رویکردهای مولکولی در پایش[1] پیوند
دکتر صدیقه حسنی
پیوند عضودرمانی، راهکاری عالی است که “شانس دوباره”ای برای زندگی در اختیار بیماران مبتلا به نارسایی پیشرفته‌ی ارگان‌ها قرار می‌دهد؛ اما متأسفانه در این روش، عضو پیوندشده[2] در معرض سیستم ایمنی فرد گیرنده قرار می‌گیرد و مستعد پس زدن حاد خواهد بود؛ عارضه‌ای ترسناک و یک عامل خطر عمده برای از بین رفتن بافت پیوندی. به همین جهت و با هدف حفظ سلامت پیوند، درمانگران، بیماران را با دقت تحت نظر قرار می‌دهند تا کفایت سرکوب ایمنی در حدی حفظ شود که تعادل بین خطر پس زدن پیوند و بروز عفونت برقرار باشد. رویکردهای نظارتی در میان درمانگران و برنامه‌های مختلف پیوند عضو تنوع قابل ملاحظه‌ای دارند.
این رویکردها عموماً شامل بیوپسی از بافت پیوندی برای هیستوپاتولوژی و بررسی با میکروسکوپ نوری جهت ارزیابی پس زدن پیوند، اندازه‌گیری عملکرد بافت پیوندی (سنجش کراتینین برای کلیه، تست عملکرد ریوی برای ریه، تست عملکرد کبدی برای کبد و اکوکاردیوگرافی برای قلب)، سنجش فعالیت ایمنی با آزمایش آنتی‌بادی مختص اهداکننده[3] (DSA) و ارزیابی کفایت سرکوب ایمنی با اندازه‌گیری غلظتِ خونی داروهای سرکوبگر ایمنی هستند.
برای ارزیابی عملکرد بافت پیوندی و یا غلظت داروهای سرکوبگر ایمنی از رویکردهای غیرتهاجمی استفاده می‌شود؛ به همین دلیل، عموماً از این تست‌ها برای نظارت[4] بهره برده می‌شود؛ به این معنا که بیماران در دوران پس از پیوندِ عضو در فواصل زمانی از پیش تعیین‌شده‌ای بدون ارتباط با اینکه علائمی مبنی بر اختلال عملکرد بافت پیوندی داشته باشند و یا شک بالینی دال بر آن موجود باشد، تحت آزمایش قرار می‌گیرند. هنگامی که در بیمار نشانه‌هایی مبنی بر اختلال عملکرد بافت پیوندی مشاهده شود، آزمایش‌های اضافه‌تری بر اساس اندیکاسیون بالینی انجام می‌گیرد.
از سویی دیگر، بیوپسی یک پروسیجر تهاجمی است که می‌تواند با عوارضی همراهی داشته باشد؛ به علاوه، نمونه‌های بیوپسی زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شده و تحت بررسی هیستوپاتولوژی روتین قرار می‌گیرند که دقت و حساسیت محدودی در کشف و توصیف[5] عوارض مرتبط یا غیر مرتبط با پس زدن پیوند دارند. در نتیجه، روش کار در مراکز مختلف متفاوت است؛ برخی هم بیماران را تحت نظر قرار داده و هم بیوپسی‌های دارای اندیکاسیون بالینی انجام می‌دهند. سایر مراکز تنها بیوپسی‌های با اندیکاسیون بالینی را به کار می‌برند. به عنوان مثال، در مورد پیوند ریه، در ایالات متحده 70% از مراکز هم بیماران را تحت نظر می‌گیرند و هم بیوپسی‌های دارای اندیکاسیون بالینی انجام می‌دهند، در حالی که 30% دیگر تنها به انجام بیوپسی با اندیکاسیون بالینی بسنده می‌کنند.
فایده‌ی واقعی این رویکردهای مراقبتی متفاوت همچنان نامشخص است. خوشبختانه در چند دهه اخیر رویکردهای مولکولی نوینی ارائه شده‌اند؛ بسیاری از آنها نتایجی امیدبخش داشته و مزایایی دارند که متوجه محدودیت‌های بیوپسی و هیستوپاتولوژی مرسوم است. تمرکز ما در این پرسش و پاسخ بر نمونه‌های اولیه‌ی دو ابزار خواهد بود که اخیراً از مراکز تجهیزات پزشکی و خدمات درمانی ایالات متحده[6] جهت استفاده برای بیماران تأییدیه گرفته‌اند:
DNA فاقد سلول مشتق از بافت اهداشده بر پایه‌ی پلاسما[7] (dd-cfDNA) و “بیوپسی مولکولی”. بیوپسی مولکولی به این معناست که با استفاده از میکروآرایه[8] و سایر پلتفرم‌ها، بیان ژنی نمونه بیوپسی بافتی را نشان دهیم. پنج فرد متخصص، کاربرد احتمالی این ابزارهای نوین را در نظارت بر دریافت‌کنندگان پیوند ارگان‌های توپر مورد بحث قرار می‌دهند.
به نظر شما بهتر است dd-cfDNA برای نظارت بر بیماران مورد استفاده قرار گیرد و یا جهت آزمایش‌های دارای اندیکاسیون بالینی؟
مایکل اولریش[9]: dd-cfDNA بیومارکری است که با حداقل تهاجم و به صورت کمّی آسیب بافت پیوندی را تشخیص می‌دهد. از آنجا که پیوند ارگان‌ها پیوند ژنوم هم محسوب می‌شود، dd-cfDNA پایش سلامت بافت پیوندی را ممکن می‌سازد. در صورت مرگ سلول‌های بافت پیوندی، نوکلئوزوم‌ها به عنوان dd-cfDNA به درون جریان خون آزاد می‌شوند. اعتبار بالینی dd-cfDNA در تشخیص و یا رد پس زدن و سایر آسیب‌های مربوط به بافت پیوندی در بیش از 50 مطالعه به اثبات رسیده است. بالا رفتن سطوح dd-cfDNA در دریافت‌کنندگان پیوند از چند روز تا سه ماه پیش از تظاهر بالینیِ پس زدن حاد پیوند مشاهده شده است.
بحث‌هایی وجود دارد مبنی بر اینکه ممکن است سطوح افزایش‌یافته‌ی dd-cfDNA محرکی[10] برای التهاب باشد. تشخیص زودهنگام و مخصوصاً تحت بالینیِ پس زدن پیوندی که با واسطه آنتی‌بادی باشد، امکان مداخلات درمانی متناسب با وضعیت را فراهم ساخته و احتمال دارد پیامد را بهبود بخشد. این موضوع باید در مطالعات کنترل‌شده و با تست‌های dd-cfDNA مختلف مورد بررسی بیشتر قرار گیرد. در پیوند کلیه، می‌توان از dd-cfDNA برای تشخیص زودهنگام پس زدن پیوند با واسطه آنتی‌بادی در بیماران دارای DSA بهره برد.
مطالعاتی که در حال حاضر منتشر شده‌اند حاکی از کفایت عملکرد تشخیصی dd-cfDNA است (ROC[11]AUC = 0.81) و حساسیت و ویژگی بالینی آنها به ترتیب حدود 80% و 76% هستند. بالا بودن ارزش اخباری منفی این بیومارکر (90%) حاکی از کارایی dd-cfDNA در رد پس زدن پیوند است؛ بنابراین dd-cfDNA می‌تواند در جلوگیری از انجام بیوپسی‌های غیرضروری پس از افزایش سطح کراتینین پلاسما مفید باشد. مشاهده شده است که سطح dd-cfDNA در گیرندگان پیوند کبد، قلب و یا کلیه متعاقب درمان موفقیت‌آمیز رد پیوند به سرعت کاهش پیدا می‌کند.
با این حال، استفاده از dd-cfDNA نیز با محدودیت‌هایی روبروست. افزایش سطح dd-cfDNA تنها ویژه موارد رد پیوند نیست؛ برخی از سایر علل آسیب بافت پیوندی که در گیرندگان پیوند کلیه با افزایش dd-cfDNA همراهی دارند عبارتند از: پیلونفریت، نکروز حاد توبولار و نفروپاتی ناشی از ویروس BK. به طور کلی، در بیماران دچار آتروفی توبولی و فیبروز بینابینی پیشرفته[12]، تنها افزایش نسبتاً اندکی در dd-cfDNA مشاهده شد و افتراق مقادیر آنها از مقادیر مربوط به بیماران دارای پاتولوژی طبیعی امکان‌پذیر نبود. ممکن است در مراحل پیشرفت بیماری در آتروفی توبولار و فیبروز بینابینی، سطوح dd-cfDNA افزایش یافته باشد. به نظر می‌رسد که تشخیص پس زدن پیوند با واسطه سلول T، تحت تأثیر پروسیجر به‌کاررفته برای آزمایش قرار می‌گیرد. ممکن است نتایج منفی کاذب به دلیل استفاده از آمپلیکون‌های نسبتاً طویل (130-100 bp) در سنجش بکاربرده شده باشد.
برای دستیابی به درمانی شخصی‌شده[13] برای بیمار دریافت‌کننده‌ی پیوند که بتواند احتمال از دست رفتن بافت پیوندی و نیز هزینـــــه‌ها را کاهش دهد، باید نتایج آزمایش dd-cfDNA در بستری از تمام یافته‌های تشخیصی و داده‌های بالینی مرتبط و در دسترس مورد تفسیر قرار گیرد. بر اساس شواهدی که در حال حاضر درباره اعتبار بالینی آزمون dd-cfDNA وجود دارد، به نظر می‌رسد سنجش این بیومارکر هم برای مراقبت از گیرندگان پیوند و هم برای بررسی‌های دارای اندیکاسیون بالینی مفید است. بهینه‌سازی هرچه بیشتـــــــر آزمون dd-cfDNA جهت استفاده‌ی بالینی مؤثر چالشی ادامه‌دار است.
فیلیپ هالوران[14]: برای نظارت: خیر. در موارد اندیکاسیون بالینی: با احتیاط بله، اگر بتوان یک الگوریتم احتمالی[15] بر مبنای اعداد پیوسته و نهcutoff ها تعریف کرد که راهنمایی برای شیوه‌ی استفاده از اطلاعات جهت اجتناب از بیوپسی باشد. قیمت بالای تست‌های dd-cfDNA که به‌صورت تجاری در دسترس هستند کاربرد آنها را جهت نظارت و پایش محدود ساخته است. استفاده‌ی مکرر از یک تست مراقبتی پرهزینه در بیماران پایدار بدون وجود اندیکاسیون احتمالاً توجیه‌ناپذیر خواهد بود. اینکه dd-cfDNA واقعاً تعداد بیوپسی‌ها را کاهش داده و منجر به صرفه‌جویی در هزینه‌ها گردد مشاهده نشده است و حتی ممکن است باعث انجام بیوپسی‌های غیرضروری شود.
ما نیاز داریم بدانیم که با بسیاری از مقادیر مبهم dd-cfDNA که با سنجش‌های تجاری به دست می‌آیند چه باید بکنیم، چون این مقادیر می‌توانند منجر به انجام بررسی‌ها و بیوپسی‌های غیرضروری شوند. به الگوریتم‌های خوبی احتیاج داریم که احتمال پس زدن پیونـــــد را در سرتاسر طیف مقادیر dd-cfDNA نشان دهند.
مایکل کلر[16]: dd-cfDNA یک بیومارکر مولکولی کمّی و غیرتهاجمی است که در شرایط آسیب بافت پیوندی افزایش پیدا می‌کند. شواهد اخیر حاکی از این هستند که افزایش سطح dd-cfDNA می‌تواند چندین ماه پیش از بروز تظاهرات بالینی این آسیب رخ دهد. چندین مطالعه هم‌گروهی مشاهده‌ای[17] بر روی گیرندگان پیوند کلیه، قلب و ریه انجام شده است. نتایج این مطالعات نشان می‌دهد که dd-cfDNA ویژگی‌های عملکردی قابل قبولی در شناسایی پس زدن حاد پیوند (هم در پس زدن با واسطه آنتی‌بادی و هم در پس زدن سلولی حاد) داراست.
به طور خاص، dd-cfDNA ارزش اخباری منفی بالایی برای پس زدن حاد پیوند نشان داده است که توان “رد کردن[18]” مؤثر بخش عمده‌ای از موارد [مشکوک به- مترجم] پس زدن حاد را فراهم می‌سازد. این ویژگی‌ها dd-cfDNAی پلاسما را به روشی جذاب برای پایش مراقبتی در مورد آسیب زمینه‌ای بافت پیوندی تبدیل می‌کند. اغلب گیرندگان پیوند قلب و ریه به عنوان استانداردِ مراقبت، جهت غربالگری از نظر پس زدن حاد پیوند تحت بیوپسی روتین قرار می‌گیرند، علی‌رغم اینکه شواهد باکیفیت اندکی در حمایت از کاربرد آن وجود دارد.
این بیوپسی‌ها به عنوان ابزار غربالگری، منجر به خطرات وابسته به شیوه‌ی کار می‌شوند، هزینه‌بر بوده و اغلب ناراحت‌کننده هستند؛ به علاوه، در مورد درجه‌بندی پاتولوژیک نمونه‌های بیوپسی، تفاوت‌های زیادی در تحلیل هیستوپاتولوژیک آسیب شناسان مختلف وجود دارد. Dd-cfDNA روشی ایمن، صحیح و با حداقل تهاجم جهت غربالگری بیماران است که ممکن است نفع آن از انجام بیوپسی بیشتر باشد. اگر مطالعه‌ای تصادفی، کنترل‌شده و با کیفیت بالا، روش سنجش dd-cfDNA جهت نظارت مراقبتی و روش مراقبت روتین توسط بیوپسی را در گیرندگان پیوند قلب و ریه مقایسه نماید، برای اعتباربخشیدن بیشتر به کاربرد آن کمک‌کننده خواهد بود. علاوه بر این، اعتباربخشی بیشتر به مقادیر آستانه[19]ای خاص، به‌عنوان نشانگر وجود پس زدن حاد پیوند مفید خواهد بود.
بر اساس شواهد موجود، استفاده از dd-cfDNA برای نظارت مراقبتی در گروهی از بیماران از جمله دریافت‌کنندگان پیوند قلب و ریه که در معرض خطر بالایی برای عوارض ناشی از پروسه‌ی بیوپسی هستند و نیز طی دوره‌های زمانی همچون پاندمی COVID-19 که امکان مراقبت با بیوپسی محدود می‌شود، منطقی است.
آیوین د. ولامینک[20]: یک خصوصیت امیدبخشِ dd-cfDNA این است که مارکر زودهنگامی برای آسیب بافت پیوندی است؛ بنابراین منطقی است که سنجش dd-cfDNA را در آزمایش‌های مراقبتی جای دهیم، نه اینکه تنها در موارد دارای اندیکاسیون بالینی آن را ارزیابی کنیم. با این وجود، در حال حاضر برخی محدودیت‌های عملی وجود دارند از جمله هزینه‌ی بالای سنجش آن، که لازم است برطرف شوند.
آیا اعتبار بالینی رویکرد انجام آزمایش و گزارش‌دهی dd-cfDNA (درصد dd-cfDNA در مقابل تعداد مطلق کپی‌های آن در هر میلی‌لیتر) باید بهبود یابد؟
مایکل اولریش: هردو رویکرد، هم کسر dd-cfDNA و هم تعیین تعداد مطلق آن در دریافت‌کنندگان پیوند کلیه دارای ضعف‌ها و قوت‌هایی است. تعیینِ کسر این مزیت را دارد که حساسیت کمتری به متغیرهای پیش تحلیلی (مثل کارایی استخراج DNA) دارد و نیز اندازه‌گیری‌ها به راحتی در بین مطالعات مختلف قابل مقایسه هستند. تعیین کسر نسبت به تخریب[21] cfDNA در جریان خون حساس نیست. هرچند این عیب را دارد که تحت تأثیر تغییرات در cfDNAفردِ گیرنده (مثلاً به دلیل عفونت و یا ورزش) قرار می‌گیرد. از آنجا که بخش عمده‌ای از مخرج کسر در تعیین مقدار کمّی را cfDNAی فرد گیرنده تشکیل می‌دهد، لکوسیتوز و یا لکوپنی می‌تواند کسر dd-cfDNA را تغییر دهد. این امر می‌تواند منجر به نتایج مثبت کاذب و یا منفی کاذب شود.
طی مراقبت طولانی مدت، کسر dd-cfDNA به دلیل کاهش در میزان مجموع cfDNA افزایش می‌یابد؛ در نتیجه آستانه باید با آن تطبیق یابد. در پیوند کلیه کاهش در میزان مجموع cfDNA در طی زمان، احتمالاً به دلیل کاهش میزان آپوپتوز سلول‌های سفید خون در نتیجه‌ی کاهش تدریجی[22] دوز داروهای سرکوبگر ایمنی است. تعیین مقدار مطلق (تعداد کپی در هر میلی‌لیتر) این مزیت را دارد که تحت تأثیر تغییرات cfDNA گیرنده ناشی از سایر عوامل قرار نمی‌گیرد و اینکه کاهش تعداد مجموع cfDNA در طی زمان اثری بر آستانه نخواهد داشت. به نظر می‌رسد که در کار بالینی، ترکیب تعیین مقادیر کسری و مطلق، جامع‌ترین اطلاعات تشخیصی را در مورد گیرندگان پیوند کلیه فراهم می‌سازد.
فیلیپ هالوران: کاملاً. وقتی در یک کسر هم صورت و هم مخرج بتوانند تغییر کنند، استفاده از نسبت[23] ها هرگز مطلوب نخواهد بود.
مایکل کلر: مرسوم است که dd-cfDNA پلاسما به صورت درصد گزارش شود که به معنای کسرcfDNA اهداکننده به مجموع cfDNA اهداکننده و گیرنده است، هرچند این روش می‌تواند در توجیه تفاوت میان اندازه‌های نسبی بافت پیوندی فرد اهداکننده و گیرندگان کمک‌کننده باشد اما محدودیت‌های ذاتی در این رویکرد وجود دارد. از آنجایی که cfDNAی گیرنده در مخرج کسر حضور دارد، سطوح پلاسمایی آن درصد dd-cfDNAرا تحت تأثیر قرار خواهد داد. سطوح cfDNAی گیرنده ممکن است در برخی شرایط و بدون ارتباط با وضعیت بافت پیوندی افزایش یابد؛ ازجمله‌ی این شرایط سپسیس، نارسایی چند ارگانی، ورزش شدید و لکوسیتوز است، به همین دلیل در شرایطی که سطوحcfDNA گیرنده تغییر می‌کند، ممکن است تفسیر درصد dd-cfDNA دشوار گردد. این امر همچنین سؤالاتی راجع به اعتبار مقادیر آستانه‌ی خاص برای درصد dd-cfDNA در یافتن و تشخیص انواع مختلف آسیب بافت پیوندی ایجاد می‌کند.
اگر مقادیر آستانه‌ی معیّن شده برای درصد dd-cfDNA، در گروه کنترلی متشکل از افراد با وضعیت پایدار اعتبارسنجی شده و در مورد بیماران سرپایی دریافت‌کننده پیوند که از سایر جهات پایدار هستند اجرا شود، می‌تواند اهمیت بیشتری پیدا کند. هرچند ممکن است تفسیر درصد dd-cfDNA در شرایط بیماری سیستمیک و یا نارسایی ارگانی غیرمرتبط با بافت پیوندی مثلاً در بیماران بستری در بیمارستان دشوار باشد. سنجش مقدار مطلق dd-cfDNA در پلاسما تحت تأثیر cfDNA گیرنده قرار نمی‌گیرد. با این حال، تفاوت‌های موجود در اندازه‌ی بافت‌های پیوندی، مخصوصاً در پیوند ریه که توده‌ی بافتی کلّی می‌تواند تا حد قابل ملاحظه‌ای در افراد مختلف متفاوت باشد، ممکن است قابلیت تفسیر آستانه‌های از پیش تعیین‌شده برای کشف آسیب بافت پیوندی را تحت تأثیر قرار دهد.
مطالعات هم‌گروهی مشاهده‌ای در بیماران گیرنده‌ی پیوند کلیه، ویژگی‌های عملکردی مشابهی را برای مقدار مطلق و درصد dd-cfDNAدر کشف پس زدن حاد نشان داده‌اند. هرچند هر دو روش دارای قوت و ضعف‌هایی هستند، طراحی الگوریتمی با استفاده از ترکیب هردو روش می‌تواند رویکرد بهینه باشد.
آیوین د. ولامینک: واضح است که تغییرات DNAی گیرنده که ارتباطی با سلامت ارگان پیوند شده ندارند، می‌توانند خوانش[24] سهم نسبی DNA اهداکننده را مخدوش کنند. بار مطلق[25] DNAی اهداکننده در جریان خون با چنین مسئله‌ای روبرو نیست و بنابراین ممکن است بتواند خوانش قدرتمندتری از سلامت پیوند فراهم کند، اما این موضوع باید در مطالعات بالینی تأیید شود. ممکن است استانداردسازی سنجش مقدار مطلق DNAی اهداکننده دشوارتر بوده و نسبت به تغییرات در میزان کلیرنس cfDNA از جریان خون حساس باشد؛ بنابراین احتمالاً مدل‌هایی بهینه خواهند بود که بار نسبی و مطلق cfDNA را ادغام کنند.
از رویکرد “بیوپسی مولکولی” بهتر است برای نظارت استفاده شود یا آزمایش‌های دارای اندیکاسیون بالینی؟
فیلیپ هالوران: نظارت: برای کلیه خیر، بیوپسی با هدف نظارت در مورد کلیه توجیه‌پذیر نیست؛ برای قلب بله زیرا متغیرهای بافت‌شناسی کاپا ضعیف هستند.
با اندیکاسیون بالینی: محتاطانه بله. پزشکان بالینی نیاز به ارزیابی‌های کمّی دارند که تنها ارزیابی مولکولی می‌تواند فراهم کند؛ گرچه ما برای اجتناب از انجام بیوپسی بر اساس اعداد پیوسته و نه cutoffها نیازمند الگوریتم‌های احتمالی هستیم تا در استفاده از اطلاعات ما را راهنمایی کنند.
آیوین د. ولامینک: بیوپسی مولکولی یک فناوری عالی است که توصیف دقیق مسیرهای مختلف پس زدن پیوند را ممکن ساخته است. این روش نشان‌دهنده‌ی پیشرفت مهمی در طب پیوند است، اما از آنجایی که به بیوپسی تهاجمی بافت وابسته است، نقش محدودی به عنوان ابزار نظارت ایفا می‌کند و جهت آزمایش‌های دارای اندیکاسیون بالینی مناسب‌تر خواهد بود. یک تست ایده‌آل، تستی است که با استفاده از نمونه خون (و نه بیوپسی بافت) به وضوح و تفکیک‌پذیری پاتولوژی سلولی بیوپسی مولکولی دست یابد.
با هدف بهبود اعتبار و پذیرش بالینی، آیا بهتر است dd-cfDNA و یا “بیوپسی مولکولی” در یک مکان متمرکز انجام شود و یا در مراکز محلی پیوند عضو؟
آنجلا وو[26]: بخش عمده‌ای از کار ما بر پایش تعاملات بین میکروب‌ها و میزبانان آنها در موقعیت بالینی متمرکز بوده است؛ خواه این میکروب‌ها بیماری‌زا باشند خواه نباشند. ما دریافتیم که ترکیب متاژنومیک نمونه‌های “بیوپسی مولکولی” علاوه بر نظارت بر سرکوب ایمنی، می‌تواند در مورد وضعیت سلامت بیمار نیز حاوی اطلاعات بسیار مهمی‌باشد. هنگامی که این اطلاعات متاژنومیک در ترکیب با dd-cfDNA، بیومارکرهای مرتبط با میزبان و سایر اقدامات بالینی مورد استفاده قرار بگیرد، می‌تواند باعث افزایش صحت تشخیص و پیش‌بینی نتیجه شود.
بر اساس ارزیابی‌های ما، نتایج “بیوپسی مولکولی” می‌تواند به شدت تحت تأثیر عملکردهای متفاوت بالینی در مراکز بالینی مختلف قرار گیرد. به طور خاص، اگر جزء میکروبی را هم در نظر بگیریم، میکروب‌های محیطی در مکان‌های مختلف می‌توانند بسیار متفاوت باشند. این موضوع نتایج آزمایش را تحت تأثیر قرار داده و تصمیم‌گیری را دچار مشکل[27] می‌کند. برای اطمینان از قوی بودن مدیریت نمونه‌ها و نتایج، ترجیح بر این است که پردازش نمونه‌ها در یک مکان مرکزی انجام گیرد. روشهای بر پایه‌ی مولکولی بیشتری برای محافظت از تمامیت نمونه‌ها و کاستن از میزان از دست رفتن و یا تغییر cfDNA نیز در دست ایجاد و ساده‌سازی هستند تا چالش‌های لجستیکی مرتبط با ارسال نمونه‌ها به مراکز اصلی بهبود یابند.
مایکل اولریش: برای اجرای روتین آزمون dd-cfDNA چندین چالش وجود دارد. آزمایشگاه نیاز به ابزارهای دقیق خاصی همچون یک ddPCR و یا یک ابزارتوالی‌یابی نسل جدید[28] (NGS) و نیز کارکنان حرفه‌ای و متخصص دارد. برای این آزمون‌ها اعتباربخشی استاندارد سنجش شیمی بالینی ضروری است و پیشنهاد می‌شود برنامه‌هایی جهت مدیریت کیفیت خارجی توسعه یابند. به علاوه، توصیه‌هایی مربوط به کار بالینی نیز باید ایجاد شود. آزمایشگاه‌های مرجع متمرکز می‌توانند از مزیت هزینه‌های کمتر در عین کیفیت بالای آزمایش‌ها برخوردار باشند. البته برتری آزمایشگاه‌های منفرد واقع در مراکز پیوند نیز در این است که اگر بناست نتیجه‌ی تست واقعاً برای تصمیم‌گیری مورد استفاده قرار گیرد، برای رسیدن نتایج تست dd-cfDNA برای بیماران بستری به زمان کمتری نیاز خواهند داشت.
در مورد بیماران سرپائی، خدمات آزمایشگاه‌های مرجع متمرکز، مقبولیت وسیع‌تری خواهد داشت. لازم است تعداد دفعات لازم جهت نظارت بر بیماران که مقرون به صرفه باشد، در کارآزمایی‌های آینده‌نگر پیامد بالینی[29] تعیین شود. در صورت استفاده از فناوری‌هایی با قیمت منطقی، هزینه‌ی نظارت بر بیماران با dd-cfDNA نسبتاً پایین خواهد بود. ضمناً انتظار می‌رود که در نتیجه‌ی کاهش آسیب به بافت پیوندی با استفاده از آزمایش سریال dd-cfDNA و سایر رویکردهای مرتبط، همچون بیوپسی مولکولی، هزینه‌های ناشی از بازگشت بیمار به دیالیز و یا پیوند مجدد به طور چشمگیری کاهش یابد.
فیلیپ هالوران: در حال حاضر، در صورت امکان بهتر است همواره در آزمایشگاه‌های مرکزی انجام شود. همان‌طور که توسط اندازه‌گیری DSA با استفاده از Luminex نشان داده شد، عملکرد سنجش‌های مولکولی به عنوان کیت در آزمایشگاه‌های محلی به اندازه کافی قابل تکرار نبوده است. تفاوت در دستگاه‌ها، تفاوت‌های داخلی و بین آزمایشگاهی و تصمیمات محلی (به عنوان مثال میانبرها) منجر به ایجاد تفاوت‌های غیر قابل قبول می‌شوند. این امر مخصوصاً زمانی صدق می‌کند که از الگوریتم‌های یادگیری ماشینی که به طور متمرکز جمع آوری شده‌اند برای تفسیر نتایج به‌دست‌آمده در آزمایشگاهی محلی و در دستگاهی متفاوت استفاده شود. سنجش‌های مولکولی باید تا زمانی که اعتبار عملکردها و دستگاه‌های محلی به تأیید رسیده و به‌طور مداوم از نظر تفاوت‌ها تحت نظر قرار می‌گیرد به‌صورت مرکزی انجام شوند.
مایکل کلر: در حال حاضر ایده‌آل این است که با هدف حفظ کیفیت سنجش‌ها، کاهش تفاوت‌های بین آزمایشگاهی در نتایج و بهره بردن از تخصّص، سنجش‌هایی که برای کشف و تعیین مقدار dd-cfDNA صورت می‌گیرد، در مکان‌های متمرکز انجام شوند. پذیرش و آشناسازی فناوری پیچیده‌ای که برای اجرای این سنجش‌ها موردنیاز است، می‌تواند پیاده‌سازی آن را در بسیاری از مراکز محلی پیوند عضو محدود سازد. هرچند انجام سنجش در مکان‌های متمرکز ممکن است زمانبرتر باشد، اما این امر در موقعیت‌های بالینی مختلفی همچون نظارت‌های مراقبتی و یا ارزیابی پاسخ به درمان، مسئله‌ای محسوب نمی‌شود.
آیوین د. ولامینک: بیوپسی مولکولی، فناوری عظیمی است که ما را قادر به توصیف دقیق مسیرهای مختلف پس زدن پیوند ساخته است. این روش نشان‌دهنده‌ی پیشرفت مهمی در طب پیوند است، اما چون وابسته به بیوپسی تهاجمی بافت است، نقش محدودی به عنوان ابزار مراقبت ایفا می‌کند و جهت آزمایش‌های دارای اندیکاسیون بالینی مناسب‌تر است. یک تست ایده‌آل، تستی است که با استفاده از نمونه خون (و نه بیوپسی بافت) به وضوح و تفکیک‌پذیری پاتولوژی سلولی بیوپسی مولکولی دست یابد.
در رابطه با پایش کفایت سرکوب ایمنی، آیا جایگاهی برای dd-cfDNA، “بیوپسی مولکولی” و یا دیگر روشهای نوین تشخیصی مولکولی قائل هستید؟
آنجلا وو: همان‌طور که پیش‌تر بیان کردم، مطالعات ما بر جنبه‌ی متاژنومیک cfDNA متمرکز بوده است که میکرب‌های مشتق شده از هردوی افراد اهداکننده و گیرنده (شامل گونه‌های باکتریایی، قارچی و ویروسی) را در بر می‌گیرد. مشاهده شده است که نظارت بر فراوانی میکرب‌ها و ویروس‌ها در cfDNA راهی به‌طور بالقوه امکان‌پذیر برای ارزیابی کفایت سرکوب ایمنی و همچنین نیاز به پروفیلاکسی با داروهای ضد ویروسی است. برای بررسی‌های بیشتر در این زمینه، دو مسیر اصلی وجود دارد:
(1) نظارت دقیق و کشف میکروب‌های خاصی که باعث نگرانی هستند و (2) مراقبت وسیع تنوع و غنای میکروبی به عنوان نماینده‌ی وضعیت کلی سرکوب ایمنی.
در مورد مسیر اول، از قبل می‌دانیم که برخی ویروس‌های معیّن به طور خاص مشکل‌ساز هستند و امکان انتقال آنها از فرد اهداکننده به فرد گیرنده از طریق ارگان پیوندشده وجــــــــــــود دارد؛ (به عنوان مثال CMV، HBV/HCV مخصوصاً در برخی نواحی آسیا مسئله‌ساز هستند). ردیابی هدفمند[30]cfDNA و یا RNAای که از این ویروس‌ها منشأ می‌گیرند، هزینه‌ی کمتر و مقبولیت بالاتری دارد. به همین دلیل، ممکن است ردیابی در سرتاسر ژنوم یا رونوشت[31] با استفاده از روشهای بر پایه‌ی توالی‌یابی[32] غیرضروری باشد. با این وجود، سنجش PCR هدفمند نیز دچار محدودیت‌های دیگری است؛ از جمله مشکلاتی که در صورت پایین بودن لود ویروسی بروز می‌کند و موتاسیون‌های ویروسی که منجر به نتایج منفی کاذب می‌شوند.
امکان‌پذیری رویکردی بینابینی میان PCR هدفمند و توالی‌یابی تمام cfDNA، قابلیت بررسی بیشتر را داراست؛ مثلاً توالی‌یابی هدفمند و یا PCR چندتایی[33] یا پانل محور. توالی‌یابی هدفمند که از پروب‌های نیمه اختصاصی برای گیر انداختن مولکول‌های ویروسی بالقوه استفاده می‌کند و به دنبال آن NGS برای تعیین فراوانی سطوح گونه‌های خاص، می‌توانند راهی برای کسب اطمینان در مورد هم حساسیت و هم ویژگی باشند. به علاوه، ابزارهای سنجشPCR که در حال حاضر به‌صورت تجاری وجود دارند، ویروس‌های در حال همانندسازی را هدف‌گیری می‌کنند که DNA ویروسی نسبتاً کامل و طویلی دارند. اگر امکان آن باشد که با اضافه کردن ایزولاسیون تکه‌های کوتاه DNA بتوان cfDNA را در پروسه‌ی ردیابی گنجاند، این امر نیز می‌تواند حساسیت ردیابی را افزایش دهد.
مایکل اولریش: dd-cfDNA می‌تواند برای تعیین کمترین میزان لازم از تماس بیمار با داروهای سرکوبگر ایمنی و نیز فراهم ساختن اطلاعاتی کاربردی[34] جهت بهینه‌سازی درمان سرکوب ایمنی مفید باشد. این روش می‌تواند راهنمای کاهش تدریجی دوز داروها در بیماران باشد، به نحوی که مانع از فعال شدن سیستم ایمنی بیماران گردد. در اغلب موارد، برای درمان عفونت‌های ویروسی ضروری است که دوز داروهای سرکوبگر ایمنی کاهش یابد و dd-cfDNA می‌تواند برای کشف ناکافی بودن سرکوب سیستم ایمنی و بهبود مدیریت آن سودمند باشد. عدم کفایت سرکوب ایمنی می‌تواند به ایجاد DSA[35] کمک کند. DSA عامل خطری برای پس زدن پیوند باواسطه‌ی آنتی‌بادی و از پس زدن تاخیری بافت پیوندی در پیوند کلیه است.
غلظت پایین تاکرولیموس در برخی از بیماران با سطوح افزایش‌یافته‌ی dd-cfDNA همراهی داشته که نشان‌دهنده‌ی فعال شدن سیستم ایمنی است. سنجـــــــــــش Dd-cfDNA نسبت به نظارت بر سطوح داروهای سرکوبگر ایمنی که نشانگر مسمومیت هستند برتری دارد؛ اما پیش‌بینی‌کننده‌ی ضعیفی برای آسیب بافت پیوندی ناشی از سرکوب ناکافی سیستم ایمنی است. البته مارکرهای بیوشیمیایی مرسوم نیز با محدودیت‌هایی روبرو هستند؛ به عنوان مثال، در گیرندگان پیوند کلیه، میزان قابل‌توجهی از آسیب بافتی می‌تواند قبل از آنکه افزایش در سطح کراتینین پلاسما مشاهده شود روی داده باشد. به علاوه، افزایش کراتینین پلاسما برای آسیب بافت پیوندی اختصاصی نیست. به دلیل فقدان مطالعات اعتباربخش، از استراتژی‌های جایگزین جهت نظارت بر بیان ژن‌های مرتبط با پس زدن پیوند و یا فعالیت سیستم ایمنی در سطح وسیعی استفاده نمی‌شود. انجام بیوپسی های سریال به لحاظ بالینی غیرعملی بوده و در یک درصد موارد با عوارض عمده همراهی دارد.
به نظر می‌رسد مراقبت توسط سنجش dd-cfDNA به طور خاص در مورد بیمارانی که تحت درمان‌های ضد انعقاد قرار داشته و در معرض خطر بیشتری برای عوارض مرتبط با بیوپسی هستند مفید خواهد بود. سنجش
dd-cfDNA نسبت به بیوپسی‌های پروتکل محور برای کشف ناکافی بودن سرکوب ایمنی (که منجر به فعال شدن سیستم ایمنی می‌شود) عملی‌تر است. این موضوع مخصوصاً در بیماران دریافت‌کننده پیوند کلیه که به مصرف مرتب داروهای تجویزشده پایبند نیستند، بار عدم تطابق اپی‌توپ[36] بالایی داشته و توانش ایمنی[37] بالایی دارند، مهم است. Dd-cfDNA ابزار تشخیصی ارزشمندی برای نظارت بر بیماران پیوندی است که در حال کاهش دوز داروهای سرکوبگر ایمنی هستند.
فیلیپ هالوران: احتمالاً خیر، به‌جز اینکه آنها پس زدن پیوند را تشخیص می‌دهند. به نظر من نظارت بر ویروس‌های اندوژن روش بهتری بود. سناریوهای خاصی عدم مصرف منظم دارو و عدم کفایت سرکوب ایمنی اخیر را مطرح می‌کنند که این موارد را می‌توان در بیوپسی‌های دارای اندیکاسیون بالینی توسط آزمایش‌های مولکولی مرکزی شناسایی کرد.Dd-cfDNA پس زدن پیوند احتمالی را که در حال وقوع است شناسایی می‌کند. پس این موضوع به نحوی بازتاب سرکوب ایمنی است.
مایکل کلر: عوامل سرکوب‌کننده ایمنی از جمله مهارکننده‌های کلسی نورین (تاکرولیموس و سیکلوسپورین) عموماً تنظیم دوز می‌شوند تا به غلظت موردنظردر [پلاسمای- مترجم] بیماران گیرنده‌ی پیوند ارگان‌های توپر برسند. به دلیل فعل و انفعال پیچیده‌ی عوامل متابولیک مختلف و تداخلات دارویی، دوزهای موردنیاز برای دستیابی به این غلظت‌ها ممکن است بین افراد مختلف تفاوت چشمگیری داشته باشد. سطوح هدف معینی از حداقل غلظت این داروها[38] در خون می‌تواند سرکوب ایمنی کافی را برای عده‌ای از بیماران ایجاد کند، اما برخی دیگر ممکن است اپیزودهایی از پس زدن حاد پیوند را با همان سطوح حداقل غلظت دارویی تجربه کنند.
به علاوه، بروز نوسان‌ها و تغییرات در غلظت‌های حداقلی هدف‌گذاری‌شده، شایع است. به یک معنا، توانـــــایی dd-cfDNA در کشف صحیح اپیزودهای پس زدن حاد پیوند، نشانگر کفایت سرکوب ایمنی است؛ با این وجود، یکی از اهداف اولیه سرکوب ایمنی جلوگیری از بروز پس زدن حاد پیوند بود. Dd-cfDNA به عنوان یک بیومارکر کمّی برای آسیب بافت پیوندی می‌تواند امکان تعیین تیتر شخصی‌شده[39] از داروهای سرکوبگر ایمنی را برای دستیابی به سطح دقیقی از سرکوب ایمنی فراهم کند که مختص فرد گیرنده‌ی پیوند بوده و از بروز پس زدن حاد پیوند جلوگیری می‌کند. این موضوع اگرچه در تئوری بسیار امیدبخش است، مطالعات بیشتری جهت شفاف‌سازی و تأیید اعتبار آن برای این کاربرد موردنیاز است.
آیوین د. ولامینک: شکی نیست که خوانش کمّی سرکوب ایمنی در طب پیوند موردنیاز است. با این وجود، سنجش dd-cfDNA تنها نشانه‌ی غیرمستقیمی از سرکوب ایمنی را فراهم می‌سازد. روشهای تشخیص مولکولی که مجموعه[40]ی سلول ایمنی، نشانه‌های رونوشتی[41] سلول‌های ایمنی و یا بار ویروس‌های اندوژن در جریان خون را مورد بررسی قرار دهند، ممکن است در آینده خوانش مستقیم‌تری از کفایت سرکوب ایمنی فراهم نمایند.
چه رویکردهای مولکولی باید برای بهبود نظارت، کشف و یا توصیف پس زدن پیوند با هم ترکیب شوند؟ آیا این اتفاق قریب‌الوقوع است؟
آنجلا وو: ظهور مطالعه‌هایی راجع به dd-cfDNA که نه تنها بر محتوای توالی DNA بلکه بر ویژگی‌های اضافه‌تری همچون نشانه‌های متیلاسیون، نمایه‌های تکه‌تکه شدن[42] و یا ترکیب میکربی نیز متمرکز هستند، همگی در کسب اطلاعات اضافه‌تر کمک‌کننده هستند. این اطلاعات استفاده از dd-cfDNA را به عنوان یک نماینده برای سلامت ارگان، وضعیت بیماری و شرایط ایمنی میزبان بهبود می‌بخشد. به عقیده‌ی من، ترکیب این رویکردها در نهایت به ما اجازه می‌دهد تا روش سنجشی هم برای نظارت و کشف و هم برای تعیین پیش آگهی ایجاد کنیم.
شکی نیست که استفاد از این روشهای سنجش و ارزیابی مطلوب بوده و موجب بهبود اخد تصمیمی می‌گردد اما در نهایت مقدار اطلاعات به دست آمده باید نسبت به هزینه‌ها و نیاز بالینی سنجیده شود تا در شرایط زندگی واقعی قابل استفاده باشد. ما نیاز به فناوری‌های اضافه‌تری داریم که بتوانند این اطلاعات را با هزینه‌های کاهش‌یافته و روش اجرایی آسان از dd-cfDNA به دست بیاورند تا امکان‌پذیرش وسیع آنها فراهم شود.
مایکل اولریش: تعیین dd-cfDNA به صورت سریال برای دستیابی به سرکوب ایمنی در بیماران به‌صورت شخصی‌سازی‌شده برای هر فرد و با کاهش بالقوه‌ی از دست رفتن زودرس پیوند[43] مفید خواهد بود. تحقیقات بیشتری برای جستجوی ترکیب‌هایی از dd-cfDNA با سایر بیومارکرها از جمله کموکاین‌ها (CXCL10، CXCL9)، DSA، microRNAها و نیز یکmRNA ی نشانگر ژنی بر پایه‌ی بافت[44] (MMDx) برای افزایش بیشتر دقت تشخیصی موردنیاز است. برای نشان دادن اینکه تغییراتی که در اثر راهنمایی‌های dd-cfDNA در درمان ایجاد می‌شود پیامدها را بهبود خواهد بخشید، باید مطالعات کاربرد بالینی تصادفی‌شده‌ای به‌صورت آینده‌نگر انجام شود.
فیلیپ هالوران: تصویر پدیدارشده از روشهای سنجشی که به صورت تجاری موجود هستند این است که مقادیرِ کم، نشان‌دهنده‌ی احتمال بسیار اندک برای پس زدن حاد پیوند هستند و مقادیر بالا معمولاً به دلیل پس زدن حاد پیوند باواسطه‌ی آنتی‌بادی و یا پس زدن با واسطه‌ی سلول T است؛ اما در بعضی از مواقع هم توضیحی برای آنها وجود ندارد. مقادیر متوسط شایع‌تر هستند و در مورد اینکه چطور باید اقدامات را هدایت کنند به شفافیت بیشتری موردنیاز است. به طور کلی ما درباره‌ی اینکه چگونه و با توجه به زمان پس از پیوند یک نتیجه قابل اجراست: (الف) در بیمار فاقد هرگونه اندیکاسیون و (ب) در بیماری که در او شک قوی به بروز پس زدن پیوند داریم و اندیکاسیون بیوپسی دارد به اطلاعات احتمال-محور[45] بیشتری نیاز داریم.
مایکل کلر: dd-cfDNA ابزاری جذاب و دارای توان بالقوه برای فراهم کردن انواعی از کاربردهای مفید بالینی است؛ به عنوان مثال، کشف آسیب بافت پیوندی، ارزیابی پاسخ به درمان در موارد پس زدن حاد، نظارت بر کفایت سرکوب ایمنی و کاربرد در تعیین پیش‌آگهی. تأیید بیشتر اعتبار کاربرد بالینی آن و جای گرفتن آن در مراقبت بالینی روتین می‌تواند فیلد پیوند ارگان‌های توپر را به دوره‌ای از طب دقیق[46] و مراقبت‌های شخصی‌شده رهنمون باشد که تاکنون تجربه شده است. کاربرد ترکیبی آن با سایر رویکردهای مولکولی نشان‌دهنده‌ی امیدهای بیشتری است.
سیستم‌های بر پایه‌ی میکروآرایه که الگوهای بیان RNAی پیامبر[47] را تحلیل می‌کنند، مانند سیستم‌های تشخیص با میکروسکوپ مولکولی ([48]MMDx) ممکن است صفات مولکولی را معیّن کنند که در کشف و افتراق بین انواع مختلف پاتولوژی‌های بافت پیوندی یاری‌دهنده باشد، به علاوه ممکن است در مورد وضعیت‌هایی که در آنها افزایش در سطوح dd-cfDNA با شواهد هیستوپاتولوژیک مبنی بر آسیب بافت پیوندی همراهی ندارد، شفاف‌سازی بیشتری فراهم کنند. هرچند ممکن است افق در حال نزدیک شدن باشد، برای تعیین ابعاد مختلفی مربوط به تفسیر مناسب و کاربردهای بالینی آن، تحقیقات بیشتری موردنیاز است.
آیوین د. ولامینک: Dd-cfDNA اساساً مارکری برای آسیب بافت پیوندی است. در این سادگی یک نقطه قوت عمده و نیز محدودیتی مهم وجود دارد و آن اینکه DNAی فرد اهداکننده، دید عمیق‌تری در مورد علت آسیب بافت پیوندی فراهم نمی‌سازد. همچنان که رو به جلو در حرکت هستیم، می‌توان مجسم کرد که رویکردهای مولکولی می‌توانند اطلاعات دقیق‌تری در مورد انواع بافت‌ها و سلول‌های آسیب‌دیده فراهم کنند. این امر به‌نوبه‌ی خود تشخیص بین دلایل مختلف آسیب بافت پیوندی از جمله عفونت و آسیب مرتبط با پس زدن پیوند را ممکن می‌سازد. پیشرفت‌های اخیر در روشهای سنجش که راجع به cfRNA و نشانه‌های اپی‌ژنتیک درون cfDNA مختص انواع سلول تحقیق می‌کنند، می‌توانند پیشنهادکننده‌ی مسیری رو به جلو باشند.
برگردان از :
Molecular Approaches to Transplant Monitoring; Is the Horizon Here?
Clinical Chemistry 67:11 (2021)
[1] Monitoring
[2] Allograft
[3] Donor-specific antibody
[4] Surveillance
[5] Phenotype
[6] Centers for Medicare and Medicaid Services of the United States
[7] Plasma-based donor-derived cell-free DNA
[8] Microarray
[9] Michael Oellerich
[10] Trigger
مساحت زیر منحنی[11]
[12] advanced interstitial fibrosis and tubular atrophy
[13] Individualized
[14] Philip Halloran
[15] Probabilistic algorithm
[16] Michael Keller
[17] Observational cohort studies
[18] Rule out
[19] Threshold
[20] Iwijn De Vlaminck
[21] Degradation
[22] Tapering
[23] Ratio
[24] Readout
[25] Absolute burden
[26] Angela Wu
[27] downstream
[28] Next Generation Sequencing
[29] Prospective clinical outcome trial
[30] Targeted detection
[31] Transcriptome
[32] Sequencing
[33] Multiplexed
[34] Actionable
[35] Donor Specific Antibodies
[36] Epitope mismatch burden
[37] Immune competence
[38] Trough level
[39] Personalized
[40] Repertoire
[41] Transcriptional signatures
[42] Fragmentation profiles
[43] Premature graft loss
[44] mRNA tissue-based gene signature
[45] Probabilistic information
[46] Precision medicine
[47] Messenger RNA
[48] Molecular Microscope Diagnostic systems
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/allograft
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام