اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی
(دستورالعمل تأییدشده)
ترجمه سند CLSI M54-A اکتبر 2012
ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری
www.ghahri.ir
بخش هشتم
10- کشت نمونه‌ها در پلیت و انکوبه کردن آنها
بطور کلی استفاده از محیط‌های کشت در پلیت نسبت به لوله یا ظروف دیگر ارجحیت دارد. محیط‌های کشت داخل پلیت، سطح بزرگتری را فراهم می‌کنند که در آن حجم بزرگتری از نمونه را می‌توان کشت داد، همچنین تبادل هوا بهتر صورت می‌گیرد و نیز امکان مشاهده‌ی بهتری برای کشت‌های مخلوط و مطالعه و بررسی ویژگی‌های کلنی فراهم می‌آورند (برای اطلاعات بیشتر به بخش 1/10 مراجعه شود).
لوله‌ها امکان جداسازی قارچ‌های مهم و موردنظر را بمقدار زیادی کاهش می‌دهند، کلنی‌ها به‌آسانی روی هم را می‌پوشانند و در طول مراحل اولیه‌ی رشد، سطح آگار بسیار مرطوب باقی می‌ماند. به‌هرحال در صورتی که از لوله‌های شیب‌دار (slant) استفاده می‌شود، قطر لوله‌ی کشت باید حداقل 2 سانتیمتر باشد تا سطح کافی هوا برای رشد فراهم شود. رطوبت اضافی سطح لوله‌های شیب‌دار باید قبل از اینکه نمونه روی آن تلقیح شود، گرفته شود. در ابتدا لوله‌های محتوی محیط کشت باید به‌صورت افقی انکوبه شوند (یعنی لوله در وضعیت شیب‌دار خود قرار گیرد) و درب آنها سست و شل باشد تا تبادل هوایی که برای رشد و اسپورزایی موردنیاز است به‌خوبی انجام گیرد. هنگامی که نمونه‌ی تلقیح‌شده خشک شد، لوله‌هایی که با درب‌هایشان همچنان شل باقی مانده‌اند را می‌توان به وضعیت قائم (upright) برگرداند. به‌دلیل اینکه برداشتن درب لوله می‌تواند خطر ایمنی جدی برای پرسنل آزمایشگاه ایجاد نماید، به‌ویژه در مواردی که کپک حضور داشته باشد، درب لوله‌ها هرچند روز یک‌بار باید چک شوند تا مطمئن شویم که آنها به‌صورت شل (و البته بسته) در جای خود حضور دارند.
10/1- تلقیح نمونه‌ها در محیط کشت
اغلب آزمایشگاه‌ها از برچسب‌های کامپیوتری برای شناسایی محیط‌های کشت (که در سمت ظرف محتوی آگار چسبانده می‌شود و نه بر روی درب آن) استفاده می‌کنند. با توجه به ظاهر مشابه برخی از این محیط‌های کشت، نام محیط کشت (که نقش بسته‌شده) نباید زدوده یا محو شود، زیرا هنگام خواندن (بررسی) پلیت‌ها دسترسی به این اطلاعات اهمیت دارد. توصیه می‌شود که حداکثر مقدار نمونه بر روی محیط کشت تلقیح شود، در مورد نمونه‌های مایع بهتر است بیش از نیم میلی‌لیتر تلقیح نشود زیرا این مقدار حداکثر مقدار مایعی است که در سطح محیط کشت آگار می‌تواند جذب شود. باید اجازه داده شود که نمونه‌ی تلقیح‌شده در جای خود دست‌نخورده و یکجا بماند تا کاملاً خشک شود (آب اضافی آن جذب محیط کشت شود) و سپس کشت خطی (streaking) داده شود. هیچگونه اجماعی برای راه مناسب تلقیح در محیط کشت وجود ندارد، اگرچه یک تمرین خوب این است که تلقیح و کشت خطی در نزدیکی لبه‌های پلیت انجام نگیرد (تقریباً یک سانتیمتر از لبه‌ها فاصله گرفته شود). گوشه‌های پلیت اغلب می‌تواند به‌وسیله‌ی قارچ‌های هوابرد آلوده شود و دراینصورت هنگامی که این قارچ‌ها رشد کردند، تفسیر کشت را با دشواری مواجه می‌سازند. یکی از روش‌های مناسب، تلقیح کردن به مرکز محیط‌های کشت و استفاده از لوپ استریل برای کشت خطی از سمت مرکز به طرف گوشه‌های محیط است، درحالی‌که از کشت در گوشه‌ها خودداری می‌گردد. می‌توان پلیت را چرخانده و مجدداً دو بار دیگر کشت دادن (streak) را ادامه داد. این روش استریک کردن معکوس کمک می‌کند که مقدار بیشتری ماده‌ی تلقیح‌شونده در مرکز پلیت و مقدار کمتری از آن در نزدیکی گوشه‌ها قرار گیرد و نیز اجازه می‌دهد که آلوده‌کننده‌ها آسان‌تر مورد شناسایی قرار گیرند. اگر این روش، ایزولاسیون کافی را فراهم نکند، یک روش تلقیح مشابه که با نمونه‌های باکتریولوژیکال مورد استفاده قرار می‌گیرد ممکن است ترجیح داده شود. بعد از تلقیح، پلیت‌ها باید به‌وسیله‌ی نوارچسب قابل نفوذ به گاز یا نوار سلولزی بسته (seal) شوند. این عمل از خشک شدن پلیت‌ها جلوگیری می‌کند و نیز از خارج شدن اسپورها یا کنیدی‌ها و آلوده کردن انکوباتور یا ایجاد خطر برای کارکنان آزمایشگاه جلوگیری می‌کند.
علاوه بر این، بستن یا سیل کردن پلیت‌ها به جلوگیری از آلوده شدن با مایت‌ها (به ضمیمه‌ی D برای اطلاعات در مورد کنترل مایت رجوع شود) کمک خواهد کرد. برخی از آزمایشگاه‌ها ترجیح می‌دهند که پلیت‌ها را داخل کیسه‌های پلاستیکی بسته نگهداری کنند و یا ظروف ثانویه‌ی دیگری که باید برای جلوگیری از آلودگی تعویض یا ضدعفونی شوند. پلیت‌ها باید در حالتی که سمت آگار پائین است نگهداری (انکوبه) شوند.
استریک کردن در کشت مخمری
استریک کردن در کشت مخمری
استریک کردن در کشت کپک
آلودگی کپکی در گوشه‌های پلیت
10/1/1- نمونه‌های جامد (مانند بافت، مو، ناخن و پوست)
نمونه‌های ریزریز شده (minced) و یا هموژنیزه شده (بخش 8/3 را مشاهده کنید)، تراشه‌های پوست و ناخن و قطعات مو باید در سطح آگار کاشته شوند (با خراشیدن محیط کشت). این عمل موجب می‌شود که شیب ضروری فشار اکسیژن که می‌تواند به شروع رشد ارگانیسم قارچی موجود در نمونه کمک کند، فراهم گردد.
10/1/2- نمونه‌های آبگون (مانند مایعات و ادرار)
برای نمونه‌های مایع و آبکی توصیه می‌شود 0/25 الی 0/5 میلی‌لیتر- تا جائیکه مقدار نمونه‌ی دریافت شده اجازه می‌دهد- از نمونه بر روی سطح آگار قرار گیرد. سطح آگار را هنگام تلقیح به‌آرامی خراش دهید و اجازه دهید که نمونه قبل از استریک کردن خشک شود (آب اضافی آن جذب آگار گردد)، سپس نمونه‌ی کشت داده‌شده را انکوبه نمایید.
10/1/3- نمونه‌ی خون جمع‌آوری‌شده به‌وسیله‌ی لوله‌های لیز- سانتریفیوژ
نمونه‌های خون بر طبق توصیه‌های سازندگان و شرکت‌ها نیاز به تلقیح دارند. نسبت مناسب تلقیح به آگار مهم است، زیرا مقدار اضافه‌ی تلقیح می‌تواند پلیت‌ها را بسیار مرطوب نموده و از نفوذ و انتشار کافی ماده‌ی تلقیح‌شده به محیط آگار بکاهد، به همین دلیل سازندگان توصیه می‌کنند که از 4 پلیت استفاده شود، همچنین می‌توانید به بخش 10/2/4 رجوع نمایید.
10/2- محیط‌های کشت
در این بخش فقط در مورد بازیابی (recovery) قارچ‌ها بحث می‌شود. محیط‌های کشت برای جداسازی قارچ‌ها در قارچ‌شناسی کلینیکی، عموماً در یکی از 4 گروه زیر قرار می‌گیرند:
10/2/1- گروه A: محیط‌های کشت عمومی بدون سیکلوهگزامید
به‌عنوان محیط‌های کشت کارآمد برای جداسازی قارچ‌های پاتوژن شناخته شده‌اند.
- محیط SDA Emmons: محیط اصلاح‌شده‌ی امونس حاوی 2% گلوکز است و pH آن نسبت به فرمولاسیون اصلی محیط SDA خنثی‌تر است.
کلرامفنیکل (40mg/l)، پنی‌سیلین، استرپتومایسین و جنتامیسین را به‌عنوان عوامل آنتی‌باکتریال می‌توان به محیط کشت اضافه کرد (برای سرکوب کردن رشد برخی از گونه‌های باکتریال ممکن است سایر آنتی‌باکتریال‌ها موردنیاز باشند).
- محیط IMA: این یک محیط غنی‌شده است که حاوی 125mg/l کلرامفنیکل است، اما همچنین می‌تواند با جنتامیسین (50mg/l) و کلرامفنیکل فرموله شود و یا به کمک کلرامفنیکل و سیپروفلوکساسین ساخته شود.
10/2/2- گروه B: محیط‌های کشت عمومی با سیکلوهگزامید
سیکلوهگزامید از رشد قارچ‌های ساپروفیت با رشد سریع جلوگیری می‌کند. قارچ‌های پاتوژن با رشد آهسته شامل درماتوفیت‌ها، قارچ‌های دیمورفیک خاص و قارچ‌های اندمیک (مثل گونه‌های هیستوپلاسما، بلاستومایسس درماتیتیدیس، گونه‌های کوکسیدیوئیدس و پاراکوکسیدیوئیدس برازیلینسیس) هستند.
این آنتی‌بیوتیک نمی‌تواند در تمام محیط‌های کشت جداسازی وجود داشته باشد زیرا رشد برخی از پاتوژن‌ها و یا قارچ‌های بالقوه پاتوژن مثل کریپتوکوکوس نئوفرمنس، کریپتوکوکوس گتی، گونه‌های آسپرجیلوس، Scedosporium prolificans و Neoscytalidium dimidiatum و بسیاری از گونه‌های کاندیدا و اکثر قارچ‌های موکوراسئوس را مهار می‌کند.
- محیط SDA امونس با سیکلوهگزامید (500mg/l) و کلرامفنیکل (50mg/l):
غلظت سیکلوهگزامید در منابع مختلف بین 100 تا 500 میلی‌گرم در لیتر ذکر شده است و مقدار معمول آن همان 500mg/l است.
- محیط PFA با 1% گلوکز، کلرامفنیکل (50mg/l) و سیکلوهگزامید (500mg/l):
این یک محیط ایزولاسیون/ شناسایی مفید و کارآمد است، زیرا اسپورولاسیون کپک‌ها را تحریک می‌کند.
10/2/3- گروه C: محیط‌های کشت غنی‌شده
محیط‌های غنی‌شده برای بهبود بازیابی قارچ‌های دیمورفیک و یا سایر قارچ‌های سختگیر بکار گرفته می‌شوند. ممکن است جلوی کنیدی‌زایی گرفته شود و بنابراین نیاز به کشت مجدد بر روی محیط‌های کشت دیگر خواهد بود.
- آگار BHI (با یا بدون 5 تا 10 درصد خون گوسفند) با کلرامفنیکل (50mg/l) و جنتامیسین (50mg/l)
- آگار SABHI با کلرامفنیکل (50mg/l) و جنتامیسین (50mg/l)
10/2/4- گروه D: محیط‌های کشت اختصاصی
برای برخی از نمونه‌ها محیط‌های کشت غیر از آنچه در بالا ذکر شد ممکن است مفید باشد.
- آگار کروموژنیک: محیط‌های افتراقی برای جداسازی و شناسایی فرضی برخی گونه‌های کاندیدا می‌باشند.
- محیط‌های کشت برای بازیابی گونه‌های مالاسزیا: چندین نوع از محیط‌های کشت برای کشت گونه‌های مالاسزیا می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. اگر از نواحی غیراستریل کشت انجام می‌شود، لازم است کلرامفنیکل و سیکلوهگزامید (500mg/l) به محیط کشت اضافه شوند. pachydermatis تنها گونه از جنس مالاسزیا است که برای رشد خود به لیپید و یا مکمل polysorbate نیاز ندارد.
محیط SDA یا SDA امونس با روغن زیتون که بر روی محیط قرار گرفته به‌وسیله بسیاری از آزمایشگاه‌ها برای جداسازی گونه‌های وابسته به لیپید مالاسزیا استفاده شده است، اگرچه فقط مالاسزیا فورفور، مالاسزیا پکی‌درماتیس و M. yamatoensis به‌خوبی بر روی این محیط‌ها رشد می‌کنند.
به‌دلیل اینکه گونه‌های دیگر در ایجاد بیماری‌های انسانی دخالت دارند، محیط‌های پیچیده‌ی دیگر مثل محیط اصلاح‌شده‌ی Dixon’s و محیط Leeming- notman پیشنهاد شده‌اند.
- محیط PFA بدون سیکلوهگزامید: یک محیط مؤثر برای جداسازی/ شناسایی است، زیرا کنیدی‌زایی کپک‌ها را تحریک می‌کند؛ کپک‌هایی که می‌توانند برای تصمیم‌گیری‌های درمانی در بیماران با عفونت‌های ناشی از قارچ‌های رشته‌ای تهدیدکننده‌ی حیات مهم باشند (مانند بیماران پیوند مغز استخوان).
- محیط‌های کشت خون: سیستم‌های کشت خون که برای نشان دادن فونژمی مورد استفاده قرار می‌گیرند در زیر لیست شده‌اند:
ظروف کشت خون اختصاصی برای مایکولوژی: این محیط‌ها برای حمایت از رشد مخمرها و کپک‌ها فرموله شده‌اند. شرکت‌های سازنده، مدیفیکاسیون متنوعی بر روی آنها انجام داده‌اند. این ظروف ممکن است حاوی یک محیط کشت مثل آبگوشت BHI باشند که با سیترات آمونیوم فریک به‌عنوان منبع آهن، ساپونین برای لیز گلبول‌های قرمز و قندها و پروتئین‌های ویژه‌ای برای فراهم کردن مکمل‌های تغذیه‌ای همراه هستند. استفاده از محیط‌های کشت اختصاصی قارچی بستگی دارد به تجهیزات هر مؤسسه، جمعیت بیماران و بیماری‌های قارچی آندمیک احتمالی در آن منطقه.
استفاده از ظروف کشت خون اختصاصی قارچی زمان آشکارسازی را نسبت به ظروف کشت خون استاندارد باکتریال کوتاه‌تر می‌کند.
سیستم لیز- سانتریفیوژ: کپک‌های دیمورفیک می‌توانند بسیار سریع و با اطمینان در سیستم لیز- سانتریفیوژ بازیابی شوند. برای بازیابی مطلوب، ماده‌ی تغلیظ‌شده می‌تواند به هرکدام از محیط‌های گروه‌های A و C تلقیح شود. برخی آزمایشگاه‌ها محیط ژلوز شکلاتی را برای بازیابی قارچ‌ها و باکتری‌های هوازی اضافه می‌کنند.
ظروف کشت خون باکتریال استاندارد: این محیط‌ها برای بازیابی گونه‌های کاندیدا و برخی کپک‌ها مفید هستند. در برخی مطالعات استفاده از فاکتورهایی که عوامل آنتی‌باکتریال را غیرفعال می‌کنند بازیابی شده و زمان آشکارسازی مخمرها را بهبود می‌دهند.
محیط‌های کشت اضافی دیگر در ضمیمه‌ی E لیست شده‌اند.
10/3- انتخاب محیط‌های کشت
تعداد و تنوع محیط‌های کشت که در آزمایشگاه قارچ‌شناسی موردنیاز است برحسب نوع و منبع مواد کلینیکی که به آنجا ارجاع می‌شود، بستگی خواهد داشت. استفاده از 2 یا 3 محیط کشت برای بازیابی قارچ‌ها از اکثریت نمونه‌های کلینیکال معمولاً کفایت می‌کند. انتخاب‌های زیر توصیه می‌شوند:
- برای نمونه‌های غیراستریل و منابع غیردرماتولوژیکال یکی از محیط‌های گروه‌های A، B و C را که در بخش 10/2 لیست شده، انتخاب کنید.
- برای نمونه‌هایی که بطور نرمال استریل هستند یک محیط از هرکدام از گروه‌های A و C را انتخاب کنید.
- برای نمونه‌های درماتولوژیکال یک محیط از گروه‌های A و B را انتخاب کنید.
- محیط‌های گروه D می‌توانند به‌عنوان تنها محیط‌های کشت برای جداسازی/ یا شناسایی فرضی مورد استفاده قرار گیرند. انتخاب‌ها از گروه‌های A تا C را می‌توان برحسب طبیعت کار و روش‌هایی که در آزمایشگاه‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد، بکار گرفت.
10/4- شرایط و الزامات موردنیاز برای انکوباسیون
10/4/1- رطوبت و دما
انکوباتورها در دمای2±30 تنظیم می‌شوند و این دمای مطلوبی برای بازیابی قارچ‌ها از نمونه‌های کلینیکال است، همچنین باید از رطوبت کافی کسب اطمینان گردد که از خشک شدن پلیت‌های کشت‌شده جلوگیری شود. انکوبه کردن همزمان نمونه‌ها در دمای 30 درجه و 37 درجه توصیه نمی‌شود. باید توجه داشت که انکوباسیون در 37 درجه ممکن است برخی از عوامل آنتی‌باکتریال را که در محیط‌های انتخابی وجود دارد غیرفعال کند و نیز موجب شود که برخی از قارچ‌ها که در حالت نرمال نسبت به این عوامل حساس نیستند، حساس شوند. انکوباسیون در دمای اتاق موجب رشد آهسته‌تر مربوط به اختلاف دمای شب و روز می‌شود و بدنبال آن ممکن است بازیابی برخی قارچ‌ها را به تأخیر اندازد. آگارهای کروموژنیک برای جداسازی مخمرهای غیر از کریپتوکوک و ظروف کشت خون در سیستم‌های اتوماتیک باید مطابق با توصیه‌های شرکت‌های سازنده‌ی آنها انکوبه شوند. محیط‌های کشت برای جداسازی مالاسزیا بطور مطلوب در دمای 1±33 درجه‌ی سانتیگراد انکوبه می‌شوند اگرچه دمای 1 ±30 نیز کافی است.
10/4/2- مدت زمان انکوباسیون
کشت‌های درون پلیت‌ها به‌استثنای آنچه در زیر نشان داده شده است باید برای 3 هفته انکوبه شوند. استثناهای مربوط به این توصیه در زیر لیست شده‌اند:
- اگر قارچ‌های دیمورفیک و یا درماتوفیت‌ها مطرح (مورد تردید) باشند، انکوباسیون باید برای مدت 4 هفته ادامه داشته باشد.
- برای نمونه‌های مربوط به دستگاه تنفسی، خون و مغز استخوان در نواحی اندمیک برای گونه‌های هیستوپلاسما، انکوباسیون به مدت 4 هفته دارای اهمیت ویژه است، علاوه بر این، انکوباسیون 4 هفته‌ای ممکن است برای نمونه‌هایی که از بیماران HIV/AIDS گرفته می‌شود، مناسب باشد. بطور کلی بازیابی یک قارچ دیمورفیک در کشت قویاً تحت تأثیر بار (load) قارچی در نمونه‌ی کلینیکی قرار می‌گیرد؛ به‌عنوان مثال بلاستومایسس درماتیتیدیس در مدت 2 روز انکوباسیون در محیط کشت بازیابی شده است.
- آگارهای کروموژنیک برای فقط مخمرها (دستگاه تنفسی فوقانی و نواحی اوروژنیتال) باید طبق توصیه‌ی سازندگان آنها انکوبه شوند.
- کشت‌های مخمرها (شامل گونه‌های کریپتوکوکوس نیست) که بجای آگارهای کروموژنیک در آگارهای معمولی کشت شده‌اند باید به مدت 7 روز انکوبه شوند.
- افزودن به زمان انکوباسیون باید برای کشت‌های قارچی که از نواحی تنفسی بیماران سیستیک فیبروزیس گرفته می‌شود، در نظر گرفته شود. این عمل برای بهبود جداسازی dermatitidis در این دسته از بیماران توصیه شده است.
- نمونه‌های درماتولوژیکال برای گونه‌های مالاسزیا باید برای حداقل 2 هفته انکوبه شوند.
کشت‌های خون:
- ظروف کشت خون استاندارد در سیستم‌های اتوماتیک: توصیه‌ی سازندگان رعایت شود (عموماً 5 روز).
- ظروف کشت خون مایکولوژیکال در سیستم‌های اتوماتیک: توصیه‌ی سازندگان رعایت شود (عموماً 3 تا 4 هفته).
- سیستم‌های لیز- سانتریفیوژ: پلیت‌ها را برای 3 تا 4 هفته انکوبه کنید. اگر هیستوپلاسما کپسولاتوم قویاً مورد تردید باشد، زمان انکوباسیون را باید طولانی‌تر کرد.
- به سایر محیط‌های کشت که در ضمیمه‌ی E لیست شده‌اند برای توصیه‌های مربوط به دمای اختصاصی و مدت زمان انکوباسیون رجوع کنید.
اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت(2)
ویژگی‌های مربوط به جنس مالاسزیا (بخش دوم)
برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام