HPLC

آشنایی با کروماتوگرافی با کارایی بالا  HPLC و کاربردهای آن

حسن منصوری طرقبه دانشجوی دکترای تخصصی آلرژی

آنچه خواهید خواند:

1- بیان سابقه این روش

2- ذکر اصول روش

3-  بیان قسمت‌های مختلف دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

4-  ذکر کاربرد های روش

5- ارایه خلاصه

اهداف آموزشی:

1- آگاهی از سابقه کروماتوگرافی

2-  آشنایی با اصول کار دستگاه HPLC

3-  به دست آوردن اطلاعاتی در مورد بخشهای مختلف دستگاه

4- آشنایی با انواع HPLC و کاربردهای آن

5-  درک مزیتها و کاربرد HPLC

تعریف HPLC: این واژه مخفف کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا است و سابقا به آن کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا گفته می‌شد.

برخی تعارف متداول در HPLC:

کروماتوگرافی: که به فرآیند انجام روش گویند.

کروماتوگراف: به دستگاه HPLC اطلاق می‌گردد.

کروماتوگرام: به تصویر و منحنی‌های حاصل از انجام تست گفته می‌شود.

کروماتوگرافر: به شخصی که با دستگاه کار می‌کند گفته می‌شود.

سابقه HPLC:

کروماتوگرافی در ابتدا توسط میخائیل تسوت ابداع شد و مشتق از دو واژه کروما به معنی رنگ و گرافین به معنی نگارش است. وی برای اولین بار انواع سبزینه‌ها (کلروفیل‌ها) را با استفاده از یک ستون ساخته شده از کربنات کلسیم با استفاده از حلال اتر جداسازی نمود.

تصویر 1: نمای شماتیک از آزمایش میخائیل تسوت

دانشمندان زیاد دیگری بر روی کروماتوگرافی کار نمودند و آن را توسعه و بسط دادند که از جمله آنها مارتین واسیگ است که بواسطه کارهایش در سال 1952 برنده جایزه نوبل گردید.

در واقع HPLC در طی سالهای متمادی توسعه و گسترش یافت و امروزه HPLC شکل پیشرفته و بهبود یافته کروماتوگرافی به حساب می‌آید.

تعریف کروماتوگرافی:

تسوت عنوان داشت که کروماتوگرافی روشی است که در آن اجزای یک مخلوط بر روی ستون جاذب متعاقب حرکت یک سیستم متحرک جدا می‌گردند. مجمع بین‌المللی شیمی محض و کاربردی در سال 1993 کروماتوگرافی را به صورت یک روش فیزیکی جداسازی تعریف کرد که اجزاء مخلوط بین دو فاز ثابت و متحرک که در یک جهت خاص حرکت می‌کند جدا می‌گردند.

فاز ثابت می‌تواند جامد یا مایع باشد که در صورت مایع بودن توسط یک ژل یا بخش جامد حمایت می‌گردد و فاز متحرک می‌تواند گاز یا مایع باشد.

حلالهای پر کاربرد در فاز نرمال عبارتند از: هگزان، ایزواکتان، دی اتیل اتر

حلالهای پر کاربرد در فاز معکوس عبارتند از: آب، متانول، استونیتریل، تتراهیدروفوران

اصول کروماتوگرافی:

کروماتوگرافی یک فرآیند پویا است که از سه جزء تشکیل شده است: 1- فاز ثابت   2- فاز متحرک  3- مخلوطی که بایستی تفکیک و جداسازی گردد.

ما می‌توانیم در طی فرآیند کروماتوگرافی فازهای ثابت و متغیر را در کنترل داشته باشیم و آن را تغییر دهیم و مخلوط مورد بررسی ما جزء مجهولی است که بایستی بررسی گردد.

اصل کلی کروماتوگرافی چه در نوع فاز نرمال و چه در فاز معکوس بر اساس پدیده جذب است. در حالتی که مخلوطی از مواد به ستون کروماتوگرافی عرضه می‌گردند هر جزء با توجه به تمایل نسبی آن به فاز ثابت حرکت می‌کند. جزیی که تمایل بیشتری به فاز ثابت دارد آرامتر حرکت می‌کند در حالی که جزیی که تمایل کمتری به فاز ثابت دارد سریع‌تر حرکت می‌کند. از آنجایی که هیچ دو جزیی تمایل مشابهی به فاز ثابت ندارند انتظار می‌رود که مواد مختلف از یکدیگر جداسازی شوند.

انواع HPLC:

معمولا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بر اساس حالت کروماتوگرافی به دو نوع فاز نرمال و معکوس تقسیم می‌گردند. همچنین می‌توان بر اساس معیارهای زیر نیز این روش را دسته‌بندی نمود:

تقسیم‌بندی بر اساس نحوه جداسازی

تقسیم‌بندی بر اساس تکنیک حلال

تقسیم‌بندی بر اساس درجه بهره‌برداری

تقسیم‌بندی بر اساس نوع جداسازی

دستگاه HPLC شامل قسمتهای زیر است:

• سیستم تحویل حلال
• پمپ
• دستگاه جدا کننده گازها
• سیستم تزریق نمونه
• ستون
• آشکارساز
• ثبات

تصویر 2:  نمایی از یک دستگاه کروماتوگرافی

سیستم حلال:

حلال بایستی از خلال ستون با فشاری برابر با 3000-1000 پوند بر اینچ مربع بگذرد. این بدان علت است که ذرات فاز ثابت در حد 10-5 میکرون هستند و مقاومت در برابر حلال زیاد است و به چنین فشاری نیاز می‌باشد.

انواع حلال عبارتند از:

• سیستم ایزوکراتیک (همگون) که در آن حلال ترکیب ثابتی دارد.
• سیستم گرادیانت (رتبه‌ای) که در آن ترکیب حلال متغیر است و خود بر دو نوع پرفشار و کم فشار می‌باشد.

مشخصات پمپ:

پمپ بایستی بتواند حداکثر تا 6 کیلو پوند بر اینچ مربع فشار ایجاد کند و در فشار ایجاد شده حالت نبض و قطع و وصل وجود نداشته باشد و جریان ثابت در حد 0/1 تا 10 سی سی در دقیقه را ایجاد نمایند و نهایتا این که تجدیدپذیری در حد 0/5 درصد داشته باشد.

در برابر خرده‌شدگی و زنگ زدگی مقاوم باشد همچنین جریان حلال در طی کار نبایستی دچار افت گردد.

انواع پمپ:

1- پمپ‌های سرنگی  (تصویر 3 سمت راست)

2- پمپ‌های فلاشی (تصویر 3 سمت چپ)

3- پمپ‌های دیاگرامی (پره‌ای) (تصویر4)

تصویر 3:  پمپ سرنگی در سمت راست و فلاشی در سمت چپ

تصویر 4: پمپ پره‌ای

سیستم جداکننده گاز:

برخی گازها در حلالهای آلی حل می‌شوند و زمانی که حلال تحت فشار بالای پمپ قرار می‌گیرد حبابهای گاز تشکیل می‌شوند که در فرآیند جداسازی اختلال ایجاد می‌کنند و باعث تغییر دادن شکل قله‌ها (پیک‌ها) و خط پایه در کروماتوگرام می‌شوند. برای رفع این مشکل از انواع سیستم‌های جدا کننده گاز مشتمل بر فیلتراسیون با استفاده از خلاء (تصویر٥)،  شستشو با هلیوم و اولتراسونیک استفاده می‌شود.

               تصویر 5:  نمایی از بخش جداکننده حباب در دستگاه کروماتوگرافی

سیستم تزریق نمونه:

ابزارهای مختلف و گوناگونی جهت تزریق دستی یا خودکار نمونه وجود دارد. معمولا حجم نمونه تزریقی بین 0/5 تا 500 لاندا است و تداخلی در سیستم فشار دستگاه ایجاد نمی‌کند. لوپ تزریق دستگاه معمولا بین 1 تا 100 لاندا حجم دارد. در نوع تزریق کننده‌های خودکار حجم 1 لاندا تا 1 سی‌سی بطور مستمر  به ستون تزریق می‌گردد.

ستونها:

از جنس استیل ضد زنگ هستند و جداره محکمی دارند (تصویر ٦). ستونهای آنالتیکال معمولا به شکل استوانه‌های باریک و بلندی با طول 25-5 سانتیمتر، قطر ستون 5-3 میلیمتر و قطر بدنه ستون 35 میکرومتر هستند.

ستونهای کوچک طول 7/5-3 سانتیمتر، قطر ستون 5-1 میلیمتر و قطر بدنه 35 میکرومتر دارند و قادرند فشار زیاد حلال را با حداقل مصرف حلال داشته باشند.

ستون محافظ مواد ذره‌ای  و آلودگیها را از مسیر بر می‌دارد و باعث می‌گردد آسیبی به ستون اصلی وارد نگردد و جنس آن بایستی از همان جنس ستون تجزیه‌ای باشد.

ستونها از موادی چون سلیکا، آلومینا، مواد ساخته شده از پلی استیرن، دی وینیل بنزن و یا رزین تعویض یونی تشکیل شده‌اند. این ذرات متخلخل  بوده و قطر ذرات 10-3 میکرومتر می‌باشد. این ذرات متخلخل با اندازه کوچک معمولا با مواد ارگانیک پوشانیده شده‌اند.

تصویر  ٦: انواع مختلف ستون در کروماتوگرافی

آشکارساز:

نوع آشکارسازهایی که بکار گرفته می‌شوند بستگی به خواص مواد و ترکیباتی دارد که بایستی جدا گردند. آشکارسازهای متفاوتی که موجودند عبارتند از:

• آشکارساز ضریب شکست
• آشکارساز ماوراء بنفش
• آشکارساز فلوروسنت
• آشکارساز الکتروکمیکال
• آشکارساز تبخیر کننده تفرق نور
• آشکارساز مادون قرمز
• آشکارساز فتودیود

آشکارساز ماوراء بنفش:

این نوع آشکارساز بر اساس عبور الکترون از روی مولکولها عمل می‌کند و شایعترین نوع آشکارسازها در کروماتوگرافی مایع است که به کار می‌رود. از طول موج 254 نانومتر حاصل از لامپ جیوه استفاده می‌کند. ویژگی آن این است که طول موج پایداری ایجاد می‌کند که برای طول موجهای خاصی قابل انتخاب است و دیگر این که تکرنگ است و قابل فیلتر کردن می‌باشد. عیب آن این است که به طول موج خاصی محدود است.

ثبات و الحاق کننده:

ثبات‌ها جهت ثبت و ضبط پاسخ‌های حاصله از آشکارسازها پس از تقویت به کار گرفته می‌شوند. آشکارسازها حد پایه و قله‌های بدست آمده را در برابر زمان رسم می‌کنند. الحاق کننده‌ها نوع پیشرفته ثبات‌ها هستند که توانایی و ظرفیت پردازش اطلاعات را دارند. الحاق کننده‌ها قادرند که هر قله را با توجه به زمان توقف، ارتفاع و پهنای قله، سطح زیر قله، درصد ناحیه زیر قله و غیره ثبت کند. الحاق کننده‌ها در مقایسه یا ثبات‌ها اطلاعات بیشتری در اختیار ما قرار می‌دهند (تصویر ٧). امروزه کامپیوترها و چابگرها به منظور ثبت و پردازش اطلاعات به دست آمده و همچنین کنترل همزمان چند عمل در این دستگاه بکار گرفته می‌شوند.

تصویر ٧: یک گراف شماتیک در کروماتوگرافی

مزایای HPLC:

• جداسازی را به صورت سریع و موثر انجام می‌دهد.
• می‌توان به صورت مستمر میزان حلال خارج شونده از ستون را کنترل کرد.
• این روش را می‌توان جهت جداسازی و بررسی مخلوط‌های پیچیده بکار برد.
• اندازه‌گیری کمی آن دقیق است.
• با استفاده از همان ستون نتایج تکرارپذیر و تجدیدپذیر به دست می‌آید.
• با این روش می‌توان نمونه‌های آبی و غیرآبی را مورد بررسی قرار داد بدون این که به آماده‌سازی اولیه نمونه نیاز داشته باشد و یا به آماده‌سازی کمی نیاز دارد.

کاربردها:

• HPLC تجزیه‌ای: فرآیندی است که در آن اطلاعاتی در مورد ترکیبات نمونه مجهول همچون شناسایی ترکیبات موجود در نمونه، تعیین کمی هر یک از مواد و جداسازی آنها بدست می‌آید.
• تلخیص: فرآیندی است که در طی آن متخصص بیوشیمی قصد دارد ماده‌ای را  از یک ترکیب جداسازی کند و یا تغلیظ نماید.
• شناسایی: فرآیندی است که به منظور تعیین هویت هر ترکیب موجود در آزمایش بکار می رود.
• تعیین کمی: فرآیندی است که طی آن یک ماده با غلظت ناشناخته در یک محلول خاص مشخص می‌گردد.

مقایسه HPLC  با کروماتوگرافی گاز:

• HPLC قادر به جداسازی مواد ناپایدار است در حالی که در کروماتوگرافی گاز برای تجزیه مواد ناپایدار بایستی این مواد را ابتدا با استفاده از یک سری مواد پایدار ساخت.
• درجه حرارت بکار گرفته شده در کروماتوگرافی گاز خیلی بیشتر از HPLC است.
• فرآیند کاری در HPLC در مقایسه با فرایند کروماتوگرافی گاز بسیار سهل‌تر و ساده‌تر است.
• حساسیت و دقت HPLC زیاد و کروماتوگرافی گاز متوسط است.
• HPLC توانایی تجزیه مواد قطبی را دارد در حالی که کروماتوگرافی گاز از این توانایی برخوردار نیست.
• وجود آب خللی در کار HPLC ایجاد نمی‌کند در حالی که در کروماتوگرافی گاز سبب اختلال در آشکارساز می‌گردد.
• HPLC تجدید پذیری بالایی دارد در حالی که تجدید پذیری کروماتوگرافی گاز کم است.
• زمان آزمایش در HPLC بسیار کمتر از کروماتوگرافی گاز است.

نتیجه‌گیری:

HPLC تکامل یافته‌ترین شکل تکنیک کروماتوگرافی است.

HPLC تکنیکی جهت تجزیه یک نمونه مخلوط به اجزا آن به منظور شناسایی، تعیین کمی نمونه و تلخیص آن است.

امروزه این تکنیک در حد وسیعی در آزمایشگاههای علوم پزشکی و داروسازی بکار گرفته می‌شود.

منابع:

1. P. Wang, H.K. Lee. Recent applications of high-performance liquid chromatography to the analysis of metal complexes. Journal of Chromatography A, 789 (1997) 437–451.

2. Malviya R, Bansal V, Pal O.P. and Sharma P.K. High performance liquid chromatography: A short review. Journal of Global Pharma Technology. 2010; 2(5): 22-26.

اصول فنی تجهیزات آزمایشگاهی (3)(در تب جدید مرورگر باز می شود )

https://microbenotes.com/types-of-chromatography/

https://byjus.com/chemistry/differential-extraction-chromatography/

كروماتوگرافي مايع با كارآيي بالاي دناتوره(در تب جدید مرورگر باز می شود )

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید