روش‌های کنترل کیفیت در قارچ‌شناسی کلینیکی

بخش دوم

دکتر محمد قهری

www.ghahri.ir

نکاتی در مورد شرایط نگهداری محیط‌های کشت قارچ‌شناسی

– درجه حرارت مطلوب برای جداسازی اغلب قارچ‌های پاتوژن از نمونه‌های بالینی 30 درجه سانتی‌گراد است. اسپوروتریکس شنکئی از موارد استثنا بوده و در دمای 27 یا 28 درجه بهتر از 30 تا 35 درجه رشد می‌کند.

– استفاده از دمای اتاق (25 و 26 درجه سانتی‌گراد) برای نگهداری قارچ‌ها به لحاظ اختلاف درجه حرارت در طی شبانه‌روز که در نهایت منجر به رشد آهسته‌ی قارچ‌های پاتوژن می‌گردد، منسوخ شده است.

– نگهداری کشت‌ها در 37 درجه سانتی‌گراد به 2 دلیل توصیه نمی‌شود:

1- اغلب نمونه‌های بالینی به‌شدت آلوده به باکتری‌هایی هستند که به‌سرعت در دمای 37 درجه رشد کرده و روی کلنی قارچ‌ها را می‌پوشانند و یا مانع رشد آنها می‌گردند.

2- در درجات حرارت بالا بعضی از قارچ‌های پاتوژن به‌زحمت رشد کرده و یا اصلاً رشد نمی‌کنند.

برای جلوگیری از دهیدراتاسیون و رسیدن به رطوبت لازم می‌توان تشتک پر از آبی را در قسمت تحتانی انکوباتور قرار داد.

– تهیه‌ی کشت‌های دوگانه برای هر نمونه‌ی کلینیکی از نظر قارچ‌های دوشکلی و قرار دادن آنها به‌طور همزمان در 25 و 37 درجه سانتی‌گراد روش چندان مناسبی نیست، زیرا رشد فاز میسلیومی قارچ‌هایی نظیر هیستوپلاسما، بلاستومایسس و کوکسیدیوئیدس در 25 درجه به‌مراتب آهسته‌تر از 30 درجه سانتی‌گراد است. مدت نگهداری حداقل 4 الی 6 هفته است تا پاتوژن‌های با رشد آهسته فرصت کافی برای رشد داشته باشند.

– میزان رشد قارچ‌ها بستگی زیاد به مقدار مواد تلقیحی دارد.

– هنگامی‌که تعداد زیاد واحد تولیدکننده کلنی از نمونه وجود داشته باشد، کشت‌های هیستوپلاسما و یا بلاستومایسس در عرض 4 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کنند، درحالی‌که برای نمونه‌هایی که حاوی یک کلنی باشد، این مدت به 4 الی 6 هفته بالغ می‌گردد.

– درصورتی‌که تعداد بی‌شماری واحدهای تولیدکننده‌ی کلنی در ماده‌ی تلقیحی وجود داشته باشد، کشت‌های کوکسیدیوئیدس ایمیتیس بجای 4 الی 7 روز در عرض 48 ساعت قابل شناسایی هستند.

– لوله‌های مورد استفاده برای کشت باید به‌اندازه‌ی کافی بزرگ باشند (200 در 150 میلی‌متر) و سطح لازم جهت رشد کلنی را داشته باشند.

– درب لوله‌های درب پیچ‌دار در مدت نگهداری اندکی باز باشد (به‌اندازه‌ی یک پیچ) تا تبادل اکسیژن را ممکن سازد.

– به‌منظور جدا نمودن کلنی‌های مجزا و تشخیص آنها، پاساژ کلنی‌ها در پلیت مناسب‌تر از لوله است زیرا پلیت حاوی سطح وسیع‌تری از محیط کشت است.

– برای جلوگیری از آلودگی باید پلیت‌ها توسط چسب اسکاچ‌های قابل نفوذ به اکسیژن سیل گردند.

آزمایش و تشخیص کشت‌ها

– کشت نمونه‌های مشکوک به مخمر یا قارچ‌های رشته‌ای روزانه یا حداقل 3 بار در هفته در طی انکوباسیون باید مورد بررسی قرار گیرند.

– کشت خون در عرض هفته‌ی اول باید 2 بار در روز و در طی بقیه‌ی مدت انکوباسیون روزانه مورد بررسی قرار گیرد.

– کشت‌های پوست، مو و ناخن را باید به‌منظور جداسازی درماتوفیت‌ها 3 بار در هفته بررسی نمود. سایر کشت‌ها باید روزانه مورد بررسی قرار گیرند.

محلول‌ها و مواد

محلول لاکتوفنل: برای شفاف کردن مو مورد استفاده قرار می‌گیرد. این محلول پس از تهیه در شیشه‌های قهوه‌ای رنگ باید نگهداری شود.

محلول لاکتوفنل کاتن بلو: برای رنگ‌آمیزی و شفاف کردن نمونه‌های مورد آزمایش (مطالعه‌ی کشت‌های قارچی) مورد استفاده قرار می‌گیرد.

محلول پتاس و گلیسرین: این محلول شفاف‌کننده بوده و نمونه‌ی تهیه‌شده با آن برای چندین روز بدون خشک شدن باقی می‌ماند.

رنگ‌آمیزی متیلن بلو: از این محلول برای تجسس عوامل تینا ورسیکالر، درماتیت سبوروئیک و اریتراسما استفاده می‌شود.

نکته: درصورتی‌که محلول‌های تهیه شده ویژگی‌ها و خواص مربوط به شناسایی و کاربرد مورد انتظار را نداشته باشند، نباید مورد استفاده قرار گیرند.

شرایط نگهداری محیط خشک (دهیدراته)

محیط‌های کشت را در دمای کمتر از 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری نمایید. محیط دهیدراته بسیار جاذب‌الرطوبه است. درب آن را کاملاً بسته نگهدارید.

زمان انقضاء مربوط به محیط کشت به شرطی صحیح است که طبق دستورالعمل مربوطه در شرایط صحیح نگهداری شده باشد.

کنترل کیفی محیط کشت سابورو دکستروز آگار

شکل ظاهری محیط کشت در فرم خشک (دهیدراته): به رنگ بژ روشن، با حالــــــــت روان و آزاد (free- flowing)، یکنواخت (هموژن)

حالت ظاهری محیط کشت حل‌شده با غلظت 6/5%: قابل‌حل در آب مقطر یا آب دیونیزه در دمای جوش، به رنگ کهربائی روشن تا متوسط، اندکی کدر و بدون رسوب یا رسوب بسیار جزئی محیط آماده‌شده: به رنگ کهربائی روشن تا متوسط، کمی کدر و بدون رسوب واکنش محلول در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 5.6± 2

کنترل کیفی آبگوشت سابورو دکستروز

شکل ظاهری محیط کشت در فرم خشک (دهیدراته): به رنگ بژ روشن، با حالــــــــت روان و آزاد (free- flowing)، یکنواخت (هموژن) حالت ظاهری محیط کشت حل‌شده با غلظت 3%: قابل‌حل در آب مقطر یا آب دیونیزه در دمای جوش، به رنگ کهربائی روشن و شفاف محیط آماده‌شده: به رنگ کهربائی روشن و شفاف واکنش محلول 3% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 5.6± 2

منظره کلنی آسپرجیلوس نیجر بر روی محیط پوتیتو دکستروز آگار، مالت ییست آگار و سابورو دکستروز آگار

کنترل کیفی محیط کشت سابورو مالتوز آگار

شکل ظاهری محیط کشت در فرم خشک (دهیدراته): به رنگ بژ روشن، با حالــــــــت روان و آزاد (free- flowing)، یکنواخت (هموژن)

حالت ظاهری محیط کشت حل‌شده با غلظت 6/5%: قابل‌حل در آب مقطر یا آب دیونیزه در دمای جوش، به رنگ کهربائی روشن و کمی کدر. ممکن است اندکی رسوب داشته باشد.

محیط آماده‌شده: به رنگ کهربائی روشن و اندکی کدر و بدون رسوب

واکنش محلول 5/6% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 5.6± 2

تلقیح و انکوباسیون ارگانیسم برای کنترل کیفی در دمای 2±30 و به مدت 18 تا 48 ساعت و یا در صورت لزوم تا 7 روز صورت می‌گیرد.

ارگانیسم	ATCC	مقدار تلقیح (CFU)	نتیجه مورد انتظار
آسپرجیلوس نیجر	16404	100-1000	رشد خوب
کاندیدا آلبیکنس	10231	100-1000	رشد خوب
ساکارومیسس سرویسیه	9763	100-1000	رشد خوب

کنترل کیفی محیط مایکوبیوتیک آگار

کاربرد: جداسازی قارچ‌های پاتوژنیک

شکل ظاهری محیط کشت در فرم خشک (دهیدراته): به رنگ بژ روشن، با حالـــــــــت روان و آزاد (free- flowing)، یکنواخت (هموژن)

حالت ظاهری محیط کشت حل‌شده با غلظت3/56%: قابل‌حل در آب مقطر یا آب دیونیزه در دمای جوش، به رنگ کهربائی روشن تا متوسط و کمی کدر و بدون رسوب است.

محیط آماده‌شده: به رنگ کهربائی روشن و اندکی کدر و بدون رسوب واکنش محلول 3/56% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH:6.5±2

محیط مایکوبیوتیک آگار را طبق دستورالعمل برچسب روی ظرف آن تهیه کنید. تلقیح و انکوباسیون ارگانیسم در دمای 25 تا 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 تا 48 ساعت انجام می‌گیرد. برای تریکوفیتون منتاگروفایتیس از کشت 1 الی 2 هفته‌ای آن به‌طور مستقیم روی محیط کشت تلقیح کنید. کشت‌های تریکوفیتون باید تا 7 روز انکوبه شوند.

ارگانیسم کنترل کیفی	ATCC	میزان تلقیح (CFU)	کیفیت رشد
آسپرجیلوس نیجر	16404	100-1000	مهار رشد
کاندیدا آلبیکنس	10231	100-1000	رشد خوب
اشریشیا کولی	25922	1000-2000	مهار رشد
تریکوفیتون منتاگروفایتیس	9533	رقیق نشده (مستقیم از کلنی)	رشد خوب

کنترل کیفی محیط ایزولاسیون کاندیدا

کاربرد: جداسازی و افتراق کاندیدا آلبیکنس

شکل ظاهری محیط کشت در فرم خشک (دهیدراته): به رنگ بژ با حالت روان و آزاد (free- flowing)، یکنواخت (هموژن)

حالت ظاهری محیط کشت حل‌شده با غلظت 4/1%: قابل‌حل در آب مقطر یا آب دیونیزه در دمای جوش، به رنگ آبی متوسط و دارای کدورت بسیار جزئی

محیط آماده‌شده: به رنگ آبی متوسط و اندکی کدر

واکنش محلول 4/1% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 6.2±0.2

محیط کشت را طبق دستورالعمل برچسب روی ظرف آن تهیه کنید. تلقیح و انکوباسیون ارگانیسم‌ها در پلیت و در دمای 2± 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 تا 72 ساعت انجام می‌گیرد.

ارگانیسم	ATCC	میزان تلقیح (CFU)	کیفیت رشد	فلئورسانس
باسیلوس سوبتیلیس	6633	100-1000	خوب	منفی
کاندیدا آلبیکنس	10231	100-1000	خوب	مثبت
اشریشیا کولی	25922	100-1000	خوب	منفی

محدودیت‌های مربوط به این روش:

– استرین‌هائی از کاندیدا آلبیکنس واکنش منفی کاذب فلئورسانس در این محیط دارند.

– استرین‌هائی از کاندیدا پاراپسیلوزیس، کاندیدا کروزی و کاندیدا پولچریما بر روی این محیط فلئورسانس نشان می‌دهند (مثبت کاذب). این ارگانیسم‌ها را از کاندیدا آلبیکنس با کمک تست جرم تیوب در سرم باید شناسایی کرد.

کنترل کیفی کورن میل آگار Corn Meal Agar

کاربرد: برای تحریک تولید کلامیدوسپور توسط اکثر استرین‌های کاندیدا آلبیکنس و برای کشت قارچ‌های فیتوپاتوژنیک بکار می‌رود.

شکل ظاهری محیط دهیدراته: زرد، روان و یکنواخت

محلول 1/7% قابل‌حل در آب مقطر و آب دیونیزه در دمای جوش

رنگ محلول: کهربائی روشن، کمی کدر و ممکن است رسوب بسیار ظریفی داشته باشد.

واکنش محلول 1/7% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 6± 0.2

محیط کورن میل آگار را طبق دستورالعمل روی آن تهیه کنید. تلقیح ارگانیسم تست بر روی سطح محیط انجام می‌شود. یک سوسپانسیون غلیظ از کاندیدا آلبیکنس تهیه نمایید. یک لوپ استریل میکروبیولوژی را درون این سوسپانسیون فرو برده و سپس تلقیحی به شکل X و به‌اندازه‌ی 2 سانتیمتر در سطح آگار برش دهید. سپس یک لامل روی قسمت X قرار دهید و در دمای 20 الی 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 تا 48 ساعت و در صورت نیاز تا 4 روز انکوبه نمایید، سپس پلیت‌ها را برای مشاهده‌ی کلامیدوسپور مورد بررسی قرار دهید. درصورتی‌که کلامیدوسپورها تولید شده باشند به شکل کره‌های دارای دو دیواره دیده می‌شوند.

ارگانیسم	ATCC	میزان تلقیح (CFU)	رشد کلنی	تولید کلامیدوسپور
آسپرجیلوس نیجر	16404	100-1000	خوب	منفی
کاندیدا آلبیکنس	10231	100-1000	خوب	مثبت
ساکارومایسس سرویسیه	9763	100-1000	خوب	منفی

کنترل کیفی چاپک – دوکس آگار

کاربرد: برای کشت قارچ‌ها و باکتری‌هایی که قادر به استفاده از نیتروژن غیرآلی هستند بکار می‌رود.

فرم ظاهری محیط دهیدراته: بژ خیلی روشن، روان و یکنواخت

محلول 4/9%: قابل‌حل در آب مقطر و آب دیونیزه در دمای جوش، کهربائی روشن، کدر با رسوب یکنواخت

محیط کشت آماده‌شده: کهربائی روشن، کمی کدر، ممکن است کمی رسوب داشته باشد.

واکنش محلول 4/9% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 7.3± 0.2

مطابق دستورات روی ظرف محیط کشت را تهیه کنید، در لوله پخش کرده و لوله‌ها را با ارگانیسم‌های تست تلقیح کنید. محیط کشت تلقیح شده را در دمای 2±30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 تا 72 ساعت انکوبه کنید.

نام ارگانیسم	ATCC	میزان تلقیح (CFU)	رشد کلنی
آسپرجیلوس نیجر	9642	100-1000	خوب
کاندیدا آلبیکنس	10231	100-1000	خوب

کنترل کیفی محیط سیب‌زمینی دکستروز آگار

کاربرد: برای کشت مخمرها و کپک‌ها از محصولات غذائی و لبنی

فرم ظاهری محیط دهیدراته: بژ روشن، روان و یکنواخت

محلول 3/9%: قابل‌حل در آب مقطر و آب دیونیزه در دمای جوش، به رنگ کهربائی روشن، با کدورت خیلی کم

محیط آماده‌شده: کهربائی روشن، اندکی کدر

واکنش محلول 3/9% در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: pH: 5.6±0.2

مطابق دستورالعمل روی ظرف، محیط را تهیه کرده و ارگانیسم‌های تست را تلقیح نمایید. پلیت‌ها را در دمای 2±30 تا مدت 7 روز نگهداری کنید.

نام ارگانیسم	ATCC	میزان تلقیح (CFU)	رشد کلنی
آسپرجیلوس نیجر	16404	100-1000	خوب
کاندیدا آلبیکنس	10231	100-1000	خوب
ساکارومیسس سرویسیه	9763	100-1000	خوب
تریکوفیتون منتاگروفایتیس	9533	رقیق نشده	خوب