آشنایی با آزمایشهای انعقادی PTT & APTT
حسین عبادی فرد- مجتبی خشوعی پاریزی- علی خوش نژاد
دانشگاه علوم پزشکی قم
مقدمه
آزمایشهای انعقادی PTT & APTT . انعقاد خون به معنای منعقد و بسته شدن خون بعد از خونریزی بوده و در زبان انگلیسی به آن هموستاز Hemostats گویند. واکنش‌های انعقاد خون در زمان خونریزی در رگ‌های جراحت دیده و یا حتی در رگ‌های دست نخورده رخ می‌دهد. از جمله عواملی که در انعقاد خون نقش دارند می‌توان به پلاکت کافی همراه با عملکرد مناسب آنها، فاکتورهای انعقادی و واکنش‌های صحیح فیمابین فاکتورهای انعقادی نام برد. این عوامل دست به دست هم می‌دهند تا یک هموستاز نرمال را ایجاد کنند.
انعقاد خون در حقیقت یک سری واکنش‌های مرتبط و پشت سر هم است که در طی آن فاکتورهای انعقادی که بصورت پیش آنزیم‌های غیر فعال در جریان خون هستند به آنزیم‌های فعال تبدیل خواهند شد. هر فاکتور در ابتدا نقش یک substrate (سوبسترا) را برای آنزیم قبلی ایفا کرده و پس از فعال شدن، بصورت آنزیم جدیدی برای فعال نمودن آنزیم بعدی بر روی پیش آنزیم آن اثر می‌گذارد.
آزمایشات روتین جهت بررسی نحوه عملکرد فاکتورهای انعقادی شامل مواردی نظیر,TT ,aPTT ,PT اندازه‌گیری فیبرینوژن و … می‌باشند که در این مبحث دو آزمایش PT ,aPTT که از متداول‌ترین آزمایشات انعقاد خون می‌باشند مورد ارزیابی قرار می‌گیرند.
نمونه‌گیری
ضد انعقاد مورد استفاده جهت انجام تست‌های انعقادی سیترات سدیم با غلظت 3/2% می‌باشد. ضد انعقاد مورد نظر با نسبت یک به نه (1/9) با خون مخلوط می‌شود که اگر نسبت خون کاهش یابد به علت افزایش نسبت ضد انعقاد مدت زمان تست به طور کاذب افزایش می‌یابد. در مورد نمونه‌هایی که میزان هماتوکریت آنها بیشتر از 55% می‌باشد، نسبت ضد انعقاد باید تصحیح گردد زیرا در موارد بالای هماتوکریت سبب افزایش نسبت ضد انعقاد به پلاسما می‌شود و زمان تست بصورت کاذب افزایش می‌یابد.
دلیل استفاده از سیترات سدیم 3/2% به جای سیترات سدیم 3/8%:
- اسمولاریته 3/2% به اسمولاریته پلاسما نزدیکتر است.
- سیترات سدیم 3/2% دارای غلظت کمتری است و در هماتوکریت بالا کمتر نتیجه تست
را تغییر می‌دهد
- سازندگان کیتPT میزان ISI را بر اساس سیترات 3/2% ارائه می‌دهند.
- سیترات 3/8% باعث بالا رفتن INR می‌شود.
جهت تصحیح نسبت ضد انعقاد:
X= (100-PCV)/(595-PCV)
X= (100-55)/(595-55)=0.08
برای یک میلی‌لیتر خون باید 0/08 میلی‌لیتر سیترات و 0/92 میلی‌لیتر خون ریخته شود.
خون‌گیری باید از عروق سالم انجام گیرد. عروق آسیب دیده به علت آزاد سازی فاکتور بافتی سبب فعال سازی فرایند انعقاد می‌شود.
محل خون‌گیری بعد از تمیز کردن نباید مجدداً لمس شود.
سیستم خلأ:
در هنگام نمونه‌گیری اگر از سیستم خلأ استفاده شود باید لوله اول یا دوم مربوط به تست‌های انعقادی باشد. در صورتی که لوله دوم لوله تست‌های انعقادی باشد لوله اولیه باید فاقد ضد انعقاد باشد.
کلیه تست‌های انعقادی باید در حداقل زمان ممکن بعد از نمونه‌گیری انجام شود (فاکتورهای V و VIII رو به نزول می‌گذارند).
طریقه نگهداری:
نمونه‌های PT: در اولین فرصت ممکن پلاسما را از سلول‌ها جدا نمایید. پلاسما یا نمونة سانتریفوژ نشده ممکن است در دمای اتاق یا روی یخ تا 24 ساعت قابل نگهداری باشد در غیر این صورت به صورت فریز نگهداری شود.
نمونه‌های aPTT: هرچه سریعتر پلاسما را از سلولهای خونی جدا نمایید، خصوصاً در موارد پایش هپارین بهتر است ظرف مدت 1 ساعت این عمل صورت پذیرد، در غیراین صورت فاکتور 4 پلاکتی باعث خنثی سازی هپارین و کاهش کاذب PTT می‌گردد. پلاسما را می‌توان بمدت 4 ساعت در یخ نگهداری کرد و در صورت نگهداری طولانی مدت نمونه باید فریز گردد.
اگر تست‌ها در زمان معین آزمایش نگردد، می‌توان نمونه پلاسما را در دمای 20- درجه به مدت 2 هفته و در دمای 70- درجه به مدت 6 ماه نگهداری نمود.
علل رد نمونه:
نمونه‌های aPTT / PT:
- نمونه PT که بیشتر از 24 ساعت پس از نمونه گیری دریافت شده باشد.
- نمونه aPTT که بیشتر از 4 ساعت پس از جمع آوری به آزمایشگاه برسد.
- لوله‌ای که به اندازه مناسب پر نشده باشد.
- نمونه های حاوی لخته
- همولیز مشهود
- نمونه ایکتریک، لیپمیک جهت آزمایش با روش اپتیکال مناسب نیست.
مشکلات متداول ناشی از جمع‌آوری نمونه
|
Error |
Consequence |
Comment |
| مخلوط نکردن نمونه با ضد انعقاد بعد از نمونه‌گیری | PT/PTT افزایش کاذب | ایجاد لخته به علت مخلوط نکردن نمونه |
| مخلوط کردن بیش از حد | PT/PTT کاهش کاذب | همولیز و فعال شدن پلاکت‌ها |
| همولیز | PT/PTT کاهش کاذب | نمونه پذیرش نشود |
| نگهداری نامناسب (دمای و زمان نگهداری) | PT/PTT افزایش کاذب | مراجعه به قسمت نگهداری نمونه |
| سرد کردن نمونه | PT کاهش کاذب | سرد کردن تا دمای 4 درجه: فعال شدن فاکتور VII |
| بستن بیش از حد گارو | افزایش کاذب فاکتور VIII و VWF | سبب بسته شدن عروق می‌شود |
| بررسی بیش ازحد رگ قبل از نمونه‌گیری | PT/PTT کاهش کاذب | آزادسازی ترومبوپلاستین بافتی و فعال شدن انعقاد |
| نمونه لیپمیک | شاید تست انجام نگیرد | تأثیر بر روش‌های مبتنی بر نور در اندازه‌گیری فاکتورها |
لازم به ذکر است که یکی از رئوس مهم در بخش نمونه‌گیری استفاده از نوع، درصد و حجم مناسب ضد انعقاد در مرحله نمونه‌گیری می‌باشد. بر اساس پیشنهاد آزمایشگاه مرجع سلامت، ضد انعقاد استاندارد نمونه‌گیری تست‌های انعقادی سیترات سدیم با غلظت 3/2% می‌باشد. به همین جهت طرز تهیه و نگهداری آن به شرح ذیل ارائه می‌گردد:
- مقدار مشخص از پودر سیترات سدیم را بر اساس مولکول آب آن که شرح آن در جدول شماره 1 آمده در یک لیتر آب حل کرده و به حجم‌های 10 میلی‌لیتری تقسیم کنید.
- به مدت 15 دقیقه در 121 درجه اتوکلاو نمایید.
محلول فوق در دمای 4 درجه یخچال تا چند ماه پایدار است و در صورت مشاهده کپک یا کدورت دور ریخته شود.
جدول شماره یک
|
مقدار مصرف |
وزن مولکولی |
تری سدیم سیترات |
|
28 gr |
258.1 | Na3C6H5O7 |
|
30 gr |
276.1 | Na3C6H5O7,H2O |
|
32 gr |
294.1 |
Na3C6H5O7,2H2O |
| 39 gr | 357.16 |
Na3C6H5O7,5.5H2O |
| 49.6 gr | 456.1 |
Na3C6H5O7,11H2O |
(APPT، aPPT، PTT) زمان ترومبوپلاستین نسبی
Activated Partial Thromboplastin Time
خلاصه
aPTT (که به شکل PTT اختصار می‌شود) یک آزمایش غربالگری مسیر داخلی انعقاد بوده و تأثیر هپارین و سایر ضد انعقادهای مشابه را روی انعقاد خون بررسی میکند. ترومبوپلاستین نسبی، یعنی آن که معرف تنها حاوی فسفولیپید است و فاقد فاکتور بافتی (بر خلاف ترومبوپلاستین برای آزمایش PT) می‌باشد. PTT زمان لخته شدن را از هنگام فعال شدن فاکتور 12 تا تشکیل لخته فیبرین ارزیابی میکند. این آزمایش مسیرهای داخلی و مشترک انعقاد را بررسی میکند در حالی که PT تمامی مسیرهای خارجی و مشترک را ارزیابی میکند.
طولانی شدن PTT یا به علت نقائص فاکتوری (به خصوص فاکتور 8، 9، 11 و یا 12) است یا به علت وجود مهار کنندهها مثل لوپوس آنتیکواگولانتها و یا ضد انعقادهای درمانی مثل هپارین. این آزمایش بطور وسیع در غربالگری قبل از عمل جراحی و کنترل هپارین به کار میرود. از نقطه نظر آماری آزمایش aPTT قبل از عمل جراحی خیلی مهم‌تر از PT است، چرا که دارای حساسیت بیشتر برای هموفیلی A و B (کمبود فاکتورهای 8 و 9) می‌باشد.
محدوده مرجع
محدودة طبیعی aPTT بشدت تابع معرف و ابزار آزمایش است. همچنین مرحله قبل از آزمایش نیز دارای نقش مهمی می‌باشد. بنابراین هر آزمایشگاهی باید محدوده طبیعی خود را تعیین نماید. محدوده موجود در بروشور کیت تنها میتواند به عنوان یک دستورالعمل مورد استفاده قرار گیرد. بسیاری از آزمایشگاهها با هر معرف تازه، محدوده مرجع جدید را معین می‌نمایند. به طور کلی حد پایین نرمال آن 25-20 ثانیه و حد بالای نرمال آن 39-32 ثانیه است.
به طور طبیعی نوزادان در مقایسه با بزرگسالان PTT طولانیتری دارند. PTT در زمان تولد حدود 55 ثانیه است که تدریجاً تا سن 6 ماهگی به حد طبیعی بزرگسالان میرسد، با این حال، بدلیل تعادل بین فاکتورهای انعقادی و ضد انعقادهای طبیعی، در نوزادان و شیرخواران خونریزی دیده نمیشود.
مقادیر بحرانی
مقادیر بیشتر از 150-100 ثانیه
کاربرد
غربالگری تمامیت مسیر داخلی انعقاد (فاکتورهای 8، 9، 11 و 12) و با وسعت کمتر مسیر مشترک (فیبرینوژن و فاکتورهای 2، 5 و 10). PTT ممکن است آنتیکواگولانتهای لوپوس را ردیابی کند ولی به عنوان غربالگری نباید استفاده شود چرا که PTT بسته به معرفها ممکن است طولانی بشود یا نشود. همچنین از PTT برای پایش درمان با هپارین، هیرودین یا آرگاتروبان استفاده می‌شود.
محدودیت‌ها
در موارد کمبود یک فاکتور به تنهایی، PTT تنها زمانی طولانیتر از حد طبیعی می‌شود که فاکتور مورد نظر به حدود 45-15% میزان طبیعی کاهش یابد. PTT برای بررسی کمبود فاکتورهای مسیر داخلی حساستر از بررسی کمبود فاکتورهای مسیر مشترک است. در مواردی که کمبود چندین فاکتور به طور همزمان وجود دارد، PTT در مواردی که شدت کمبود فاکتورها خیلی شدید هم نیست طولانی می‌گردد. فاکتور 8 جزء پروتئینهای فاز حاد است و افزایش آن باعث کاهش PTT می‌گردد. کمبود فاکتور 7 و 13 تأثیری در زمان PTT ندارد. برای بررسی کمبود فاکتور 7 از تست PT و برای بررسی کمبود فاکتور 13 باید از تست حلالیت لخته در اوره 5 مولار استفاده نمود.
در موارد درمان با دوز بالای هپارین مانند جراحی بای‌پس قلبی در آزمایش PTT لخته تشکیل نمیشود چرا که این زمان بیشتر از 150 ثانیه بوده و بنابراین مفید نیست. در این موارد باید از زمان فعال شده تشکیل لخته (ACT) استفاده نمود. یک محدودیت مهم aPTT که معمولاً مورد توجه قرار نمیگیرد، کاهش پایداری نمونه به خصوص در بیماران مصرف کننده هپارین بوده که ممکن است در آنها نتایج حاصل به مرور زمان دچار تغییرات شدید باشد.
تداخلات دارویی
داروهایی که می‌توانند PTT را طولانی نمایند عبارتند از هپارین، هیرودین، آرگاتروبان، آنتی‌هیستامین‌ها، اسیدآسکوربیک، کلرپرومازین و سالیسیلات‌ها.
متدولوژی
معرف PTT (فسفولیپید همراه با یک فعال کننده مسیر داخلی مثل سیلیکا، celite، کائولن، ellagic acid) و کلسیم به پلاسمای بیمار اضافه شده و زمان تا تشکیل شدن لخته بر حسب ثانیه اندازه گیری می‌شود. در کاوش PTT، فسفولیپید به نام ترومبوپلاستین نسبی خوانده می‌شود چرا که فاکتور بافتی وجود ندارد. فاکتور بافتی همراه با فسفولیپید در معرفهای ترومبوپلاستینی (کامل) که برای PT استفاده میشوند، وجود دارد. فاکتور بافتی مسیر خارجی انعقاد را فعال میکند که در کاوشهای PTT اندازه گیری نمیشود. فسفولیپید و کلسیم کوفاکتورهای مورد نیاز در آبشار انعقادی هستند. سیترات موجود در لوله درب آبی از طریق chelating کلسیم، لخته شدن را مهار میکند. هنگامی که تست PTT آماده انجام می‌شود، کلسیم بیش از حد اضافه می‌شود تا بر سیترات غلبه نماید.
علل طولانی شدن aPTT:
- علل ارثی:
* کمبود فاکتورهای 8، 9، 11، 12، پره‌کالیکرئین یا کینینوژن با وزن مولکولی بالا (HMWK) که در این موارد PT طبیعی است.
* کمبود فیبرینوژن، فاکتور 2، 5 و یا 10 (در این موارد PT غیرطبیعی است).
- علل اکتسابی:
* ضد انعقادهای لوپوسی (PT معمولاً طبیعی است).
* مصرف هپارین (PT کمتر از PTT متأثر می‌شود و ممکن است طبیعی باشد).
* هیرودین یا آرگاتروبان (معمولاً PT هم طولانی می‌گردد).
* اختلال عملکردکبدی (PT بیشتر و زودتر از PTT طولانی می‌گردد)
* کمبود ویتامین PT) K بیشتر و زودتر از PTT طولانی می‌گردد).
* مصرف وارفارین (PT بیشتر و زودتر از PTT طولانی می‌گردد).
DIC یا انعقاد منتشر داخل عروقی (PT بیشتر و زودتر از PTT طولانی می‌گردد).
مهارکنندههای فاکتورهای انعقادی (PT معمولاً طبیعی است مگر در موارد نادر که مهار کنندهای بر ضد فیبرینوژن، فاکتور 2، 5 یا 10 وجود دارد).
زمان پروترومبین Prothrombin Time (PT)
خلاصه
PT زمان لخته شدن را از فعال شدن فاکتور 7 تا تشکیل لخته فیبرین اندازه‌گیری میکند. این تست تمامی مسیرهای خارجی و مشترک انعقاد را اندازه گیری میکند در حالیکه PTT فعال شده (aPTT) تمامیــــت مسیرهای داخلی و مشترک انعقاد را اندازه گیری میکند. شایع‌ترین علل طولانی شدن PT فقدان فیبرینوژن یا فاکتورهای 2، 5، 7 یا 10 می‌باشند. طولانی شدن PT به علت وجود یک مهار کننده همچون ضد انعقادهای درمانی از جمله هپارین، هیرودین یا آرگاتروبان کمتر شایع است.
محدوده مرجع
* lower limit تقریبی طبیعی: 12-10 ثانیه
* upper limit تقریبی طبیعی: 14-12 ثانیه
نوزادان در مقایسه با بزرگسالان به طور طبیعی PT طولانی تری دارند و تا 16 ثانیه هنگام تولد محتمل است ولی تا 6 ماهگی به محدودة بزرگسالان میرسند.
مقادیر بحرانی
بیشتر از 30 ثانیه بر اساس College of American Pathologists 1999 Survey CG2-C
کاربرد
- غربالگری تمامیت مسیر انعقادی خارجی (فاکتور 7) و مشترک (فیبرینوژن، فاکتور 2، 5 و 10)
- مونیتورینگ درمان با ضد انعقاد وارفارین
محدودیت‌ها
هنگامی که فقدان یک فاکتور منفرد وجود داشته باشد این فقدان باید زیر 45-15% باشد تا سبب طولانی شدن PT شود، ولی هنگامی که فقدان چندین فاکتور وجود دارد با شدت فقدان کمتر هم PT طولانی می‌شود. فقدان فاکتورهای 8، 9، 11، 12، پره‌کالیکرئین یا کینینوژن با وزن مولکولی بالا (HMWK)، تأثیری روی PT ندارد ولی PTT را متأثر میکنند. فقدان فاکتور 13 نه تأثیری روی PT دارد و نه PTT. هپارین بسته به نوع معرف میتواند PT را طولانی کند. بعضی معرفها حاوی یک خنثی کنندة هپارین هستند تا تداخل هپارین را کاهش داده یا حذف نمایند.
آنتی‌کواگولانت های لوپوس، PT پایه را بطور ناشایع طولانی میکنند. اکثر معرفهای PT حاوی فسفولیپید زیادی هستند بطوری که آنتی‌کواگولانت های لوپوس که آنتی بادیهای آنتی فسفولیپید هستند، PT را طولانی نخواهند کرد. مصرف الکل میتواند PT را طولانی کند. یک رژیم غنی از چربی ممکن است مقادیر PT را کاهش دهد.
تداخلات دارویی
داروهایی که ممکن است موجب طولانی شدن PT شوند عبارتند از: آلوپورینول، آمینوسالیسیلیک اسید، باربیتوراتها، آنتیبیوتیکهای بتالاکتام، کلرال هیدرات، سفالوتینها، کلرامفنیکل، کلرپرومازین، کلستیرامین، سایمتدین، کلوفیبرات، اتیل الکل، گلوکاگون، هپارین، متیل دوپا، نئومایسین، ضدانعقادهای خوراکی، پروپیل تیواوراسیل، کینیدین، کینین، سالیسیلات‌ها و سولفونامیدها. داروهایی که ممکن است PT را کوتاه کنند عبارتند از: استروئیدهای آنابولیک، باربیتوراتها، کلرال هیدرات، دیژیتالها، دیفن هیدرامین، استروژن‌ها، گریزوفولوین، OCP و ویتامین K.
متدولوژی
معرف PT، ترومبوپلاستین نامیده می‌شود (فسفولیپید همراه با فاکتور بافتی و کلسیم). این معرف به پلاسمای بیمار افزوده شده و زمان تشکیل لخته به ثانیه اندازه گیری می‌شود. فاکتور بافتی مسیر خارجی انعقاد را فعال میکند. فسفولیپید و کلسیم هم کوفاکتورهای مورد نیاز در آبشار انعقادی هستند. سیترات موجود در لوله درب آبی با chelating کلسیم مانع لخته شدن نمونه می‌شود. معرفهای PT دارای کلسیم بالایی هستند تا بر سیترات غلبه کنند.
علل طولانی شدن PT:
■ ارثی:
– فقدان فاکتور 7 (PTT طبیعی است)
– فقدان فیبرینوژن یا فاکتورهای 2، 5 یا 10 (PTT هم ممکن است طولانی شود)
■ اکتسابی:
* اختلال عملکرد کبد (PT زودتر متأثر می‌شود تا PTT)
* فقدان ویتامینK) PT زودتر متأثر می‌شود تا PTT)
* وارفارین (PT زودتر متأثر می‌شود تا PTT)
*DIC PT) زودتر متأثر می‌شود تا PTT)
* آنتی‌کواگولانت های لوپوس (PTT ممکن است طولانی شود یا نشود؛ PT ندرتاً طولانی می‌شود)
* هپارین (PT ممکن است طبیعی باشد، PT کمتر از PTT متأثر می‌شود)
* هیرودین و آرگاتروبان (PTT هم طولانی می‌شود)
* مهار کننده های اختصاصی فاکتور (PTT هم طولانی می‌شود به جز مورد نادری که مهارکنندة فاکتور 7 وجود دارد)
وارفارین توسط International Normalized Ratio) INR) پایش می‌شود. هدف معمول درمانی این است که INR بین 3-2 باشد. INR از روی PT محاسبه می‌شود و در نظر دارد تا مقایسهای معتبر از نتایج، بدون توجه به نوع معرف مصرف شده در PT بین آزمایشگاههای مختلف به دست آید.
منابع:
- Mehbod Principles and clinical interpretation of practical hematology. Tehran :Eshragh; 2007.
Healths reference lab
Reference lab of Medical University of Kashan– Current Coagulation Tests – 2013
هموستاز ثانویه و آبشار انعقادی(در تب جدید مرورگر باز می شود )
کنترل کیفی تست‌های معمول انعقادی(در تب جدید مرورگر باز می شود )
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام