روش‌های کنترل کیفیت در قارچ‌شناسی کلینیکی
بخش پایانی
دکتر محمد قهری
www.ghahri.ir
آزمایش تولید لوله‌ی زایا (پدیده‌ی رینولد- برود)
اصول: بیش از 90% گونه‌های آلبیکنس که از نمونه‌های کلینیکی جدا می‌شوند قادر به ایجاد لوله‌ی زایا هستند. مخمر به مدت 2 تا 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و درون سرم نگهداری می‌شود.
کاربرد: به‌منظور تشخیص سریع گونه‌ی آلبیکنس از سایر گونه‌ها بکار می‌رود.
کنترل کیفی آزمایش:
- تولید لوله‌ی زایا تحت تأثیر آلودگی باکتریائی است، بنابراین لازم است برای انجام آزمایش از کشت‌های آلوده استفاده نشود.
- میزان ارگانیسم تلقیحی، محیط کشت و درجه حرارت انکوباسیون در نتایج آزمایش مؤثر است. سرم انسان یا حیوان آزمایشگاهی برای انجام آزمایش مناسب است.
- بالاترین میزان تشکیل لوله‌ی زایا با تلقیح 100000 الی یک میلیون سلول در هر میلی‌لیتر حاصل می‌شود. افزایش تعداد سلول باعث کاهش قابلیت تولید لوله‌ی زایا می‌گردد.
- هنگام آزمایش، واریته‌ی شناخته‌شده‌ی آلبیکنس را که ایجاد لوله‌ی زایا می‌کند به‌عنوان شاهد مثبت و از کاندیدا تروپیکالیس به‌عنوان شاهد منفی استفاده می‌شود. در صورتیکه شاهد مثبت لوله‌ی زایا ایجاد نکرد و یا شاهد منفی لوله‌ی زایا تولید نمود، آزمایش بی‌ارزش تلقی خواهد شد.
- برای انجام آزمایش از سرم تازه باید استفاده شود و سرم‌هایی که در یخچال نگهداری شده‌اند برای آزمایش مناسب نیستند.
لوله‌ی زایا در کاندیدا آلبیکنس
لوله‌ی زایا در کاندیدا آلبیکنس
تفاوت مرفولوژیکی بین لوله‌ی زایا و هایفی کاذب
آزمایش کنترل کیفیت محیط‌های کشت و مواد و معرف‌ها
مطابق با سند CLSI-M22 برای تلقیح به محیط کشت از یک کلنی تازه (در حال رشد) استفاده کنید. زمان موردنیاز برای رشد بستگی به ارگانیسم موردنظر دارد (به‌عنوان مثال مخمرها 24 تا 48 ساعت، گونه‌های کریپتوکوکوس تا 72 ساعت و کپک‌ها چندین روز تا چندین هفته).
رنگ‌ها را می‌توان مستقیماً با این کشت مورد آزمایش قرار داد. می‌توان از کلنی قارچ موردنظر مستقیماً به محیط مورد ارزیابی، تلقیح را انجام داد و یا اینکه مقدار استانداردشده‌ای از کلنی برای تلقیح برداشته شود. مورد اخیر قابلیت تکرارپذیری بیشتری دارد و برای ارزیابی خواص رشدی و همچنین مهارکنندگی دارای کارایی بهتری است. تلقیح مقادیر کمتر برای ارزیابی خواص تغذیه‌ای محیط کشت و تلقیح مقادیر بیشتر در ارزیابی خواص مهارکنندگی محیط، مناسب‌تر است.
مقدار تلقیح استانداردشده به‌وسیله‌ی رقیق کردن کلنی قارچی در محلول سالین تا به دست آمدن استاندارد نیم مک‌فارلند تهیه می‌شود.
برای محیط‌های کشت غیرانتخابی، سوسپانسیون را به نسبت یک‌صدم یا یک‌هزارم رقیق کنید. هدف این است که هنگامی‌که 10 میکرولیتر از سوسپانسیون در محیط کشت داده می‌شود مقدار رشد کافی با مرفولوژی تیپیکال به دست آید.
برای محیط‌های کشت انتخابی سوسپانسیون را به نسبت یک‌دهم یا یک‌صدم رقیق کنید و مانند فوق عمل نمایید.
برای محیط‌های کشت داخل لوله 10 میکرولیتر از سوسپانسیون رقیق نشده‌ی نیم مک‌فارلند را تلقیح کنید.
محیط‌ها را بر طبق روش‌های روتین انکوبه نمایید و برای رشد کافی، مرفولوژی تیپیکال، یا در صورت استفاده از محیط‌های انتخابی، مهار رشد را مورد آزمایش قرار دهید.
استانداردهای اجرائی کنترل کیفی برای محیط های کشت قارچی
| محیط کشت | ارگانیسم‌های پیشنهادی QC
(CLSI-M22) |
انکوباسیون | نتایج مورد انتظار |
|
BHI با یا بدون 5% خون گوسفند با جنتامایسین و یا کلرامفنیکل Ph 7.4 |
کاندیدا آلبیکنس
آسپرجیلوس برازیلینسیس آسپرجیلوس فومیگاتوس تریکوفیتون منتاگروفایتیس نوکاردیا آستروئیدس اشریشیا کولی |
30±20C
بمدت 1 تا 3 روز |
رشد (مخمری سفید)
رشد (کلنی سفید کنیدی‌های سیاه) رشد (کلنی آبی سبز) رشد رشد عدم رشد |
| آگار کروموژنیک (گونه‌های کاندیدا) | کاندیدا آلبیکنس
کاندیدا کروزی کاندیدا تروپیکالیس کاندیدا گلابراتا
سودوموناس آئروژینوزا |
35±20C
بمدت 2 تا 3 روز |
برای رنگ کلنی به روش‌های QC شرکت سازنده مراجعه شود. عدم رشد |
|
سابورو با جنتامایسین و کلرامفنیکل pH 6.7 |
کاندیدا آلبیکنس
آسپرجیلوس برازیلینسیس تریکوفیتون منتاگروفایتیس اشریشیا کولی |
30±20C
بمدت 1 تا 3 روز |
رشد رشد رشد عدم رشد |
| Potato Dextrose Agar | کاندیدا آلبیکنس
تریکوفیتون منتاگروفایتیس
تریکوفیتون روبروم |
30±20C
بمدت 1 تا 3 روز |
رشد رشد،کلنی کرم رنگ و سفید. عدم پیگمان در پشت کلنی رشد،کلنی سفید. تولید پیگمان قرمز شرابی در پشت کلنی |
|
سابورودکستروز آگار (امونس) pH 6.9 |
کاندیدا آلبیکنس
آسپرجیلوس برازیلینسیس تریکوفیتون منتاگروفایتیس
|
30±20C
بمدت 1 تا 3 روز |
رشد رشد رشد |
|
سابورودکستروز آگار (امونس) با کلرامفنیکل pH 6.9 |
کاندیدا آلبیکنس
آسپرجیلوس برازیلینسیس تریکوفیتون منتاگروفایتیس اشریشیا کولی |
30±20C
بمدت 1 تا 3 روز |
رشد رشد رشد عدم رشد |
| سابورودکستروز آگار (امونس) با کلرامفنیکل و سیکلوهگزامید (یا: مایکوبیوتیک آگار و یا: مایکوزیل آگار) | کاندیدا آلبیکنس
آسپرجیلوس برازیلینسیس تریکوفیتون منتاگروفایتیس ساکارومیسس سرویسیه اشریشیا کولی |
30±20C
بمدت 1 تا 3 روز |
رشد مهار نسبی رشد خوب عدم رشد عدم رشد |
| کورن میل آگار تووین 80 | کاندیدا آلبیکنس | 26-280C
|
رشد سودوهایفی، بلاستوکونیدی و وزیکول‌های با دیواره ضخیم انتهائی (کلامیدوکونیدی) |
| مالت اکسترکت آگار | تریکوفیتون منتاگروفایتیس
اشریشیا کولی
|
26-280C
|
رشد کلنی سفید عدم رشد |
| چاپک دوکس آگار | آسپرجیلوس برازیلینسیس
آسپرجیلوس فومیگاتوس
|
26-300C
|
رشد (کلنی سفید کنیدی‌های سیاه) رشد (کلنی آبی سبز)
|
| Birdseed Agar | کاندیدا آلبیکنس
کریپتوکوکوس نئوفرمنس واریته نئوفرمنس |
26-300C
|
رشد کلنی‌های سفید رشد کلنی‌های قهوه‌ای رنگ |
| محیط کشت برنج
(Rice grain medium) |
میکروسپوروم کنیس | 26-280C
|
رشد، میسلیوم‌های هوائی سفید رنگ (میکروسکوپی: تولید فراوان ماکروکونیدی دوکی شکل با زائده پستانکی) |
شرایط نگهداری ارگانیسم‌های قارچی کنترل کیفیت
| ارگانیسم‌های قارچی | شرایط نگهداری | محیط نگهداری | مدت زمان نگهداری |
|
مخمرها |
2 تا 8 درجه سانتیگراد | محیط‌های کشت معمولی | 4 هفته |
| 2 تا 8 درجه سانتیگراد | محیط‌های ذخیره (استوک) | 12 ماه | |
| 20- درجه سانتیگراد | سوسپانسیون در مواد نگهدارنده | 12 ماه | |
| 50- درجه سانتیگراد | سوسپانسیون در مواد نگهدارنده | نامحدود | |
| کپک‌ها | 25 تا 30 درجه سانتیگراد | آب مقطر یا روغن در سطح محیط | نامحدود |
| 20- درجه سانتیگراد | سوسپانسیون اسپورها | نامحدود |
استانداردهای اجرائی QC برای رنگ‌آمیزی‌های قارچی معمولی مورد استفاده در آزمایشات مستقیم میکروسکپی
| رنگ یا معرف | ارگانیسم مناسب برای کنترل کیفی | نتایج مورد انتظار |
| کالکوفلور سفید/پتاس | کاندیدا آلبیکنس
اشریشیا کولی |
فلئورسانس عناصر قارچی
عدم فلئورسانس عناصر قارچی |
| گرم | استافیلوکوکوس اورئوس
اشریشیا کولی |
کوکسی های گرم مثبت (ارغوانی) باسیل‌های گرم منفی (صورتی) |
| مرکب چین | کریپتوکوکوس نئوفرمنس
کاندیدا آلبیکنس |
سلول‌های مخمری با هاله‌ی شفاف و خوب مشخص شده سلول‌های مخمری با هاله‌های نامنظم یا بدون هاله |
| پتاس | گونه‌های کاندیدا در نمونه‌ی مثبت پوست یا ناخن | مشاهده‌ی عناصر قارچی با شفاف شدن بقایای سلولی |
منابع:
- E G V Evans., M D Richardson. Medical Mycology a practical approach., IRL PRESS, OXFORD. 1989
- قارچ‌شناسی پزشکی جامع – چاپ دوم – سال 1383 – انتشارات دانشگاه تهران، تألیف دکتر فریده زینی – دکتر امیر سیدعلی مهبد – دکتر مسعود امامی. ص 9-658
- قارچ‌شناسی پزشکی جامع – چاپ دوم – سال 1383 – انتشارات دانشگاه تهران، تألیف دکتر فریده زینی – دکتر امیر سیدعلی مهبد – دکتر مسعود امامی. ص 659
- قارچ‌شناسی پزشکی جامع – چاپ دوم – سال 1383 – انتشارات دانشگاه تهران، تألیف دکتر فریده زینی – دکتر امیر سیدعلی مهبد – دکتر مسعود امامی. ص 717
- قارچ‌شناسی پزشکی جامع – چاپ دوم – سال 1383 – انتشارات دانشگاه تهران، تألیف دکتر فریده زینی – دکتر امیر سیدعلی مهبد – دکتر مسعود امامی. ص: 342
- Difco manual, 11th 1998
- CLSI- M54-A: Principles and Procedures for Detection of Fungi in Clinical Specimens – Direct Examination and Culture, Approved Guideline. October 2012
- Guidelines for Assuring Quality of Medical Mycological Culture Media., Australian Society for Microbiology. 2012
- اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت(2)
مروری تازه بر باسیل‌های گرم منفی (انتروباکتریاسه- 2)
آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی (2)
پیشرفت‌های جدید در درک مکانیسم‌های بیماری‌زایی قارچهای فرصت طلب (3)
آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی (1)
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام