مروری بر الایزا (2)

(خطایابی و رفع ایرادات احتمالی در کار با سیستم الایزا)

سید آرمان مهدوی¹

دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی پزشکی، مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا… (عج)، تهران، ایران (livesnuff@gmail.com)

Elisa خطایابی. تکنیک الایزا به‌عنوان یکی از پیشروترین و اقتصادی‌ترین روش‌های تشخیصی در آزمایشگاه تشخیص طبی است که با کارایی مؤثر در طی زمان همواره به‌عنوان روشی قابل‌اتکا و باارزش موردتوجه قرار گرفته است. در بخش گذشته مروری بر اساس و ساختار اولیه انجام تست برای دانشجویان و علاقمندان این مبحث داشتیم و در ادامه با مبحث کنترل کیفی، صحت و دقت انجام فرآیند جهت بازآموزی و تکرار دانسته‌های کاربران محترم این تکنیک در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مطالبی را جمع‌آوری نمودیم. در این مسیر از منابع مختلف و فایل‌های انتشاریافته توسط مراجع تأئید صلاحیت کیت‌های تشخیص طبی نظیر آزمایشگاه رفرانس و جدیدترین یافته‌های تیم‌های تحقیقاتی بخش کنترل کیفی و تحقیق توسعه شرکت‌های سازنده کیت‌های تشخیصی استفاده کرده‌ایم.

با نگاه به آینده و شرایط موجود کشور و تحریم‌های ظالمانه، امید است شرکت‌های سازنده کیت با بومی‌سازی هرچه بیشتر این تکنیک باارزش تشخیصی به قطع وابستگی خود به خارج از کشور اقدام نمایند و با تلاش روزافزون و کمک محققین و پژوهشگران برای پیشرفته‌تر شدن این تکنیک قدم بردارند تا کمبود کیت‌های وارداتی و روش‌هایی نظیر کمیلومینه‌سانس احساس نشود.

کنترل اجزای فرآیند واکنش الایزا

استاندارد:

در الایزا معمولاً از چندین استاندارد استفاده می‌شود و این امر از آنجا ناشی می‌شود که رفتار برهم‌کنش شیمیایی آنتی‌بادی –آنتی‌ژن اگرچه مانند دیگر واکنش‌های شیمیایی وابسته به غلظت است، اما دقیقاً همانند یک واکنش شیمیایی ساده از یک معادله خطی تبعیت نمی‌کند که بتوان با داشتن دو استاندارد به معادله آن دست یافت. درواقع رفتار برهم‌کنش اجزای الایزا در یک معادله درجه 2 و بالاتر مطابقت می‌کند. در چنین حالتی هرچه تعداد نقاط بیشتر باشد شکل درست‌تری از منحنی استاندارد خواهیم داشت. در الایزا عمدتاً از ۶ استاندارد استفاده می‌گردد تا بتوان مقادیر پایین، نرمال و بالا را مورد سنجش قرار داد.

ماتریکسی که در آن استاندارد ساخته می‌شود می‌بایست تا حد امکان به سرم انسان شبیه باشد. در بعضی موارد که ساخت ماتریکس استاندارد به دلایل مختلف ازجمله عدم امکان حذف آنالیت مورد جستجو در سرم، وجود مداخله‌گرهای شناخته‌شده و شناخته‌نشده، پرزحمت و پرهزینه بودن با مشکل مواجه می‌گردد، استانداردها در ماتریکس‌های مصنوعی ساخته می‌شوند و از آنجایی که به ماتریکس سرم انسانی شباهت کامل ندارند می‌توانند بر میزان یکنواختی، حلالیت، فعالیت آنتی‌ژنیک، ساختار کامل فضایی بیومولکول مورد مطالعه اثر بگذارند که می‌بایست در انتخاب یک ماتریکس مناسب برای استانداردها این موارد مدنظر باشد.

معمولاً جهت ساخت استاندارد از بیومولکول‌های بسیار خالص آن ‌که به‌صورت تجاری در دسترس هستند، استفاده می‌گردد. اگرچه برای بعضی از بیومولکول‌ها استانداردهای بین‌المللی وجود دارد، اما به میزان کافی در دسترس نیستند و به میزان بسیار محدود تولید می‌شوند و در مورد بعضی بیومولکول‌ها، استاندارد بین‌المللی وجود ندارد.

کونژوگه:

کونژوگه‌ها در متد الایزا می‌توانند به اشکال عمده کونژوگه هاپتن به آنزیم و کونژوگه آنتی‌بادی به آنزیم و یا کونژوگه ویدین به آنزیم باشند .آنزیمی که در متد الایزا کاربـرد زیادی دارد (HRP) Horse Radish Peroxidase است، اما از آنزیم‌های دیگری مانند آلکالین فسفاتاز هم استفاده می‌شود. از آنجا که در کونژوگه‌ها از آنزیم استفاده شده است و آنزیم‌ها بیومولکول‌های ناپایداری چه ازنظر ساختاری و چه ازنظر فعالیت آنزیماتیک در برابر عواملی مانند دما، آلودگی و مهارکننده‌ها هستند، لذا آن‌ها در برابر این عوامل حساس هستند و بنابراین پایدار نگه داشتن کونژوگه‌ها مقوله مهمی است.

کونژوگه‌ها را معمولاً در محلول‌های پایدارکننده که دارای مواد نگهدارنده نیز هستند، تهیـــــه می‌کنند. میزان پایداری کونژوگه‌ها به نوع این محلول‌های پایدارکننده، غلظت این محلول‌ها و غلظت کونژوگه بستگی دارد، البته دمای نگهداری محلولی که کونژوگه در آن تهیه شده است را نباید فراموش کرد. از آنجایی که هرچه غلظت کونژوگه در محلول پایدارکننده بیشتر باشد پایداری آن نیز بیشتر است، اکثر شرکت‌های سازنده سعی بر این دارند که کونژوگه‌ها را به‌صورت غلیظ 10x و یا 20x عرضه کنند.

سوبسترا و کروموژن:

سوبسترا ماده شیمیایی است که آنزیم بر روی آن به‌صورت اختصاصی تأثیر می‌گذارد، سپس با ردیابی رنگ یا ترکیبات ثانویه ایجادشده از این واکنش، سنجش آنالیت موردنظر (آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن) میسر می‌گردد. لازم به ذکر است که این پروسه در مورد آنزیم‌های مختلف متفاوت است؛ به‌طور مثال سوبسترای آنزیم آلکالن فسفاتاز به‌عنوان کروموژن (ماده رنگ‌زا) نیز عمل می‌کند، در صورتی که در مورد آنزیم Horse Radish Peroxidase HPRسوبسترای آب اکسیژنه، به‌عنوان معرف رنگ‌زا عمل نمی‌کند و باید از ترکیب دیگری مانندTMB ، ABTS و OPD به‌عنوان معرف رنگ‌زا استفاده کرد.

محلول شستشو:

محلولی متشکل از بافر PBS یا TRIS به انضمام درصد مشخصی از یک دترجنت مانند Tween جهت شستشو بین مراحل الایزا است که باعث جداسازی پیوندهای غیراختصاصی متصل‌شده به چاهک می‌شود.

نکات مهم در مراحل شستشوی چاهک‌ها با بافر:

محلول‌های شستشو عمدتاً حاوی دترجنت هستند که منجر به تولید حباب یا کف در حین ساخت محلول کار بافر می‌گردد، لذا بایستی مراقب بود در زمان شستشو این حباب یا کف‌ها وارد چاهک‌ها نشوند زیرا منجر به کاهش سطح تماس بافر با چاهک‌ها و کاهش اثر شستشو می‌گردند. اندازه‌گیری PH بافر شستشوی نهایی)محلول کاری بافر ( از کارهای اصولی است که بهتر است انجام گردد؛ به‌عنوان مثال در بافر فسفات PH ایده‌آل 7/2 است و شرایط اسیدی یا قلیایی منجر به ظهور جذب نوری کاذب بالا یا پائین می‌گردد. جهت این کار تحت کنترل بودن PH آب مقطر موردنیاز جهت تهیه بافر الزامی است.

تاریخ تهیه بافر روی ظرف بافر قید شود و محلول بافر تازه و به میزان نیاز تهیه گردد.

در شستشوهای اتوماتیک بایستی سرعت ریختن بافر و آسپیراسیون بافر به شکلی تنظیم گردد تا زمان خیس خوردن پلیت به‌طور کامل رعایت گردد.

تهیه بافر غلیظ یا رقیق خارج از رنج رقت بروشور منجر به کاهش یا افزایش قدرت بافر و نهایتاً سیگنال مثبت یا منفی کاذب در روش می‌گردد، به‌عنوان مثال بافری که بیش از حد رقیق شده باشد قادر به جداسازی اتصالات غیراختصاصی از محیط چاهک نبوده و سیگنال مثبت کاذب حاصل می‌نماید و برای بافر غلیظ عکس این موضوع صدق می‌نماید.

محلول متوقف‌کننده:

بسته به اینکه جهت بررسی میزان فعالیت آنزیم از چه متدی استفاده شود، محلول متوقف‌کننده ممکن است موردنیاز باشد یا نباشد؛ به عبارتی دیگر اگر شیوه بررسی فعالیت آنزیم کینتیک است به محلول متوقف‌کننده نیازی نیست و اگر end point است، باید استفاده گردد. محلول‌های اسیدی مانند HCL و H2SO4 برای توقف فعالیت آنزیم HRP و محلول NAOH برای توقف فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز مورد استفاده قرار می‌گیرد.

خطایابی و رفع ایرادات احتمالی در کار با سیستم الایزا

همانطور که در بخش گذشته مطرح گردید در هنگام کار با سیستم الایزا خطاها و ایراداتی رخ می‌دهد که می‌توانند نتایج تست‌ها را مخدوش و تفسیر نتایج را مشکل کنند، به همین دلیل در ادامه، خطایابی و رفع ایرادات احتمالی که ممکن است یک تکنسین در کار با سیستم الایزا با آن‌ها مواجه گردد در قالب جداول زیر ارائه شده است؛ مثلاً هنگامی که یک تکنسین مواجه با خطای ایجاد بک‌گراند در زمینه می‌گردد باید کارهای مختلفی انجام دهد که در جدول 1 به آن‌ها اشاره شده است.

جدول 1: مقادیر بالای کنترل منفی و یا ایجاد بک‌گراند در زمينه

در هنگام خوانش چاهک کنترل منفی یا بلانک از محدوده Cut OFF تعیین شده توسط سازنده کیت، جذب نوری بالاتری پیدا می‌کنند

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

آلوده شدن چاهک‌های کنترل منفی با کنترل مثبت	در هنگام شستشو از سرریز شدن محلول شستشو از چاهک‌های پلیت به یکدیگر
	اجتناب کنید.

آلوده شدن ویال کنترل منفی	همیشه ابتدا کنترل منفی را در چاهک‌ها ریخته و بعد کنترل مثبت را بریزید.
	برای هر نمونه‌برداری از نوک سمپلر جدید استفاده کنید.
	توجه داشته باشید که نوک سمپلر به اندازه کافی بلند باشد تا نمونه‌ها با انتهای لوله
	سمپلر تماس پیدا نکند.
	تست را با مواد کیت تازه تکرار کنید.

شستشوی ناکافی و یا آلوده شدن	در هنگام شستشو مطمئن شوید که تمامی باقیمانده‌های آنزیم کونژوگه از چاهک‌ها
کنترل منفی با آنزیم کونژوگه	خارج شده‌اند.
	تمامی نمونه‌ها و مواد را در مرکز کف چاهک‌ها بریزید و از تماس نوک سمپلر با
	دیواره و لبه چاهک‌ها بپرهیزید.

چاهک معرف کنترل مثبت باید جذب نوری به‌مراتب بالاتری از کنترل منفی داشته باشد، اما به دلیل بعضی خطاها جذب نوری چاهک کنترل مثبت کاهش پیدا می‌کند، لذا بحث کاهش سطح خوانش و مقدار واقعی آنالیت‌ها بایستی مورد بررسی قرار بگیرد که در جدول 2 به آن‌ها اشاره شده است.

جدول 2: مقادیر پائين کنترل مثبت یا جذب نوری پائين

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

در زمان تست مواد داخل کیت به دمای اتاق رسانده	مطمئن شوید که تمامی اجزای کیت به دمای اتاق رسیده‌اند.
نشده‌اند.

مقدار نمونه کمتر از مقدار لازم است.	مطمئن شوید که نوک سمپلرها خوب و محکم فیت شده‌اند. لوله سمپلرها را چک
	کنید تا گرفته نشده باشند. کالیبراسیون سمپلرها را چک کنید و در صورت عدم
	کالیبره بودن آنها باید کالیبره شوند.

محلول کروموژن – سوبسترا به‌درستی تهیه نشده است.	محلول کروموژن – سوبسترا را درست قبل از استفاده آماده کنید.
	طرز تهیه محلول کروموژن – سوبسترا را دربروشور مطالعه کرده و به آن عمل کنید.

آلودگی سوبسترا به اسید و یا آلودگی کنترل مثبت به باکتری	تست را با یک کیت جدید تکرار کنید.


زمان انکوباسیون خیلی کوتاه است	دقت در زمان انکوباسیون

ورود رطوبت به کیسه حاوی پلیت	عملکرد صحیح نم‌گیر داخل کیسه پلیت را بررسی کنید.
	استریپ‌هایی که مصرف نمی‌شوند را درکیسه قرارداده و در آن را محکم ببندید.

دمای نامناسب در مدت انکوباسیون	بررسی دمای انکوباتور یا اتاق
دمای اتاق برای انکوباسیون سوبسترا خیلی پائین است.	بررسی دمای اتاق

خشک شدن چاهک‌ها در هنگام انجام تست	انجام تمام مراحل تست بدون وقفه

افزودن ناکافی آنزیم کونژوگه غلیظ به محلول رقیق	کونژوگه را دوباره با صحت کامل تهیه کنید.
‌‌کننده برای ایجاد محلول آماده کار

در کار با سیستم الایزا بعضی از چاهک ها مانند بلانک ؛ کنترل منفی انتظار داریم جذب نوری پایین تر از cut off تعیین شده داشته باشند اما در بعضی موارد معمولا به علت خطای شستشو و سر ریز شدن محتویات چاهک ها به درون هم موجب اختلال و یکسان شدن جذب نوری تمامی پلیت ها می شود (جدول3)

جدول 3: ظهور رنگ در تمام چاهک‌های پليت

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

استفاده از حجم کم محلول شستشو و واکنش	پر کردن چاهک‌ها هنگام شستشو
سوبسترا با ذرات باقیمانده آنزیم کونژوگه

محلول سوبسترا با کونژوگه آلوده است.	بررسی لوله سمپلر از نظر وجود ذرات مایع یا خشک‌شده
	نوک سمپلر به حد کافی بلند باشد که مایع با انتهای لوله سمپلر تماس پیدا نکند.

ظرف محتوی سوبسترا آلوده و کثیف است.	ظروف را قبل از استفاده چک کنید.

در خلال انکوباسیون سوبسترا پلیت در مقابل نور قرار گرفته	پس از ریختن محلول سوبسترا پلیت را در تاریکی قرار دهید.

واکنش‌های مثبت کاذب

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

شستشوی ناکافی یا مسدود شدن کانال‌های واشر الایزا	اطمینان از صحت عملکرد واشر الایزا
	انجام کالیبراسیون و تعمیرات روتین

وجود گلبول‌های قرمز در نمونه	نمونه را قبل از استفاده سانتریفوژ نمائید.

تبخیر نمونه آنزیم کونژوگه در هنگام انکوباسیون	پلیت را با برچسب مخصوص بپوشانید.


دمای انکوباسیون بالا	دمای اتاق یا انکوباتور را چک کرده و در میزان مورد نظر کالیبره کنید.

آلوده شدن چاهک‌ها با آنزیم کونژوگه	آنزیم کونژوگه را با دقت در مرکز کف چاهک‌ها اضافه نموده و از تماس نوک سمپلر
	با دیواره‌ها و لبه‌های چاهک‌ها بپرهیزید.

آلوده شدن سوبسترا به آنزیم کونژوگه	بازرسی لوله سمپلر ازنظر عدم وجود ذرات مایع یا خشک‌شده خارجی و استفاده از
	نوک سمپلر بلند

غلظت بالای آنزیم کونژوگه در	از روی دستور کار کیت یک محلول کونژوگه آماده کار تازه بسازید.
محلول رقیق‌کننده

یکی از ساده‌ترین راه‌ها جهت اطمینان از صحت انجام واکنش قرار دادن چاهک‌ها به‌صورت دوپلیکیت یا دوبرابرسازی نمونه‌های یکسان است. در این روش برای مثال چاهک a حاوی نمونه با مقدار مشخص در همان ردیف کاری تکرار می‌شود و جذب نوری آن‌ها در انتها با هم مقایسه می‌شود (جدول 4).

جدول 4: قدرت تکرارپذیری ضعيف یا دوپليکيت ناهمخوان

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

اشتباه در تقسیم مواد و نمونه‌ها	دستگاه دیسپنسور را چک نمائید.

وجود حباب در چاهک‌ها	برای از بین بردن حباب‌ها از سوزن استفاده کنید) برای هر چاهک از یک سوزن(

اثر انگشت بر روی پلیت	با محلول شستشو اثر انگشت را پاک کرده و سپس پلیت را خشک کنید.

تکنیک شستشوی ضعیف یا غلط	هر چاهک را کامل با محلول شستشو پر کنید؛ محلول شستشو سرریز نشود، پس از
	خالی کردن محلول شستشو، پلیت را خوب خشک کنید.

در تست عوامل عفونی پنل الایزا حساسیت از مهم‌ترین شاخصه‌های کاربردی در تشخیص وجود آنالیت موردنظر است زیرا در این آزمایش‌ها گاهی مقدار آنالیت مورد انتظار در نمونه بسیار پایین است و حساسیت این روش موردتوجه قرار می‌گیرد. در حین انجام کار خطاهایی رخ می‌دهد که باعث کاهش حساسیت می‌گردد که کارشناسان بایستی دقت نمایند (جدول 5).

جدول 5: حساسيت ضعيف

دلایل احتمالی	تصحيح ایراد

در تهیه آنزیم کونژوگه آماده کار از مقدار مناسب و	تهیه محلول آماده کار تازه با استفاده از بروشور
کافی آنزیم کونژوگه غلیظ در محلول رقیق‌کننده آن
استفاده نشده

اشتباه در نمونه آنزیم کونژوگه آماده کار	کالیبراسیون سمپلرها را چک کنید

زمان انکوباسیون ناکافی	تکرار تست با زمان انکوباسیون مناسب
دما مناسب نیست یا پلیت بعد از انکوباسیون اول	انجام تست طبق بروشور و بدون وقفه‌های اضافی
مدت زیادی باقی مانده تا عملیات بعدی روی آن صورت گیرد.

جدول 6: بالا بودن جذب نوری کاليبراتورها) استانداردها (

دلایل احتمالی	تصحيح ایراد

پلیت بعد از انکوباسیون اول مدت زیادی در دمای	تست را طبق دستور بروشور و بدون وقفه‌های اضافی انجام دهید.
بالاتر از آنچه سازنده کیت سفارش کرده باقی مانده تا
عملیات بعد روی آن صورت گیرد.

مقادیر کافی از نمونه‌ها در چاهک‌ها ریخته نشده	کالیبراسیون سمپلرها را بررسی کنید.

رسم نمودار غلظت/ جذب نوری در سیستم الایزا برای کشف مقدار آنالیت موردنظر بر پایه جذب نوری استانداردها انجام می‌گیرد. گاهی جذب نوری نمونه مورد بررسی آن‌قدر بالاست که پیش‌بینی مقدار آن با توجه به جذب نوری استانداردها امکان‌پذیر نیست. این مشکل می‌تواند به دلایل مختلفی صورت گیرد که در جداول زیر به همراه تصحیح این ایرادات آورده شده است.

جدول 7: جذب نوری نمونه خارج از رنج استانداردها باشد

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

غلظت در نمونه بسیار بالاست.	نمونه را با کالیبراتور صفر رقیق کرده و تست را تکرار کنید.

جدول 8: کليه جذب‌های نوری پائين است


دلایل احتمالی خطا		تصحيح ایراد

دمای اتاق زیر 20 درجه سلسیوس است.		حفظ دمای آزمایشگاه بین 20 تا 25 درجه

جدول 9: کنترل از رنج خارج است

دلایل احتمالی خطا

تصحيح ایراد

آلودگی کنترل

تکرار تست با کنترل جدید

آلودگی کالیبراتورها

تکرار تست با کالیبراتورهای جدید

جدول 10: کروموژن آبی رنگ شده است

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

آلودگی کروموژن	استفاده از کروموژن تازه

جدول 11: بعد از ترکيب کروموژن و سوبسترا محلول آبی رنگ می‌شود

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

آلودگی کروموژن و سوبسترا	استفاده از کروموژن و سوبسترای تازه

جدول 12: زرد رنگ شدن محلول متوقف‌کننده واکنش (Stop Solution)

تصحيح ایراد	دلایل احتمالی خطا
استفاده از محلول متوقف‌کننده تازه	آلودگی محلول متوقف‌کننده

جدول 13: ذرات سياه در چاهک‌ها قبل از خواندن جذب نوری

دلایل احتمالی خطا	تصحيح ایراد

طولانی شدن زمان واکنش آنزیم کونژوگه و سوبسترا	رعایت زمان توصیه‌شده واکنش آنزیم کونژوگه و سوبسترا

منابع:

1. Klein A, Barausse E, Sesana A, Petiteau A, Berti E, Babak S, et al. Science with the space-based interferometer eLISA: Supermassive black hole binaries. Physical Review D. 2016;93(2):024003.

2. Jaedicke KM, Taylor JJ, Preshaw PM. Validation and quality control of ELISAs for the use with human saliva samples. Journal of immunological methods. 2012;377(1-2):62-5.

3. Shah K, Maghsoudlou P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British journal of hospital medicine (London, England: 2005). 2016;77(7):C98-101.

4. Tighe PJ, Ryder RR, Todd I, Fairclough LC. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics Clinical applications. 2015;9(3-4):406-22.

5. Henry SM, Sutlief E, Salas-Solano O, Valliere-Douglass J. ELISA reagent coverage evaluation by affinity purification tandem mass spectrometry. mAbs. 2017;9(7):1065-75.

6. Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 2015;72:4-15.

7. Persat F, Lachaud L, Raberin H, Poggi B, Roques C, Gangneux JP. [Internal and external quality controls for Elisa techniques of aspergillosis serodiagnosis: proposals of the group “serodiagnostic fongique” of the Societe francaise de mycologie medicale]. Journal de mycologie medicale. 2013;23(1):15-20.

8. Kanev AN, Vorob’eva MS, Shalunova NV, Karpovich LG, Netesov SV, Maksiutov AZ, et al. [Development of sera reference panels for quality control of ELISA diagnostic kits in Russia]. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk. 1998(3):47-51.

9. Leeflang MM, Ang CW, Berkhout J, Bijlmer HA, Van Bortel W, Brandenburg AH, et al. The diagnostic accuracy of serological tests for Lyme borreliosis in Europe: a systematic review and meta-analysis. BMC infectious diseases. 2016;16:140.

10. Goens G, Rusu D, Bultot L, Goval JJ, Magdalena J. Characterization and quality control of antibodies used in ChIP assays. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2009;567:27-43.

11. Sue MJ, Yeap SK, Omar AR, Tan SW. Application of PCR-ELISA in molecular diagnosis. BioMed research international. 2014;2014:653014.

نکات عملی در تستهای الایزا

میکروپلیت واشر الایزا

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK555922/

برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید

برای دانلود باید وارد سایت شوید.

خواندن تمام مطلب