲۲×۲۲ می پوشانیم و سپس سریعاً بررسی می نماییم. هنگام گذاشتن لامل باید دقت کرد تا حباب هوا در زیر لامل تشکیل نشود.

نحوه محاسبه فضای زیر لامل

از تقسیم حجم نمونه (V) بر سطحی که نمونه در آن پخش می‌شود (A) می‌توان عمق نمونه را در زیر لامل تعیین نمود). بدین‌ترتیب وقتی Lμ۱۰ از مایع منی را روی لام گذاشته و آن را با لامل ^mm22×۲۲ (A=484^mm2) می‌پوشانیم عمق حاصل حدودmμ۲۰ خواهد بود. گاهی ممکن است نیاز داشته باشیم که عمق نمونه در زیر لامل بیشتر باشد، برای این‌کار mμ ۴۰ از نمونه را روی لام گذاشته و یک لامل^mm50×۲۴(A=1200 ^mm2) ‌روی آن قرار می‌دهیم. در این حالت عمقی حدود mμ ۳/۳۳ خواهیم داشت.

توجه:

• اگر عمق نمونه در زیر لامل کمتر از mμ۲۰ باشد اسپرم‌ها دچار حرکات چرخشی خواهند شد.
• اگر عمق نمونه خیلی زیاد باشد اسپرم‌ها دائماً از فوکوس خارج شده و ارزیابی آنها مشکل خواهد بود.
• در صورتی که تعداد اسپرم‌ها در فیلدهای مختلف تفاوت زیادی با هم داشته باشد نشانه آن است که نمونه یکنواخت نمی‌باشد و در این‌صورت باید آن را مجدداً مخلوط نموده و لام دیگری تهیه نماییم.
• یکنواخت نبودن نمونه ممکن است ناشی از قوام غیرطبیعی، عدم سیالیت، چسبندگی یا تجمع اسپرم‌ها باشد.

۳-۴-۲- تجمع اسپرم‌ها (aggregation)

چسبیدن اسپرم‌های بی‌حرکت به یکدیگر و یا چسبیدن اسپرم‌های متحرک به الیاف موکوس، سلول‌های غیر اسپرم و یا ذرات دیگر را تجمع اسپرم (aggregation) می‌‌گویند. (شکل۲-۲)

شکل (۲-۲): تجمع اسپرم‌ها با سلول‌های اپی‌تلیال (a)، اسپرم‌های بی‌حرکت (cوd) و ذرات دیگر (b)

 

۴-۴-۲- بهم چسبیدن اسپرم‌ها(agglutination)

زمانی است که اسپرم‌های متحرک به یکدیگر چسبیده باشند. این چسبندگی ممکن است بین سرها، دم‌ها و یا مخلوطی از آنها باشد. اسپرم‌های بهم‌چسبیده دارای حرکات شدید می‌باشند، اما گاهی چسبندگی به شکلی است که حرکات اسپرم‌ها محدود می‌شود.

بر اساس شدت آگلوتیناسیون (۱ تا ۴) و یا محل اتصال اسپرم‌ها به هم (A تا E) ‌می‌توان طبقه‌بندی‌های زیر را ارائه نمود. (شکل ۳-۲)

الف- بر اساس شدت چسبندگی:

Grade 1(Isolated): کمتر از ۱۰ اسپرم در هر توده آگلوتینه وجود دارد و اکثر اسپرم‌ها آزادند.

Grade 2 (Moderate): حدود ۱۰ تا ۱۵ اسپرم در هر توده آگلوتینه وجود داشته و اسپرم‌های آزاد    نیز وجود دارند.

Grade 3      (Large): بیش از ۵۰ اسپرم در هر توده آگلوتینه وجود دارد اما هنوز هم تعداد کمی اسپرم آزاد دیده می‌شود.

Grade 4      (Gross): تمام اسپرم‌ها بهم چسبیده‌اند و توده‌های آگلوتینه بهم متصلند.

ب- بر اساس محل چسبندگی:

• چسبندگی با سر
• چسبندگی دم با دم. در این حالت سرها آزاد بوده و حرکت می‌کنند.
• چسبندگی نوک دم‌ها با یکدیگر
• چسبندگی سرها با هم و دم‌ها با همدیگر
• چسبندگی توده‌ای، که سرها و دم‌ها در هم تنیده شده‌اند و دیگر بصورت مجزا دیده نمی‌شوند.

 

شکل (۳-۲)

 

      نکته ۱: بهم چسبیدن اسپرم‌ها اگر چه می‌تواند نشانه وجود آنتی‌بادی‌های ضد اسپرم باشد اما دلیلی کافی برای ایمونولوژیک دانستن منشأ ناباروری نیست و نیاز به مطالعات تکمیلی دارد.

      نکته ۲: آگلوتیناسیون شدید می‌تواند در ارزیابی حرکت و غلظت اسپرم تأثیر گذارد.

۵-۴-۲- سایر اجزاء سلولی:

در مایع انزالی ممکن است سلول‌های غیر از اسپرم وجود داشته باشند که برخی از آنها دارای ارزش بالینی هستند. این سلول‌ها شامل سلول‌های اپی‌تلیال دستگاه ادراری– تناسلی و سلول‌های گرد (گلبول‌های سفید و سلول‌های زایای نابالغ) می‌باشند. با رنگ‌آمیزی اسمیر و بزرگنمایی ۱۰۰۰ می‌توان این سلول‌ها را شناسایی نمود. برای شناسایی دقیق‌تر این سلول‌ها می‌توان از رنگ‌آمیزی پراکسیداز (بخش ۱۸-۲) یا تعیین آنتی‌ژن CD45 آنها (بخش ۲-۳) استفاده نمود. برای تعیین غلظت آنها می‌توان مثل شمارش اسپرم با استفاده از لام نئوبار آنها را شمارش کرد و یا اینکه با استفاده از یک اسمیر رنگ‌آمیزی شده و تعیین نسبت درصد آنها و دانستن غلظت اسپرم، تعداد آنها را محاسبه نمود. (بخش ۱-۱۲-۲)

۵-۲ حرکت اسپرم

هرچه تعداد اسپرم‌های متحرک بیشتر باشد احتمال بروز حاملگی افزایش می‌یابد. روش‌های تعیین حرکت اسپرم به کمک کامپیوتر (CASA) در بخش ۲-۵-۳ ذکر شده است.

تحرک اسپرم را باید بلافاصله پس از سیال شدن مایع منی ارزیابی کرد. این زمان ترجیحاً ۳۰دقیقه پس از نمونه‌گیری است، اما در هرحال نباید از یک ساعت تجاوز نماید زیرا دهیدراتاسیون، تغییرات PH یا دما اثرات منفی بر تحرک اسپرم دارند.

برای بررسی تحرک اسپرم ابتدا نمونه را بخوبی مخلوط نموده و قبل از اینکه اسپرم‌ها ته‌نشین شوند لام مستقیمی به عمق حدود mμ۲۰ تهیه می‌کنیم (به بخش ۲-۴-۲ مراجعه شود). حدود یک دقیقه صبر نموده تا نمونه در زیر لام ساکن شود و سپس با بزرگنمایی ۲۰۰ یا ۴۰۰ آن را بررسی می‌نماییم. برای تعیین درصد اسپرم‌های متحرک حدود ۲۰۰ اسپرم را باید ارزیابی نمود. با گرفتن یک لام مجدد از نمونه و تعیین دوباره اسپرم‌های متحرک می‌توان از صحت نتایج اطلاع حاصل نمود.

نکته: آزمایش را می‌توان در حرارت اتاق یا ^∘۳۷ انجام داد. در صورتی که بخواهیم آزمایش در ^∘۳۷ انجام شود باید علاوه بر نمونه، لام و لامل را هم در ^∘۳۷ قرار داد.

۱-۵-۲ طبقه‌بندی حرکت اسپرماتوزوئیدها:

الف- اسپرماتوزوئیدهایی که حرکت پیشرونده دارند (PR): اسپرم‌هایی که در این گروه قرار می‌گیرند بطور فعالانه‌ای حرکت می‌کنند. این حرکت ممکن است در یک خط مستقیم و یا در یک مسیر دایره‌ای بزرگ ‌باشد و سرعت حرکت اهمیتی ندارد.

ب- اسپرماتوزوئیدهایی که حرکت غیرپیشرونده دارند (NP): شامل تمام حالاتی است که اسپرم‌ها حرکت پیشرونده ندارند. مثلاً ممکن است در یک مسیر دایره‌ای کوچک حرکت نمایند یا اینکه فقط یک حرکت فلاژلی جزئی داشته باشند، بطوری که فقط سر یا دم آنها حرکت نماید.

ج- بیحرکت (IM): که اسپرم‌ها فاقد هرگونه حرکت می‌باشند.

توجه:

۱) در چاپ قبلی این کتاب اسپرم‌هایی که حرکت پیشرونده دارند به دو دسته سریع و کند تقسیم می‌شدند و آنهایی که سرعت حرکت بیش از sec/mμ ۲۵ داشتند جزء  grade A طبقه‌بندی می‌شدند، ‌اما این نوع طبقه‌بندی برای تکنسین‌ها مشکل است.

۲) وقتی تحرک اسپرم گزارش می‌شود باید مشخص نماییم که منظور حرکت کل (PR+NP) است یا حرکت پیشرونده (PR)

۲-۵-۲ روش کار:

برای بررسی تحرک اسپرم بهتر است از میکروسکپ فاز کنتراست و بزرگنمایی ۲۰۰ یا ۴۰۰ استفاده نمود. از نمونه یک لام مستقیم به عمق mμ۲۰ تهیه نموده (بخش ۲-۴-۲) و صبر می‌کنیم تا نمونه ساکن شود. میدان‌های دید مختلف را بصورت راندوم بررسی نموده و ۲۰۰ اسپرم را ارزیابی می‌کنیم. بهتر است اسپرم‌هایی را بررسی نماییم که حداقل در فاصله ۵ میلی‌متری از لبه لام قرار دارند (شکلb 4-2). این کار باعث می‌شود تا از اثر خشک شدن لام روی حرکت اسپرم‌ها جلوگیری بعمل آید. ارزیابی تحرک اسپرم‌ها باید سریعاً انجام شود تا اسپرم‌های متحرک از میدان دید خارج نشده و یا وارد آن نگردند. بهترین کار استفاده از میکروسکپی است که لنز چشمی آن بصورت شطرنجی تفسیم‌بندی شده باشد (شکل b 4-2). اگر غلظت اسپرم زیاد باشد فقط ردیف بالای چهارخانه شطرنجی را بررسی می‌کنیم و در صورتی که غلظت اسپرم کم باشد کل چهارخانه را مورد ارزیابی قرار می‌دهیم تا ۲۰۰ اسپرم بررسی گردند. ابتدا اسپرم‌هایی که حرکت پیشرونده دارند (PR) و سپس آنهایی که حرکت غیرپیشرونده دارند (NP) را شمارش نموده و در آخر اسپرم‌های بیحرکت (IM) را می‌شماریم. البته با تمرین و کسب تجربه می‌توان هر سه را با هم شمارش کرد. برای شمارش اسپرم‌ها می‌توان از کانتر استفاده نمود.

 

شکل(۴-۲) ارزیابی اسپرم به کمک لنز شطرنجی (a) و لامل معمولی (b)

 

برای بررسی صحت کار یک لام مجدد از نمونه تهیه کرده و اسپرم‌های PR، NP و IM را مجدداً شمارش می‌نماییم (در ۲۰۰ اسپرم). درصد هر گروه از اسپرم‌ها را در هر بار شمارش محاسبه نموده و میانگین درصد آنها و اختلاف بین دو شمارش را برای اسپرم‌های PR، NP و IM بدست می‌آوریم، اگر این اختلاف در حد قابل‌قبول بود میانگین درصدها را گزارش می‌کنیم و اگر غیر قابل‌قبول بود دو لام دیگر تهیه کرده و مجدداً شمارش را انجام می‌دهیم و به روش ذکرشده ارزیابی می‌کنیم. جدول (۱-۲) میزان خطای قابل‌قبول برای دوبار شمارش را نشان می‌دهد.

 

جدول (۱-۲) تفاوت قابل قبول بین درصدها در دو بار شمارش ۲۰۰تایی (مجموعاً ۴۰۰ اسپرم شمارش شده‌اند)

 

 

 

وقتی درصد اسپرم‌های PR، NP و IM را تعیین نمودیم عدد حاصل را به نزدیکترین عدد زوج گرد می‌نماییم، مثلا ً ۵/۳۲% را به ۳۲% و عدد ۵/۳% را به ۴% گرد می‌کنیم. سپس بیشترین میانگین را با جدول (۱-۲) مقایسه می‌نماییم. به دو مثال زیر توجه نمایید:

مثال ۱- در نتایج حاصل از دو بار شمارش اسپرم اعداد زیر بدست آمده است:

تفاوت شمارش‌ها	میانگین	شمارش دوم	شمارش اول
۱۰%	۴۰%	۵۰%	۳۰%	PR
۱۰%	۱۰%	۱۵%	۵%	NP
۳۰%	۵۰%	۶۵%	۳۵%	IM

 

همانطور که مشاهده می‌شود بیشترین درصد مربوط به اسپرم‌های IM است. با توجه به جدول ۱-۲ برای میانگین ۵۰% اختلاف شمارش تا ۱۰% قابل‌قبول است و در این اندازه‌گیری چون تفاوت بین دو بار شمارش ۳۰% بوده لذا این اندازه‌گیری قابل‌قبول نبوده و مجدداَ باید انجام شود.

 

مثال ۲– در نتایج حاصل از دو بار شمارش اسپرم اعداد زیر بدست آمده است:

تفاوت شمارش‌ها	میانگین	شمارش دوم	شمارش اول
۶%	۶۳%	۶۶%	۶۰%	PR
۳%	۵/۴%	۶%	۳%	NP
۹%	۵/۳۲%	۲۸%	۳۷%	IM

 

همانطور که قبلا ذکر شد اعداد ۵/۴% و ۵/۳۲% را به‌ترتیب به ۴% و ۳۲% گرد می‌کنیم. در این اندازه‌گیری، بیشترین درصد مربوط به اسپرم‌های PR  است. طبق جدول (۱-۲) برای میانگین ۶۳% اختلاف شمارش تا ۱۰% موردقبول است، لذا این اندازه‌گیری از صحت کافی برخوردار بوده و میانگین نتایج برایNP  و PR و IM (پس از گرد شدن اعداد ) ‌بعنوان جواب بیمار گزارش می‌گردد.

توجه:

• در تعیین اسپرم‌های متحرک فقط اسپرم‌های سالم را در نظر بگیرید (یعنی فقط اسپرم‌هایی که سر و دم دارند شمارش می‌شوند و اگر اسپرم متحرک بدون سرم مشاهده شد جزء شمارش محسوب نمی‌گردد).
• وجود اختلاف بین شمارش‌ها نشان‌دهنده آن است که عمل مخلوط کردن یا برداشتن نمونه به‌درستی انجام نشده و یا اسپرم‌ها بطور یکنواخت در سطح لام پخش نشده‌اند. در این حالت شمارش ر ا مجدداً با دو لام دیگر تکرار می‌کنیم. گاهی اوقات حتی در سومین شمارش نیز اختلاف حاصل قابل‌قبول نیست. در این حالت میانگین را حساب کرده و آن را در جواب بیمار خاطرنشان می‌کنیم.
• چون از لحاظ ذهنی تمایل به شمارش اسپرم‌های متحرک بیشتر است، لذا بهتر است در لام دوم ترتیب شمارش را تغییر دهیم تا Bias ایجاد نشود یعنی ابتداIM و NP و سپس PR  را بشماریم.
• در صورتی‌که یک منطقه را برای شمارش و تعیین درصد اسپرم‌های متحرک انتخاب می‌کنیم و آنها را بطور مجزا می‌شماریم (یعنی ابتدا PR و سپس NP و IM). باید توجه کرد که ممکن است در شمارش به عدد ۲۰۰ برسیم اما هنوز یکی از این سه مورد را نشمرده باشیم یا کامل شمارش نکرده باشیم، در این صورت باید شمارش را ادامه داد (بیش از ۲۰۰) تا همه گروههای PR و NP و IM کاملاً شمارش شوند.

 

۴-۵-۲- مقادیر مرجع

کمترین حد مرجع برای حرکت کلی اسپرم (PR+NP) برابر ۴۰% و برای  PR  به‌تنهایی ۳۲% می‌باشد.

 

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید