مروری کوتاه بر پلاسمیدهای باکتریایی

مروری کوتاه بر پلاسمیدهای باکتریایی

• تاج‌الدین اکبرزاده خیاوی- کارشناس ارشد میکروب‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشکین‌شهر
• حسین حضرتی نوین- کارشناس ارشد بیوشیمی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، مرکز تحقیقات بیماری‌های کبد و گوارش
• رحمن رادمهر- کارشناس ارشد میکروب‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی تبریز، آزمایشگاه مرکزی اداره امور آزمایشگاه‌های استان
• کاظم بدرزاده رواسجانی- کارشناس ارشد سم‌شناسی بالینی دانشگاه علوم پزشکی تبریز، شبکه بهداشت و درمان شهرستان اهر
• شهرام غایب زاده میرک- کارشناس علوم آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشکین‌شهر
• حافظ عزیزپور آقبلاغ- کارشناس علوم آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، مرکز آموزشی و درمانی علوی اردبیل

مقدمه

پلاسمیدها مولکول‌های DNA دو رشته‌ای مستقل خارج کروموزومی هستند که در بیشتر باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و نیز در یوکاریوت‌های پست مثل مخمر یافت می‌شوند. یک پلاسمید می‌تواند در یک روش کنترل‌شده به طریقه فیزیکی مستقل از کروموزم میزبان همانندسازی کند.

1- ساختار پلاسمیدها

بیشتر پلاسمیدها ساختار دو رشته‌ای حلقوی با اتصال کووالانت یا به‌عبارت‌دیگر (Covalently Closed Supercoiled= CCC ) دارند اما پلاسمیدهای خطی در چندین جنس باکتریایی نظیر استرپتومایسس، بورلیا، نوکاردیا، رودوکوکوس، آگروباکتریوم، تیوباسیلوس و حتی در اشریشیا و بعضی از مخمرها یافت شده‌اند.

پلاسمیدهای حلقوی عموماً  در هر دو رشته با اتصال کووالانت متصل بوده و اغلب دارای سوپرکویل منفی هستند. این ساختار حلقوی پلاسمیدها را از اثرات تخریبی آنزیم‌های اگزونوکلئاز محافظت می‌کند (4-1).

شکل 1: ساختمان عمومی یک پلاسمید

2- اهمیت پلاسمیدها

معمولاً  وجود پلاسمیدها برای بقاء سلول ضروری نیست اما ممکن است دامنه وسیعی از خصوصیات ژنتیکی را کد کنند که میزبان خود را برای رقابت بهتر با سایر میکروارگانیسم‌های اشغال‌کننده همان مکان اکولوژیک مستعد سازد (5).

یکی از خصوصیاتی که پلاسمیدها را در میکروب‌شناسی با اهمیت خاص جلوه‌گر می‌سازد توانایی آن‌ها در حمل‌ونقل ژن‌های کد کننده مقاومت به ترکیبات ضد میکروبی است. این نوع از پلاسمیدها در باکتری‌ها گسترش وسیعی دارند و ممکن است بین ارگانیسم‌های متفاوت منتقل شوند. این پلاسمیدها پلاسمیدهای مقاومت (Resistance plasmids) نامیده می‌شوند که جایگاه دامنه وسیعی از ژن‌های کد کننده مقاومت به طیف وسیعی از ترکیبات ضد میکروبی مثل آنتی‌بیوتیک‌ها، املاح سنگین، عوامل جهش‌زا مثل اتیدیم برماید و حتی برخی عوامل ضدعفونی‌کننده نظر فرمالدئید می‌باشند

3- اندازه پلاسمیدها

اندازه پلاسمیدها از 1 Kbp تا چند صد Kbp متغیر می‌باشد. کوچک‌ترین آن‌ها فقط DNA لازم برای جا دادن 2 یا 3 ژن کوچک را دارا می‌باشد مثل p 15A. پلاسمیدهای قادر به عمل کونژوگاسیون حداقل 30 Kbp اندازه دارند. (3).

4- همانندسازی پلاسمیدها

برخی از پلاسمیدها برای شروع همانندسازی نیاز به پروتئین Rep دارند که توسط خود پلاسمید سنتز می‌شود. این پروتئین به‌تنهایی یا در ترکیب با DNA (پروتئین شروع‌کننده همانندسازی DNA کروموزومی) عمل می‌کند. برخی از پلاسمیدها به محصولات اضافی کد شده توسط میزبان نظیر dam متیلاز، فاکتورهای میزبانی الحاق شونده و پروتئین‌های شوک حرارتی برای همانندسازی نیاز دارند. سایر پلاسمیدها نظیر col EI یک مولکول مختص پلاسمید کد می‌کنند و به DNA پلیمراز I، RNA پلیمراز و ریبونوکلئاز H کد شده توسط سلول میزبان نیاز دارند.

مدل‌های همانندسازی پلاسمیدهای حلقوی

1- همانندسازی به روش تتا ( Theta replication)

در این نوع همانندسازی از یک مبدأ ثابت در یک جهت یا در هر دو جهت پلاسمید پیش می‌رود و هر دو رشته به‌طور هم‌زمان همانندسازی می‌کنند. هر دو رشته پلاسمید والد در طول پروسه همانندسازی در تماس باهم باقی می‌مانند.

شکل 2: همانندسازی به روش تتا در پلاسمید

2- همانندسازی به روش دایره چرخان (Rolling circle replocation)

در این مدل، یک پروتئین شروع‌کننده بنام Rep را کد می‌کند که فعالیتی شبیه توپوایزومراز و یک اندونوکلئاز اختصاصی از نظر ترادف دارد. این پروتئین در یکی از دو رشته پلاسمید در منطقه شروع همانندسازی با ایجاد یک شکاف یک انتهای ^,3- OH ایجاد می‌کند که به‌منزله رشته آغازین عمل می‌کند. همانندسازی با طویل شدن از جایگاه ^,3- OH با استفاده از رشته مکمل به‌عنوان الگو پیش می‌رود. همانندسازی بیشتر از سمت راست حلقه شروع به گردش می‌کند و در نتیجه یک مولکول DNA دو رشته‌ای و یک مولکول DNA تک‌رشته‌ای ایجاد می‌شود.

مولکول تک‌رشته‌ای حلقوی یک لوپ سنجاق سری ایجاد می‌کند که این قسمت توسط DNA پلیمراز شناسایی می‌شود و در یک روش خیلی اختصاصی گونه یک پرایمر ایجاد می‌کند که ابتدا به‌وسیله DNA پلیمراز I و سپس توسط DNA پلیمراز III طویل می‌شود (3-1).

شکل 3: همانندسازی به روش دایره چرخان در پلاسمید

 

5- تعداد نسخه‌های پلاسمید در یک سلول

تعداد نسخه‌های پلاسمید در یک سلول بسته به مکانیسم همانندسازی آن متغیر است. همانندسازی برخی از پلاسمیدها کمتر تحت کنترل است و تعداد نسخه‌های پلاسمید در داخل سلول در یک زمان خیلی زیاد و تا حتی بیشتر از 100 نسخه می‌باشد (high copy number). برخی از پلاسمیدها تحت کنترل شدید همانندسازی بوده و فقط 1 تا 3 نسخه از پلاسمید در یک زمان در سلول وجود دارد (low copy number) (2، 1).

6- انتقال پلاسمیدها

پلاسمیدها با روش‌های ترانسفورماسیون، ترانسدوکسیون و کونژوگاسیون می‌توانند انتقال یابند که به میزبان و شرایط محیطی بستگی دارد. در ترانسفورماسیون باکتری گیرنده DNA پلاسمیدی برهنه را از محیط جذب می‌کند. در ترانسدوکسیون باکتریوفاژهای آلوده‌کننده یک سویه باکتریایی ممکن است در داخل کپسید فاژ DNA پلاسمیدی را بسته‌بندی کنند و آن را به باکتری دیگری منتقل کنند. در کونژوگاسیون تماس مستقیم بین باکتری گیرنده و باکتری دهنده باعث انتقال پلاسمید می‌شود. در این روش معمولاً پلاسمید باکتری دهنده یک فاکتور سطحی را برای ایجاد همجوشی بین دو باکتری ایجاد می‌کند (7،6).

7- الگوی پلاسمیدی

الگوی پلاسمیدی بر اساس تعداد و اندازه پلاسمیدهای موجود در یک سویه به‌عنوان مبنایی برای شناسایی سویه است که در شناسایی سویه‌های تعداد زیادی از باکتری‌ها مورداستفاده واقع می‌شود. تجزیه کامل‌تر DNA پلاسمیدی بخصوص مولکول‌های بزرگ پلاسمید به دنبال هضم با آنزیم‌های محدودالاثر امکان‌پذیر است (9،8).

8- هضم با آنزیم‌های محدودالاثر

3 تیپ از آنزیم‌های محدودالاثر توسط میکروارگانیسم‌های مختلف تولید می‌شوند که تیپ II این نوع آنزیم‌ها توالی اختصاصی در DNA را شناسایی کرده و آن را در محل شناسایی یا نزدیک محل شناسایی می‌برند. توالی‌هایی که توسط این آنزیم‌ها شناسایی می‌شوند معمولاً حدود 4 تا 6 جفت باز دارند. یکی از خصوصیات این توالی‌های 4 تا 6 جفت بازی این است که اکثراً به‌صورت قرینه می‌باشند و اصطلاحاً پالیندروم خوانده می‌شوند. به خاطر اختصاصی بودن محل شناسایی یک آنزیم محدودالاثر همیشه یک قطعه اختصاصی را به تعداد قطعات معین و با طول مشخص می‌برد (11،10).

شکل 4: مکانیسم عمل یک آنزیم محدودالاثر

9- نگاهی اجمالی بر روش‌های استخراج و خالص‌سازی DNA پلاسمیدی از باکتری‌های مختلف

 

•  استخراج و خالص‌سازی DNA پلاسمیدی از Escherichia coli با استفاده از روش لیز قلیایی

• یک کلنی منفرد و خالص از باکتری را به محیط کشتLuria Bertaini حاوی آمپی‌سیلین تلقیح کرده و مدت 20 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌کنیم.
• 1/5 میلی‌لیتر از کشت باکتریایی را به میکروتیوب منتقل کرده و به مدت 4 دقیقه در دور 4000 سانتریفوژ می‌کنیم.
• بعد از خالی کردن مایع رویی میکروتیوب، به‌طور معکوس به مدت 4 دقیقه بر روی دستمال‌کاغذی برای خشک شدن رسوب باکتریایی قرار داده می‌شود.
• 0/2 میلی‌لیتر از بافر لیز کننده که به مدت 1 دقیقه در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شده بود در وضعیت فوق‌العاده سرد بر روی رسوب سلولی ریخته می‌شود و سپس سلول‌های باکتریایی با استفاده از سمپلر در محلول به شکل سوسپانسیون درمی‌آیند و سوسپانسیون سلول به مدت 5 دقیقه در حرارت آزمایشگاه انکوبه می‌شود.
• 0/4 میلی‌لیتر محلول دناتوره کننده تازه تهیه‌شده اضافه شده و سر لوله بسته می‌شود و 6 بار به‌آرامی سروته شده و به مدت 5 دقیقه در آب یخ انکوبه می‌گردد.
• 0/3 میلی‌لیتر از محلول استات پتاسیم که به مدت 20 دقیقه در فریزر در 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شده بود در وضعیت فوق‌العاده سرد اضافه گشته و 6 بار به‌آرامی سروته شده و به مدت 5 دقیقه در آب یخ انکوبه می‌شود.
• لوله به مدت 5 دقیقه در دور 12000 در 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ شده و پس از سانتریفوژ کردن 750 میکرولیتر از مایع رویی به میکروتیوب جدید اضافه می‌گردد.
• بر روی 750 میکرولیتر از مایع رویی 1/5 میکرولیتر از RNase A با غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر افزوده شده و به مدت 20 دقیقه در 37 درجه انکوبه می‌گردد.
• بعد از اتمام انکوباسیون، 750 میکرولیتر از محلول فنل متعادل شده/ کلروفرم/ ایزوآمیل الکل (1/24/25) اضافه شده و به مدت 1 دقیقه ورتکس شده سپس به مدت 4 دقیقه در دور 12000 در 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ می‌گردد.
• مایع رویی به میکروتیوب جدید منتقل شده و بر روی آن 750 میکرولیتر اتانل 96 درجه که به مدت 10 دقیقه در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شده بود در وضعیت فوق‌العاده سرد اضافه می‌شود و 6 بار به‌آرامی سروته شده و بعد به مدت 2 ساعت در 20- درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود.
• سپس لوله به مدت 15 دقیقه با دور 12000 در 4 درجه سانتریفوژ می‌شود. مایع رویی دور ریخته شده و رسوب سفیدرنگ در ته لوله باقی می‌ماند. میکروتیوب به‌طور معکوس بر روی دستمال کاغذی برای خشک شدن رسوب قرار داده می‌شود.
• 1 میلی‌لیتر اتانل 70% که به مدت 10 دقیقه در 4 درجه نگهداری شده بود در وضعیت فوق‌العاده سرد اضافه شده و سر لوله بسته شده و با چند بار سروته کردن مخلوط می‌گردد.
• سپس لوله به مدت 1 دقیقه با دور 12000 در 4 درجه سانتریفوژ می‌شود. مایع رویی دور ریخته شده و میکروتیوب به به‌طور معکوس بر روی دستمال کاغذی برای خشک شدن رسوب قرار داده می‌شود.
• به مدت 5 تا 10 دقیقه سر میکروتیوب به شکل باز در محیط آزمایشگاه قرار داده می‌شود تا اتانل تبخیر شود و سپس 50 میکرولیتر از بافر TE(Tris-Hcl و EDTA) بر روی رسوب اضافه شده و رسوب در آن حل گشته و در مواقع موردنیاز برای جمع شدن TE در ته لوله از سانتریفوژ استفاده می‌شود (12).

•  استخراج و خالص‌سازی DNA پلاسمیدی از  Pseudomonas aeruginosa با استفاده از روش لیز قلیایی تغییر یافته

روش کار عیناً مثل E.coli است با این تفاوت که بعد از اضافه کردن RNase A در مرحله 8 در بالا 80 میکرولیتر از محلول 1 درصد CTAB= cetyltrimethylammonium bromide حاوی 0/7 مولار نمک طعام را اضافه کرده و به مدت 10 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود و بعد از اتمام انکوباسیون و خنک کردن میکروتیوب‌ها در حرارت آزمایشگاه مرحله بعدی که اضافه نمودن محلول فنل کلروفرم می‌باشد انجام می‌شود (13).

•  استخراج و خالص‌سازی DNA پلاسمیدی از Staphylococcus aureus با استفاده از روش Parisi

• یک کلنی منفرد و خالص از باکتری را به محیط کشت LB Luria Bertaini حاوی آمپی‌سیلین تلقیح کرده و مدت 20 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌کنیم.
• 1/5 میلی‌لیتر از کشت باکتریایی را به میکروتیوب منتقل کرده و به مدت 4 دقیقه در دور 4000 سانتریفوژ می‌کنیم.
• بعد از خالی کردن مایع رویی میکروتیوب، به‌طور معکوس به مدت 4 دقیقه بر روی دستمال کاغذی برای خشک شدن رسوب باکتریایی قرار داده می‌شود.
• 200 میکرو لیتر محلول بافر بریج 58 (EDTA و Nacl) بر روی رسوب سلولی ریخته می‌شود.
• 10 میکرولیتر محلول لیزواستافین به سوسپانسیون اضافه شده و بعد 300 میکرولیتر بافر لیز کننده که علاوه بر محلول بریج 58 دارای سدیم‌دزوکسی‌کولات نیز می‌باشد اضافه شده و ابتدا به مدت 30 دقیقه در 37 درجه و سپس 30 دقیقه در 60 درجه انکوبه می‌شود (17-14).

باقی مراحل مثل روش استخراج پلاسمید از باسیل‌های گرم منفی می‌باشد.

 

References:

1. Bennet PM, Hove TGB: Bacterial and bacteriophage genetics in systematic bacteriology, ninth edition, Amold, bath press,Avon. 251-266, 1998.
2. Actis LAand etal: Bacterial plasmids, replication of extrachromosomal genetic elements encoding resistance to antimicrobial components. Frotiers in Bioscience, 3: 43-62, 1999.
3. Thomas CM: Plasmids in encyclopedia of microbiology.Ed: Lederberg J, Volume 3, second ed. Aademic press, San Diego, 711-729, 2000.
4. Nicklin J and etal: Instant notes in microbiology, Bios Scientific Publishers, Guildfoed, UK, 122-128, 1999.

5.Elwell LP,  Shipley PL: Plasmid mediated factors associated with virulence of bacteria to animals. Ann Rev Microbiol, 34: 465-469, 1980.

6. Jawetz E and etal: Medical Microbiology, Lange, 22 th edition. Mc Grow Hill, New York, 229-231 &144-175, 2002.
7. Broda P: Plasmids, W.H. Freeman and company limited, San Francisco, 5-22, 125-136, 1979.
8. Poh CL: Yeo CC: Recent advances in typing of Pseudomonasaeruginosa . J Hosp Infect. 24:175-181, 1993.
9. Woo-Hoo K and etal: Application of ribotyping for molecular epidemiologic study of Escherichia coli isolated from patients with urinary tract infections. Korean j Infect Disease, 27:505-530, 1997.

10.Lewin B: Genes. Vl. Oxford, New York, 429-470, 505-530, 1997

11. Griffiths JF and etal: Modern Genetic Anaysis. Fredom, New York, 327-329, 1999.
12. Birmboim HC: A rapid alkaline extraction method for the isolation of plsmid DNA. Methods Enzymol, 100:243-255, 1983.
13. Sentchilo VS, Perebitok AN, Zehinder AJB, Vadermee JR: Molecular diversity of plasmid bearing genes that encode toluene andxylene metabolism in Pseudomonasaeruginosa strains isolated from different contaminated sites in Belarus. Applied and Environmental Microbiology, 66:2842-2852, 2000.

14- Takahashi S, Nagano Y. Rapid procedure for isolation of plasmid DNA and application to epidemiological analysis. J Clin Microbiol. 1984 Oct; 20 (4): 608-13

15- Kotchoni S, Gachomo E, Betiko E. Olusoji O. A home made kit for plasmid DNA minipreparation. (2003). AJB, 2(4), 88-90

16- Lyon BR, May JW, Kluytmans JA, Skurray RA, et al. Analysis of plasmids in nosocomial strains of multiple-antibiotic-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 1983 Jun; 23 (6): 817-26.

17. Nahaie MR, Goodfloow M, Harwood CR: A rapid screening procedure for Staphylococcal plasmids. J Microbial Meth, 2:73-81, 1984.

تعیین الگوی پلاسمیدی باکتری‌های گرم منفی عامل عفونت‌های بیمارستانی

استخراج و خالص‌سازی DNA پلاسمیدی از سودوموناس آئروجینوزا

برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید