تشخیص دیابت

نکات مهم آزمایشگاهی در آزمایش‌های تشخیص دیابت

(قسمت اول)

دکتر حبیب‌الله گل‌افشان، هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی شیراز

محمد اسماعیل خدمتی، کارشناس ارشد بیوشیمی دانشکده پیراپزشکی شیراز

گرچه با قند خون ناشتای بیشتر از ۱۲۶ میلی‌گرم در هر دسی‌لیتر در یک یا چند نوبت می‌توان دیابت را تشخیص داد، اما برخی بر این باورند که تشخیص بر مبنای افزایش قند خون ناشتا موجب کاهش سرعت تشخیص می‌گردد. عوارض دیابت از قبیل رتینوپاتی، پروتئین‌اوری و اختلالات نوروماسکولار در حدود ۳۰ درصد بیماران در بدو تشخیص بالینی دیابت وجود دارد و شروع دیابت حداقل ۴ تا ۷ سال قبل از تشخیص بالینی رخ داده است.

معیارهای تشخیصی دیابت:

معیارهای تشخیص دیابت از سوی انجمن دیابت هر کدام از موارد زیر است:

• میزان هموگلوبین A1C بیشتر یا مساوی شش و نیم درصد یا
• قند خون ناشتا بیشتر از ۱۲۶ میلی‌گرم در دسی‌لیتر یا
• قند خون دوساعته بیشتر از ۲۰۰ میلی‌گرم در دسی‌لیتر در طی تست تحمل گلوکز یا
• اندازه‌گیری گلوکز راندوم بیشتر از ۲۰۰ میلی‌گرم در دسی‌لیتر بدون توجه به صرف آخرین غذا همراه با علائم پر ادراری و پرنوشی و کاهش وزن

میزان نرمال گلوکز صبح ناشتا کمتر از ۱۰۰ میلی‌گرم درصد است و قند خون بین حداکثر نرمال و کمتر از آستانه دیابت به‌عنوان پره‌دیابت محسوب می‌شود. برای تشخیص دیابت حاملگی معیارهای حساس‌تری در نظر گرفته می‌شود.

برای آزمایش قند خون ناشتا بیمار بایستی حداقل ۸ ساعت ناشتا باشد و در این مدت از خوردن غذای جامد خودداری کند. نوشیدن آب بلامانع است زیرا دهیدراسیون و هموکانسنتره شدن خون موجب افزایش کاذب قند می‌شود. بیمار بایستی از مصرف الکل، دخانیات، کافئین، جوشانده‌های گیاهی و داروهایی که روی قند اثر دارد خودداری کند.

با آزمایش تحمل گلوکز (OGTT) و سنجش سریال گلوکز خون پس از خوردن مقدار مشخص قند می‌توان افراد دیابتیک را از افراد سالم جدا ساخت و اگرچه آزمایشی حساس‌تر از قند خون ناشتا است ولی آزمایش تحت تأثیر فاکتورهای متعددی از قبیل مدت زمان ناشتا بودن، مصرف کربوهیدرات قبل از آزمایش، داروها از قبیل تیازیدها، قرص‌های ضدحاملگی و داروهای استروئیدی قرار می‌گیرد. سن، فعالیت و وزن از دیگر فاکتورهای مؤثر بر آزمایش هستند، علاوه بر این نوع گلوکز خوراکی بدون آب یا آب‌دار، مقدار گلوکز، حجم محلول گلوکز و سرعت نوشیدن محلول گلوکز و مواردی از قبیل وضعیت بدن، دلواپسی، سیگار، فعالیت و ساعت آزمایش در هنگام آزمایش اثرگذار است.

با توجه به فاکتورهای فوق حدود ۲۰ درصد موارد آزمایش OGTT در گروه غیرتشخیصی قرار می‌گیرد و برای مثال فقط یک نمونه از چند نمونه افزایش قند خون را نشان می‌دهد و ازاین‌رو چنانچه نتایج آزمایش برای تشخیص واضح نباشد، بهتر است آزمایش OGTT در دو زمان مختلف انجام شود و سپس قضاوت گردد.

برای انجام OGTT بایستی موارد زیر رعایت گردد:

1. در صورت امکان قطع داروهایی که بر تست تحمل قند اثر می‌گذارند.
2. آزمایش پس از سه روز از رژیم غذایی بدون محدودیت و حاوی حداقل ۱۵۰ گرم کربوهیدرات در روز انجام گیرد و در این مدت منع فعالیت نداشته باشد.
3. زمان آزمایش بین ساعت ۷ تا ۹ صبح و بعد از حدود ۱۰ ساعت ناشتایی صورت گیرد و در طی آزمایش از فعالیت و سیگار کشیدن خودداری گردد.
4. تست تحمل گلوکز بر روی بیماران بستری و غیرفعال نبایستی انجام گیرد.
5. بعد از نمونه‌گیری ناشتا، ۷۵ گرم گلوکز برای بزرگسالان مرد و خانم‌های غیرحامله و 1/5 گرم به ازای هر کیلو برای بچه‌ها در نظر گرفته می‌شود. پودر در ۳۰۰ سی‌سی آب حل شده و در مدت ۵ دقیقه نوشیده می‌شود.
6. نوشیدن ناکافی محلول قند و تهوع در حین نوشیدن محلول قندی و آزمایش OGTT در بعدازظهر همه موجب نتایج اشتباه در تست تحمل گلوکز می‌شوند.

بستن طولانی مدت تورنیکت و باز و بسته کردن دست موجب مصرف زیاد گلوکز و کاهش قند خون می‌گردد. سرم یا پلاسما باید ظرف ۳۰ دقیقه از سلول‌ها جدا گردد و چنانچه امکان‌پذیر نیست بایستی نمونه روی یخ قرار بگیرد یا سدیم فلوراید به نمونه اضافه شود. سدیم فلوراید با ممانعت از فعالیت آنزیم انولاز (enolase) قند را ثابت نگه می‌دارد ولی این بازدارنده تا وارد گلبول قرمز شود چند ساعت (۳ الی ۴ ساعت) طول می‌کشد.

در مواردی که بیمار پلی‌سیتمی ‌دارد یا نوزاد دارای هموگلوبین بالا است و یا بیمار دارای لکوسیتوز بیشتر از ۶۰۰۰۰ در میلی‌متر مکعب باشد، هرچه زودتر بایستی سرم را جدا کرد چون مصرف قند توسط سلول‌ها بین ۲ تا ۱۰ میلی‌گرم به ازای هر دسی‌لیتر توسط گلبول‌ها در هر ساعت است. گلوکز ناشتا در خون شریانی ۲ تا ۵ میلی‌گرم درصد بالاتر از خون کاپیلاری و ۵ تا ۱۰ میلی‌گرم به ازای هر دسی‌لیتر بیشتر از خون وریدی است ولی با خوردن غذا تفاوت قند آرتریال و کاپیلاری از وریدی ممکن است به ۲۰ تا ۷۰ میلی‌گرم درصد برسد.

اندازه‌گیری قند بر مبنای گلوکز اکسیداز، هگزوکیناز و گلوکز دی‌هیدروژناز انجام می‌شود. در روش اکسیداز تداخل با خاصیت ضد اکسیداسیون (redox) قوی مانند اسید اوریک، بیلی‌روبین، همولیز، گلوتاتیون، استواستات و اسکوربیک اسید مشاهده می‌شود.

 

در حالت نرمال قند ناشتا در محدوده طبیعی است و در طی یک ساعت از آزمایش میزان آن به حداکثر می‌رسد که این میزان بیشتر از آستانه دفع کلیوی (160 الی 180 میلی‌گرم درصد) نمی‌شود و پس از 2 الی 2/5 ساعت به حد ناشتا برمی‌گردد.

در بیماران دیابتی قند خون ناشتا بالاتر از 126 میلی‌گرم درصد است و طی 1 الی 1/5 ساعت به بیشترین میزان خود می‌رسد که از سطح دفع آستانه کلیوی بیشتر است و سطح گلوکز خون بعد از 2/5 ساعت به سطح میزان ناشتایی نمی‌رسد و این از مشخصات بارز دیابت است.

الگوی OGTT در بیماران با پرکاری تیروئید، بعد از برداشتن معده یا قسمتی از روده، در طی حاملگی و نیز در اوایل دیابت ممکن است سطح گلوکز ناشتا نرمال باشد و در 0/5 تا یک ساعت سطح گلوکز حتی تا بیشتر از حد آستانه دفع کلیوی بالا رفته ولی برگشت به مقادیر نرمال سریع و کامل است.

آزمایش‌های غربالگری و تأییدی برای تشخیص دیابت حاملگی

• آزمایش در صبح بعد از حداقل 8 ساعت ناشتایی انجام گیرد.
• گلوکز صبح ناشتا اندازه‌گیری شود.
• 75 گرم گلوکز نوشیدنی به بیمار داده شود.
• چنانچه یک داده‌ی آزمایشگاهی بیشتر یا مساوی از مقادیر زیر بود دیابت حاملگی تأیید می‌گردد.

آزمایش دومرحله‌ای:

مرحله اول:

• آزمایش روی تمام خانم‌های حامله در هفته‌های 24 تا 28 حاملگی که تشخیص قبلی دیابت ندارند انجام شود.
• 50 گرم گلوکز نوشیدنی بدون توجه به زمان و بدون توجه به صرف آخرین غذا نوشیده می‌شود.
• آزمایش قند خون وریدی یک ساعت پس از نوشیدن انجام می‌شود.
• چنانچه میزان قند خون بیشتر یا مساوی 140 میلی‌گرم در دسی‌لیتر بود، بیمار وارد مرحله دوم آزمایش می‌شود. برخی سطح آستانه برای ورود به مرحله دوم را میزان قند بیشتر از 135 در نظر گرفته‌اند.

مرحله دوم:

• آزمایش در صبح ناشتا پس از حداقل 8 ساعت ناشتایی انجام می‌گیرد.
• قند خون ناشتا اندازه‌گیری شود.
• 100 گرم گلوکز نوشیدنی به بیمار داده می‌شود.
• سطح گلوکز خون هر ساعت تا 3 ساعت اندازه‌گیری شود.
• چنانچه دو سطح گلوکز بیشتر یا مساوی مقادیر زیر باشد، تشخیص دیابت حاملگی قطعی می‌شود.

با وجودی که دیابت حاملگی برای مادر خطر جدی در بر ندارد و اغلب بدون علامت است ولی با مرگ‌ومیر جنین و گاهی تولد نوزاد با وزن بیشتر از ۴۰۰۰ گرم همراه است.

افزایش وزن، کاهش قند خون، کاهش کلسیم، کاهش منیزیوم، اختلالات قلبی تنفسی، افزایش بیلی‌روبین، آسیب‌های هنگام زایمان و ناهنجاری‌های مادرزادی از اختلالات شایع در نوزاد با مادر مبتلا به دیابت است

ترشح زیاد انسولین از سوی جنین در پاسخ به افزایش قند خون موجب رشد جنین می‌گردد. مادران با دیابت حاملگی در خطر ۷ برابری ابتلا به دیابت تایپ ۲ نسبت به حاملگی‌های غیردیابتی هستند. افزایش شانس ابتلا در ۵ سال اول بوده و پس از ۱۰ سال شانس ابتلا به‌صورت خطی (Plateau) می‌رسد. دیابت حاملگی در مادرانی که سابقه دیابت از قبل دارند ممکن است با ناهنجاری‌های جنینی همراه گردد و چنانچه کنترل دقیق قند خون در ۸ هفته اول حاملگی صورت گیرد ریسک عوارض کاهش می‌یابد.

خانم‌هایی که دیابت حاملگی داشته‌اند بایستی ۶ تا ۱۲ هفته بعد از زایمان با تست OGTTاستاندارد به همان روشی که برای بزرگسالان غیرحامله انجام می‌شود برای تشخیص ابتلا به دیابت تایپ دو آزمایش شوند. آزمایش هموگلوبین A1C در این برهه زمانی پیشنهاد نمی‌شود. چنانچه آزمایش OGTT روند نرمال داشت، آزمایش بالینی بایستی حداقل هر سه سال با آزمایش‌های مربوط به قند و هموگلوبین A1C تکرار شود.

هموگلوبین قندی:

از سنجش هموگلوبین قندی نه‌تنها برای تشخیص دیابت بلکه برای کنترل طولانی مدت دیابت استفاده می‌شود و افزایش آن یک فاکتور جدی خطر برای عوارض میکروواسکولار در دیابت است. قندی شدن یک فرآیند غیرآنزیمی اتصال قند به آمینواسید است. هموگلوبین A1C در نتیجه متراکم شدن قند گلوکز به والین در انتهای آمینی زنجیره بتا است. در این واکنش غیرآنزیمی نخست هموگلوبین A1C pre (Schiff base) ناپایدار (Aldimine) شکل می‌گیرد که در این فرایند یا قند از مولکول هموگلوبین جدا شده و یا اینکه در نتیجه آرایش Amadori به فرم پایدار کتوآمین یا هموگلوبین A1C درمی‌آید.

 فرایند شکل‌گیری هموگلوبین A_1C

هموگلوبین‌های A1a1 و  A1a2 که روی‌هم‌رفته به آن  Hb A1a2گفته می‌شود به ترتیب نتیجه پیوند فروکتوز و گلوکز ۶ فسفات به انتهای آمینی زنجیره بتا است. واکنش تشکیل هموگلوبین قندی غیرقابل برگشت و غلظت آن تحت اثر مستقیم طول عمر گلبول‌های قرمز و سطح گلوکز خون است و با سنجش آن می‌توان وضعیت گلوکز خون در ۸ تا ۱۲ هفته قبل را بررسی کرد.

 

فرایند اتصال مولکول‌های گلوکز به هموگلوبین برای تشکیل هموگلوبین قندی

غلظت A1c تحت اثر نوسانات روزبه‌روز و تحت اثر ورزش یا خوردن غذای اخیر قرار ندارد. میانگین سطح گلوکز پلاسمایی یک ماه پیش شکل‌دهنده ۵۰ درصد از سطح A1c است، درحالی‌که ۲۵ درصد  A1c مربوط به سطح قند ۶۰ تا 120 روز قبل است.

تفسیر سطح هموگلوبین A1c وابسته به طول عمر طبیعی گلبول قرمز است. کم‌خونی همولیتیک و خونریزی اخیر موجب کاهش سطح آن می‌شود. در حضور افزایش رتیکولوسیت‌ها سطح هموگلوبین A1c کاهش می‌یابد زیرا رتیکولوسیت‌ها گلبول‌های جوان بوده و پیوند گلوکز به رشته بتا تابع زمان است. سطح بالای هموگلوبین A1c در بیماران مبتلا به آنمی فقر آهن گزارش گردیده و تصحیح آنمی نیز توسط آهن، سطح واقعی آن را نشان می‌دهد. یکی دیگر از منابع خطا در برخی از روش‌های سنجش، حضور هموگلوبین کاربامیله (Carbamylated) است. تشکیل این نوع هموگلوبین در فرآیند اتصال ایزوسیانید که از اوره مشتق می‌شود به هموگلوبین است.

با توجه به این‌که نارسایی کلیه در بیماران دیابتی شایع است، ازاین‌رو ممکن است با افزایش سطح A1c Hb در نتیجه‌ی تداخل هموگلوبین کاربامیله گردد. گفتنی است که A1c Hb Pre یا Schiff base که مولکولی حد واسط در فرایند تشکیل A1c Hb است بسیار ناپایدار بوده و تحت اثر قند خوراکی قرار گرفته و هر پدیده که موجب افزایش قند به‌صورت حاد گردد سطح A1c Hb Pre را بالا می‌برد. در برخی از روش‌های سنجش از قبیل رزین تعویض یونی ممکن است این فرم ناپایدار همراه با A1c Hb سنجیده شود و افزایش سطح کاذب دهد. در حالت طبیعی حدود ۵ تا ۸ درصد از مولکول‌های هموگلوبین ایجاد A1c Hb Pre می‌کنند، درحالی‌که در دیابت به سطح ۸ تا ۳۰ درصد از مولکول‌های هموگلوبین می‌رسد.

با برداشت A1c Hb Pre می‌توان هموگلوبین A1cرا مورد سنجش دقیق قرار داد. با قرار دادن گلبول‌های قرمز شسته شده در محلول‌های غیرگلوکزی مانند سیلین، A1c Hb Pre به‌سرعت به قند و هموگلوبین تجزیه می‌شود. برخی از روش‌های boronate affinity موجب تخریب A1c Hb Pre و کاهش تداخل آن در سنجش A1c می‌شوند. سطح هموگلوبین A1c مساوی یا بیشتر از 6/5 درصد آستانه تشخیص دیابت و سطح 5/7 الی 6/4 درصد بیانگر خطر بالای ابتلا به دیابت است.

 

خطر مطلق رتینوپاتی و نفروپاتی نسبت مستقیم با سطح A1c دارد. روش‌های گوناگونی برای سنجش A1c وجود دارد؛ بیشتر روش‌ها هموگلوبین قندی را از سایر هموگلوبین‌های غیرقندی توسط تفاوت در شارژ جدا می‌کنند که برای مثال می‌توان به روش‌های تعویض یونی، کروماتوگرافی، نقطه تمرکز ایزو الکتریک و HPLC اشاره کرد. برخی روش‌ها بر مبنای تفاوت ساختاری از قبیل کروماتوگرافی میل ترکیبی یا سنجشی ایمونواسی و برخی برمبنای آنالیز شیمیایی از قبیل آنزیمی، فتومتری و اسپکتروفتومتری هستند. نکته مهم در روش سنجش تعویض یونی، کنترل درجه حرارت معرف‌ها و ستون برای دستیابی به نتایج تکرارپذیر است.

خروج بخش ناپایدار هموگلوبین  Pre A1cهمراه با هموگلوبین A1c از ستون، موجب افزایش کاذب A1c می‌گردد، مگر این‌که از قبل این جزء ناپایدار از نمونه خون برداشته شود. اورمی با ایجاد هموگلوبین کاربامیله و الکلیسم و مسمومیت با سرب و تجویز طولانی مدت آسپرین به نحوی شارژ هموگلوبین را تغییر می‌دهد که موجب می‌شود این نوع از هموگلوبین‌ها با هموگلوبین A1c از ستون خارج و با افزایش کاذب A1c همراه ‌شود. (TIETZ 2018).

هنگامی که سطح فوق‌العاده زیاد A1c مشاهده شود بایستی به واریان‌های هموگلوبین هم‌شارژ با  A1cفکر کرد. روش‌های HPLC دارای CV کمتر از ۳ درصد در سنجش هستند. روش‌های ایمونواسی بر مبنای سنتز آنتی‌بادی علیه پیوند کتوآمین و چند اسیدآمینه انتهای زنجیره بتا است. واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی با روش‌های مختلف لاتکس، پراکنش نور و آگلوتیناسیون مورد سنجش قرار می‌گیرد. در روش افینیتی کروماتوگرافی، هموگلوبین قندی با واکنش با اسید برونیک که در سطح جامد قرار گرفته ایجاد کمپلکس می‌کند.

برای تخمین میانگین سطح قند خون در ۸ تا ۱۲ هفته گذشته بر مبنای A1c از فرمول زیر استفاده می‌شود:

eAG: estimated average blood glucose

برای مثال چنانچه سطح A1c برابر ۷ درصد باشد:

eAG= 28.7*7 – 46.7=154 mg%

برای اندازه‌گیری سطح A1c نیاز به ناشتایی نیست و نمونه خون در EDTA جمع‌آوری می‌گردد. خون کامل در 4 درجه تا یک هفته قابل سنجش است؛ دمای بالاتر از 4 درجه در ارتباط با زمان مقدار هموگلوبین قندی HbA1a+b را افزایش داده ولی اثر کمتری بر روی A1C دارد. نگهداری نمونه در منفی ۲۰ درجه در روش تعویض یونی سفارش نمی‌شود. در بیشتر روش‌ها می‌توان نمونه خون را به مدت حداقل ۱۸ ماه در 70- درجه نگه داشت و گزارش شده تا ۱۴ سال پایدار است. نمونه‌های هپارینه بایستی در 2 روز آزمایش شود و برای برخی از روش‌های سنجش مثل الکتروفورز مناسب نیستند.

مروری بر تشخیص آزمایشگاهی HbA1c

HbA1c: مروری بر جنبه‌های آنالیتیکی و بالینی

دیابت حاملگی

https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/diabetes

برای دانلود فایل pdf  بر روی لینک زیر کلیک کنید