پلی‌مورفیسم طولی قطعات تکثیرشده (AFLP)
دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا… (عج))
زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)
دکتر رضا میرنژاد (استاد دانشگاه)
Zabeau و همكارانش در سال 1993 روش جدیدی را تحت عنوان تكثیر قطعات برش‌یافته ابداع كردند كه حاصل آن AFLP است. نشانگر [1]AFLP (یا پلی‌مورفیسم طولی قطعات تکثیرشده) تمامی ویژگی‌های یک نشانگر مولکولی مناسب را غیر از همبارز بودن دارد. نشانگرهای AFLP غالب بوده و به‌علت پلی‌مورفیسم بالایی که دارند، به‌خصوص در جایی که روابط نزدیکی وجود دارد، کارآمدترین نشانگرها هستند، به‌علاوه از نگاه تکنیکی برای انجام این آزمایش هیچ اطلاعاتی از توالی DNA نیاز نیست و همچنین نشانگرهای زیادی را می‌توان در مدت کوتاهی بررسی نموده و تنها مقدار کمی DNA لازم است.
استفاده از نشانگر AFLP تکنیک جدیدی در انگشت‌نگاری DNA است. این روش، تركیبی از PCR و RFLP بوده و مبتنی بر تکثیر قطعات برش‌یافته انتخابی حاصل از هضم کلی DNA ژنومی با PCR است. اساس روش AFLP، طراحی و سنتز آغازگرهای اختیاری و سپس اتصال آنها به قطعات DNA هدف است. آغازگرهای اختیاری AFLP آداپتور[2] نامیده شده و از توالی‌های 20 نوکلئوتیدی شناخته‌شده‌ای تشکیل شده‌اند. توالی‌های DNA هدف، قطعات DNA حاصل از آنزیم‌های برشی هستند. این قطعات از هضم کلی DNA ژنومی از اثر ترکیبی دو آنزیم برشی ایجاد می‌گردند، سپس آداپتورها با کمک آنزیم لیگاز به دو سر قطعات برش‌یافته متصل می‌شوند. سرانجام طی یک مرحله PCR، آداپتورها به‌عنوان جایگاه‌های آغاز تکثیر قطعات برش‌یافته به‌کار می‌روند. نشانگرهای AFLP پلی‌مورفیسم جایگاه برش را آشکار نموده و باید به‌عنوان نشانگرهای غالب در نظر گرفته شوند، زیرا نمی‌توان هموزایگوت‌ها و هتروزایگوت‌ها را از هم تشخیص داد، مگر این‌که مطالعات اصلاح نژادی و شجره‌ای انجام شود تا الگوهای توارث هر قطعه مشخص شود، اما بسیاری از قطعات، تخمین‌هایی از تنوع را در سراسر ژنوم نشان می‌دهند، بنابراین نمایی کلی از سطح تنوع ژنتیکی موجود مورد مطالعه را ارائه می‌نمایند.
در سال1995، Vos و همكارانش از این روش برای انگشت‌نگاری ژنوم‌هايي كه از لحاظ چندشكلی در طول قطعات حاصل از هضم، بسیار به هم نزدیك بودند، استفاده نمودند.
مراحل اصلی انگشت‌نگاری با AFLP
- استخراج DNA :DNA خالص و با وزن مولکولی بالا برای AFLP ضروری است؛ بدین منظور می‌توان از روش‌های استخراج DNA که در مقالات گذشته توضیح داده شد، استفاده نمود.
- برش DNA با استفاده از دو آنزيم محدودگر: بهتر است يكي از اين آنزيم‌ها توالي 6 نوكلئوتيدي[3] (مثل آنزیم EcoRI) و ديگري توالي 4 نوكلئوتيدي[4] (مثل آنزیم MseI) را شناسايي كرده و برش دهد. هر دو آنزيم انتهاي ‘5 آزاد و بدون باز مكمل[5] ايجاد مي‌كنند. آنزیم 4 نوکلئوتیدی برای ایجاد قطعات کوچک که به‌خوبی تکثیر شده و برای تفکیک روی ژل الکتروفورز مناسب‌ترند استفاده می‌شود، درحالی‌که آنزیم نادرتر تعداد قطعاتی را که باید تکثیر شوند، محدود می‌نماید.
- استفاده از دو آداپتور دو رشته‌اي كه مكمل انتهاي بریده‌شده DNA است: آداپتورهای دو رشته‌ای از یک توالی مرکز و یک توالی اختصاصی برای هر آنزیم تشکیل شده‌اند، بنابراین آداپتورها برای جایگاه برش هر یک از آنزیم‌های EcoRI و MseI اختصاصی عمل می‌کنند. معمولاً مراحل برش آنزیمی و اتصال به آداپتورها در یک مرحله صورت می‌گیرد. اتصال آداپتور به DNA برش‌یافته، جایگاه برش را دچار تغییر می‌کند تا از برش ثانویه پس از اتصال آداپتورها جلوگیری نماید. توالی مرکزی آداپتورها از یک توالی شناخته‌شده 20 نوکلئوتیدی تشکیل شده که بعداً در PCR به‌عنوان آغازگر به‌کار می‌رود.
- تكثير قطعات حاصل: این مرحله یک PCR معمولی است که در آن از آداپتورها به‌عنوان آغازگر استفاده شده است. این PCR اولیه تکثیر اولیه نیز نامیده می‌شود که امکان انتخاب اولیه قطعات را از طریق تکثیر قطعات برش‌یافته DNA که به دو انتهای آن آداپتور متصل است، فراهم می‌نماید. علاوه بر توالی‌های آداپتورها، آغازگرهای به‌کاررفته برای تکثیر اولیه یک باز اضافی هم دارند. این باز اضافی امکان یک گزینش مضاعف را از طریق تکثیر یک‌چهارم از قطعاتی که یک آداپتور به هر یک از دو سر آن متصل است مقدور می‌نماید. این آغازگر مستقيم با P33 نشان‌دار شده است. این سه مرحله (استخراج DNA، هضم آنزیمی/ اتصال آداپتورها و تکثیر اولیه) را می‌توان روی یک ژل آگاروز 1/5% الکتروفورز و مشاهده نمود.
- تکثیر انتخابی: هدف از انجام این مرحله محدود کردن سطح پلی‌مورفیسم و نشان‌دار کردن DNA است. برای انجام این تکثیر، سه نوکلئوتید به انتهای َ3 توالی آغازگر به‌کاررفته در تکثیر اولیه (= توالی آداپتور + 3 نوکلئوتید) اضافه می‌شود. این سه نوکلئوتید اضافی تکثیر را گزینشی‌تر نموده و تعداد قطعات برش‌یافته‌ای که تکثیر می‌شوند (پلی‌مورفیسم) را کاهش می‌دهد.
- الكتروفورز قطعات بر روي ژل پلي‌اكريلاميد
- آشكارسازي ژل به روش اتوراديوگرافي و يا تصويربرداري فسفر[6]
در دسترس بودن تعداد فراواني از آنزيم‌هاي محدودگر و به تبع آن طراحي آغازگر براي توالي‌هاي مورد شناسايي آنها، موجب افزايش انعطاف‌پذيري اين روش شده است، به همين دليل اين تكنيك كاربردهاي فراواني از جمله ارزيابي تنوع و گوناگوني ژنتيكي[7]، ساختار جمعيت[8]، رابطه فيلوژني[9]، نقشه‌برداري ژنتيكي و بررسي الگوي بيان ژن را پيدا كرده است.
AFLP تركيبي از RFLP و PCR است كه موجب شده مزايايي از قبيل تكرارپذيري، سرعت، قدرت تفكيك بالا و توانايي تشخيص پلي‌مورفيسم در سطح كل ژنوم را داشته باشد. در اين تكنيك نيازي به شناخت قبلي توالي DNA نيست، همچنين اين روش نیاز به پروب ندارد و دمای اتصال آغازگر به الگو بسیار بالاست. اين نشانگر معمولاً غالب است و زمانی همبارز است كه سایت برشی پلی‌مورفیك کاملاً داخل قطعه باشد.
پروتكل اجرای AFLP
- غلظت DNA تمام نمونه‌ها را يكسان كنيد.
- DNA را با آنزيم محدودگر برش دهيد:
Genomic DNA 200-500 ng
Tris-acetate, pH 7.5 at 37 ْC 10mM
K-acetate 50 mM
Mg-acetate 10 mM
BSA 0.1 mg/mL
EcoRI 5U
MseI 5U
Add dd H2O to 12.5µl
- محلول فوق را به مدت 8-5 ساعت در دماي37 درجه سانتیگراد انكوبه كنيد.
اتصال آداپتور:
- آداپتورهاي ssDNA را در بافر تريس mM10 با 8/5 pH= حل كرده و غلظت ذخيره‌اي[10] آن را به pmol/ µl 200 برسانيد.
- مقدار مساوي از هر رشته مكــــمل آداپتور را با هم مخلوط كرده و به غلظت كاري[11] pmol/µl 20 برسانيد.
محلول اتصال آداپتور[12]:
Tris-acetate, pH 7.5 at 37°c 10mM
K-acetate 50 mM
Mg-acetate 10 mM
ATP 0.4 mM
Adaptor 1 50 µM
Adaptor 2 50 µM
T4 DNA ligase 1 U
dd H2O to 12.5 µl
- µl12/5 از محلول فوق را به محلول برش (ساخته‌شده در مرحله2) اضافه نمایید و يك شب در دماي 16درجه سانتیگراد قرار دهيد.
- با µl 100 بافر تريس mM10 با 8/5 pH، مورد DNA الگو را رقيق كنيد.
مرحله قبل از تكثير:
- محلول زير را آماده سازید:
1:5 diluted template DNA 2.5 µl
Tris-HCl, pH 8.4 10 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1.5 mM
dNTP 0.2 mM
Pre-selective primer 1 0.75 µM
Pre-selective primer 2 0.75 µM
Taq DNA polymerase 1 U
Deionized formamide 2%
dd H2O to 20 µl
دستگاه ترموسيكلر را طبق برنامه زير تنظيم نمایید:
- واسرشت سازي اوليه: 94 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقيقه
- واسرشت سازي 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانيه
- اتصال آغازگر: 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانيه
- همانندسازی و طويل شدن: 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقيقه
- تكرار سه مرحله اخير براي 20 چرخه
- نگهداري در 4 درجه سانتیگراد
تكثير انتخابي:
- نشان‌دارسازي آغازگر با γ-33P-ATP: به‌منظور آشکارسازی محصولات انتخابي PCR، انتهاي فسفاتۀ يكي از دو آغازگر به‌صورت زير با γ-33P-ATP و يا γ-32P-ATP توسط آنزيم T4 پلي‌نوكلئوتيد كيناز نشان‌دار مي‌شود:
EcoR I selective primer 10 µl
γ -33P-ATP 10 µl
Tris-HCl, pH 7.6 70 mM
MgCl2 10 mM
KCl 100 mM
2-mercaptoethanol 1 mM
T4 polynucleotide kinase 10 U
Add dd H2O to 50 µl
- محلول فوق را در دماي 37 درجه سانتیگراد به مدت يك ساعت انكوبه كرده، سپس 10 دقيقه در 70 درجه سانتیگراد قرار دهيد.
نحوه انجام AFLP-PCR:
1:5 diluted pre-amplified template DNA 2.5 µl
Tris-HCl, pH 8.4 10 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1.5 Mm
Mg-acetate 10 mM
ATP 0.4 mM
Adaptor 1 50 µM
Adaptor 2 50 µM
T4 DNA ligase 1 U
dd H2O to 12.5 µl
برنامه دستگاه ترموسيكلر:
- واسرشت سازي اوليه: ْ94 سانتیگراد به مدت 2 دقيقه
- واسرشت سازي: ْ94 سانتیگراد به مدت 30 ثانيه
- اتصال آغازگر: ْ65 سانتیگراد به مدت 30 ثانيه ( ْ0/7 سانتیگراد از اين دما در هر سيكل كم مي‌شود)
- همانندسازی و طويل شدن: ْ72 سانتیگراد به مدت 1 دقيقه
- تكرار سه مرحله اخير براي 12 چرخه
- واسرشت سازي: ْ94 سانتیگراد به مدت 30 ثانيه
- اتصال آغازگر: ْ56 سانتیگراد به مدت 30 ثانيه
- همانندسازی و طويل شدن: ْ72 سانتیگراد به مدت 1 دقيقه
- تكرار سه مرحله اخير براي 20 چرخه
- نگهداري در ْ4 سانتیگراد
الكتروفورز محصولات PCR:
- محصول PCR را به ميزان مساوي با بافر فرماميد X2 (98% فرماميد، mM10 EDTA با 8pH= ، بروموفنول بلو و گزيلن سيانول) مخلوط كنيد.
- محلول فوق را 5-4 دقيقه در ْ93 سانتیگراد انكوبه كرده و فوراً روي يخ قرار دهيد.
- µl3 از نمونه را روي ژل پلي‌اكريلاميد 6% قرار دهيد (اكريلاميد: بيس به نسبت 1:19، M7/5 اوره، بافر TBE 1x)
- نمونه با قدرت 50-40 وات را با بافر TBE 1x الكتروفورز نمایید تا جايي كه رنگ گزيلن سيانول به 3-2 سانتيمتري پائين ژل برسد.
- ژل را خشك نموده و با استفاده از فيلم Kodak BioMax يا ديگر شركت‌ها اتوراديوگرافي انجام شود. در اين مرحله ژل به مدت سه روز در دماي ْ80 سانتیگراد در مجاورت فيلم قرار مي‌گيرد.
توجه: مرحله قبل از تكثير موجب كاهش تداخلات زمينه‌اي مي‌شود كه در اتوراديوگرافي زياد ديده مي‌شود.
f-AFLP
در تكنيك AFLP بر پايه فلورسنت از DNA سكوئنسر اتوماتيك استفاده مي‌شود. در اين روش محصولات PCR حاصل از AFLP چندگانه كه با رنگ‌هاي فلورسنت مختلف نشان‌دار شده است، به‌طور همزمان مورد بررسي و آناليز قرار مي‌گيرد. اين روش داراي مزيت‌هايي است كه از جمله آنها مي‌توان به موارد زير اشاره كرد:
- اين روش قابل كنترل‌تر از AFLP است، بنابراين قابليت نيمه اتوماتيك شدن را داراست.
- به علت بررسي همزمان چند نشانگر، براي مطالعات ژنوتيپي گسترده كاربرد بيشتري دارد.
تكثير انتخابي:
1:10 diluted pre-amplified template DNA 2.0 µl
Tris-HCl, pH 8.4 10 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1.5 mM
dNTP 0.2 mM
EcoR I primer (labeled) 0.4 pmol
Mse I primer 6 pmol
Taq DNA polymerase 1 U
Add dd H2O to 10 µl
آماده‌سازي نمونه براي الكتروفورز بر روي سكوئنسر لوله موئينه
- 5/µl 1-1 از هر محصول PCR را برداشته و مخلوط كنيد. به شرطي مي‌توانيد نمونه‌ها را با هم الكتروفورز كنيد كه آغازگرها با رنگ‌هاي متفاوتي نشان‌دار شده و بقيه شرايط آزمايش براي همه نمونه‌ها يكسان باشد (الكتروفورز چندگانه). سيستم آشكارسازي ABI توانايي شناسايي همزمان چهار رنگ را داراست.
- µl 0/2 استاندارد اندازه 400 يا 500 بازي را با µl10 فرماميد Hi-Di مخلوط و به نمونه‌ها اضافه نمایید.
- محلول فوق را در ْ95 سانتیگراد به مدت 5 دقيقه واسرشت كرده و سریعاً به روي يخ منتقل كنيد.
- در اين مرحله محلول فوق را الكتروفورز كنيد.
1 Amplified Fragment Length Polymorphism
[2] Adapter
[3] Hexa-cutter
[4] Tetra-cutter
[5] Overhang
[6] Phosphoimaging
[7] Genetic diversity
[8] Population structure
[9] Phylogenetic relationships
[10] Stock concentration
[11] Working concentration
[12] Ligation cocktail
مقدمه‌ای بر تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و انواع آن
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام