کاوشگرها
دکتر مهدی فصیحی رامندی (عضو هیئت علمی دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌ا… (عج))
زهرا کریمی (مرکز تحقیقاتی زیست سلول پژوهان تدبیر)
دکتر رضا میرنژاد (استاد دانشگاه)
کاوشگر[1] قطعه‌ای از DNA یا RNA است که برای شناسایی و تشخیص در طی آزمایش‌های دورگه‌سازی نشاندار می‌شود. برای تهیه کاوشگر، منشأ و طبیعت DNA و RNA مورد استفاده باید مشخص و ثبت شده باشد. مشکلات و خطاهای کاوشگرها بسیار فراوان است (شاید به دلیل آن که سال‌ها در شیشه‌های کوچک مهروموم‌شده و در فریزر نگهداری شده‌اند) و حل کردن آنها ممکن است وقت‌گیر باشد. قبل از کاربرد همسانه‌ها و کاوشگرها، باید اندازه، جایگاه‌های عمل آنزیم‌های محدودکننده[2]، سالم بودن اسید نوکلئیک، غلظت کاوشگر و پارامترهای دیگر مشخص و کنترل شوند.
انواع کاوشگر
در آزمایش‌های دورگه‌سازی، انواع DNA و RNA را می‌توان با توجه به شرایط آزمایش برای تهیه کاوشگر مورد استفاده قرار داد. شاید بتوان گفت که توالی‌های همسانه‌شده DNA بیشترین کاربرد را در چنین آزمایش‌هایی دارند، DNA ژنومی، محصولات PCR و اولیگونوکلئوتیدهای ساختگی[3] نیز به‌طور معمول استفاده می‌شوند.
کاوشگرهای همسانه‌شده
همسانه‌ها[4] گستره‌ای از DNA یک گونه موردنظر هستند که وارد ناقل (نظیر پلاسمید) شده و در سلول‌های میزبان مناسب (مثل باکتری) تکثیر می‌شوند. همسانه‌های پلاسمیدی در ناقل‌هایی چون pUC18 و pUC19 جاسازی شده و در داخل سلول E.coli تکثیر می‌شوند. از این دسته ناقل‌ها برای همسانه‌سازی قطعاتی با طول کمتر از 10 کیلوباز استفاده می‌شود. برای قطعات طویل‌تر (بیشتر از یک مگاباز)، از باکتریوفاژ، کاسمید و کروموزوم‌های مصنوعی استفاده می‌شود.
DNA همسانه‌شده دارای کاربردهای فراوانی است. قطعات همسانه‌شده را می‌توان به مقدار زیاد، با خلوص بالا و به‌طور کامل مطابق با توالی اصلی جداسازی کرد. کاوشگرهای DNA یا RNA را می‌توان با استفاده از اطلاعات هر یک از رشته‌های DNA ساخت. DNA موردنظر را می‌توان به‌راحتی نشاندار و در آزمایش‌های دورگه‌سازی درجا و ساترن استفاده کرد.
DNA ژنومی
تجربه ثابت کرده است که DNA ژنومی حاصل از هسته یک موجود زنده از اهمیت ویژه‌ای برای ساخت کاوشگرهای کاربردی برخوردار است و از آن به‌منظور شناسایی و تشخیص کروموزوم‌های موجود در سلول‌های دورگه، موجودات زنده، تکامل کروموزومی و تبادلات کروموزومی استفاده می‌شود. به‌منظور افزایش یا کاهش تعداد نسخه‌های ژن‌ها در سیتوژنتیک سرطان، DNA ژنومی تومورها و سلول‌های طبیعی استخراج و با کروموزوم‌های افراد سالم دورگه‌سازی می‌شوند، همچنین از DNA ژنومی برای ساخت و تکثیر کاوشگر به روش PCR و بدون نیاز به همسانه‌سازی استفاده می‌شود. علاوه بر این، از DNA ژنومی برای ممانعت از اتصال کاوشگر به نواحی تکراری موجود در سطح DNA مورد آزمایش استفاده می‌شود. همسانه‌های طویل‌تر اغلب حاوی توالی‌های تکراری هستند و باید از دورگه شدن آنها با کروموزوم هدف جلوگیری شود، ضمن آن که توالی‌های کم‌نسخه موجود در کاوشگر نیز باید برای دورگه‌سازی با کروموزوم حفظ شوند (سرکوب دورگه‌سازی کروموزومی[5]). برای این منظور از عوامل جلوگیری‌کننده (بلاکینگ) به مقدار زیاد استفاده می‌شود که هم با کاوشگر و هم با DNA هدف دورگه می‌شوند. DNA کل ژنومی را می‌توان به‌منظور غنی‌سازی، اصلاح و یا حذف توالی‌های تکراری تغییر داد (به این عوامل بلاکینگ DNA Cot=1 گفته می‌شود که انواع تجاری آن برای کروموزوم‌های انسانی موجود است) و این عمل باید طوری انجام پذیرد که توالی‌های کم‌نسخه برای دورگه‌سازی باقی بمانند.
تکثیر DNA با PCR
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) روش سریع و کارآمد برای تکثیر توالی‌های خاصی از یک همسانه، DNA ژنومی حاصل از دسته‌بندی کروموزومی محسوب می‌شود.
از آغازگرهای اولیگونوکلئوتیدی برای جداسازی و تکثیر انواع توالی‌ها اعم از توالی‌های خاص یا تمامی توالی‌های مربوط به DNA ژنومی یا DNA دسته‌بندی‌شده استفاده می‌شود. اگر توالی DNA قبلاً شناسایی شده باشد، طراحی و ساخت آغازگر و تکثیر توالی‌های خاصی از DNA ژنومی با استفاده از PCR آسان خواهد بود.
اولیگونوکلئوتیدهای ساختگی
اولیگونوکلئوتیدهای ساختگی[6] از اهمیت ویژه‌ای در دورگه‌سازی در محل برخوردارند. بعد از نشاندار کردن می‌توان از طریق روش‌های معمول دورگه‌سازی در محل، آنها را در مکان‌هایی با توالی‌های خاص ردیابی کرد؛ برای مثال توالی‌های موجود در ناحیه تلومری به‌طور معمول در گیاهان با ترادف TTTAGGG و در جانوران با ترادف TTAGGG همولوگ هستند. این اولیگونوکلئوتیدهای تکراری را می‌توان به روش دورگه‌سازی مبتنی بر آغازگر در محل (PRINS) که هم‌اکنون تنها روش برای توالی‌های تکراری DNA است، مکان‌یابی کرد.
کاوشگرهای RNA
کاوشگرهای RNA بیشتر در دورگه‌سازی RNA استفاده می‌شوند. دورگه‌های RNA:RNA پایدارتر از دورگه‌های DNA:RNA هستند و امکان برطرف ساختن پس‌زمینه از طریق حذف ریبوکاوشگرهای دورگه‌نشده با استفاده از ریبونوکلئاز H (آنزیم تخریب‌کننده تک‌رشته‌ای) وجود دارد. توالی موردنظر برای ساخت کاوشگر، در ناقلی که واجد جایگاه‌های شروع نسخه‌برداری برای RNA پلیمرازهای باکتریوفاژ است، همسانه‌سازی می‌شوند. این آنزیم‌ها برای تولید کاوشگرهای تک‌رشته و نشاندارشده RNA (ریبوکاوشگر) استفاده می‌شوند. ریبوکاوشگرها را می‌توان برای دورگه‌سازی با DNA نیز استفاده کرد که این روش کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرد، ولی مزایایی نیز دارد.
نشاندار كردن اسیدهای نوكلئيك
نشاندار كردن اسیدهای نوكلئيك تحول بزرگي در بيولوژي مولكولي ايجاد نمود. اين تكنيك براي تأیید كارهاي مولكولي و همچنين غربالگري کلنی‌های باكتري حاوي پلاسميد نوتركيب (دورگه‌گیری) استفاده می‌شود.
روش‌های نشان‌داركردن آنزيماتيك DNA
Random – primed labeling
در دورگه‌سازی، علاوه بر استفاده از کاوشگرهاي نشاندارشده با راديوايزوتوپ‌ها، از گروه‌هاي تغییریافته غيرراديواكتيو مانند بيوتين يا ديگوكسيژنين نيز استفاده می‌شود.این روش در سال 1984 و 1983 توسط Feinberg و Vogelstein ابداع گردید .نشان‌داركردن توسط آنزیم klenow انجام می‌شود كه قطعه بزرگ DNA پلميراز I اشریشياكلي است. Klenow فاقد فعالیت اگزونوكلئازي `5 → `3 است، ولي برعکس دارای فعالیت اگزونوكلئازي `3 → `5 است.
براي نشان‌داركردن با روش Random-Priming، اولDNA دورشته‌اي خطي توسط حرارت دناتوره شده و سپس روي يخ سرد می‌شود تا مانع رناتوراسيون DNA شده و به‌صورت زنجیره‌های تک‌رشته‌ای باقي بماند. DNA سوپرکویل‌شده، مقدار كمتري نشاندار می‌شود، چون Reannealing رشته‌ها سريع‌تر انجام می‌شود، بنابراین مولکول‌های DNA حلقوي بايد قبل از نشان‌دارشدن به‌صورت خطی درآمده باشند تا عمل Labeling به مقدار زياد انجام گيرد.
از قطعات كوچك DNA هگزانوكلئوتيدي با توالی‌هاي‌متفاوت به‌عنوان‌آغازگر براي ساخت DNA به كمك یک آنزیم DNA پليمراز استفاده می‌شود. مخلوط هگزانوكلئوتيدها به روش تصادفي به DNA دناتوره‌شده هدف Anneal می‌شوند. اين اليگونوكلئوتيدها در واكنش پليمراز بعدي به‌عنوان primer عمل می‌کنند. ساخت کاوشگر با اضافه‌كردن آنزيم پليمراز klenow و چهار دزوكسي نوكلئوتيد تري‌فسفات (كه حداقل‌يكي از آنها (dUTP) با هاپتن نشاندار شده است) شروع می‌شود. چون آغازگرها خاصيت تصادفی دارند، می‌توانند به همه ترادف‌‌هاي هدف اتصال یابند. در اثنای ساخت به روش Random – primed ، هر دوزنجیره DNA (رشته‌های مکمل DNA هدف ) بعد از دناتوراسيون به‌عنوان الگو عمل می‌کنند. غلظت زياد آغازگر مانع Reanealing دو رشته الگو با يكديگر می‌شود.
در اين روش به علت عمل آغازگرهاي كوتاه، معمولاً رشته DNA نشان‌دار‌كوتاه‌تر از DNA الگو است. چون هر دو رشته DNA اصلي به‌عنوان Template عمل می‌کنند. رشته‌هاي کاوشگر نشاندار نيز تا اندازه‌اي مكمل یکدیگر هستند، به‌طوری‌که قبل از دورگه‌سازی لازم است دناتوره شوند.
از روش primed- Random براي نشاندار كردن قطعات DNA به مقدار چند نانوگرم تا چندين ميكروگرم استفاده می‌شود. نشاندار شدن بعد از 60ـ30 دقيقه به حداکثر می‌رسد و هنگام انكوباسيون طولاني ورود ماده نشاندار به رشته ثابت است. حساسيت هاپتن‌هايي مانند بيوتين و Digoxigenin از طریق Random priming تا 100 فمتوگرم DNA است.
Nick translation
این روش اولين بار براي نشاندار كردن کاوشگر با راديوايزوتوپ توسط Rigny در سال 1977 ابداع گردید. در اين روش عمل دو آنزيم DNase I وDNA پلیمراز I اشریشياكلي روي DNAدورشته‌اي همزمان انجام می‌گیرد. DNase I يك اندونوكلئاز اختصاصي هيدروليزكننده باندهاي فسفو‌دي‌استر رشته‌هاي DNA است. این عمل منجر به ايجاد اليگونوكلئوتيدهاي كوتاه حاوي ‘5 فسفات می‌شود. عمل آنزيم روي هر رشتهDNA مستقیماً و در حضور يون +Mg2 انجام می‌گیرد و شکاف‌هایی در DNA يك‌رشته‌اي به‌وجود می‌آورد كه تعداد آنها به غلظت DNase I در مخلوط انكوباسيون بستگی دارد.
اين عمل با غلظت پايين DNase I هم انجام می‌شود. در اين شرايط فقط تعداد كمي شکاف در هر زنجیر DNA به‌وجود می‌آید. آنزيم DNA پلیمراز I داراي سه فعاليت كاتاليتيك مستقل يعني پليمرازي ‘3 →’5، اگــــــزونوكلئازي’3 →’5 و اگزونوكلئازي’5 →’3 است.
فعاليت اگزنوكلئازی’3 →’5 آنزيم باعث حذف دزوكسي نوكلئوتيدها از انتهاي ‘5 فسفات می‌شود. با فعالیت پليمرازي’3 →’5 آن، آنزیم مذکور به‌طور همزمان‌نوكلئوتيد تري‌فسفات‌ها را به انتهاي ‘3 OH آزاد شكاف (Nick) اضافه می‌کند. اگر دزكسي نوكلئوتيد تري‌فسفات‌هاي همراه دزوكسي نوكلئوتيد تري‌فسفات‌هاي تغییریافته با هاپتن در مخلوط واكنش باشند، در اثنای واکنش پليمريزاسيون، هاپتن وارد زنجيره می‌شود. چون عمل DNA Polymerase I وابسته به DNA الگو اســـــــــــــت، ترادف نوكلئوتيدي هنگام Nick translation بدون تغيير باقي می‌ماند.
نشان‌داركردن DNA توسط PCR
PCRيك روش توانمند براي ساخت کاوشگرهاي DNAاست. اين روش در سال 1984 توسط کری موليس ابداع گرديد و براي كارهايی مانند تكثير، همسانه‌سازی، تعیین توالی و ساخت کاوشگر بكار گرفته شد. در اين روش دو آغازگر حاوي دزوكسي نوكلئوتيد تري‌فسفات‌هاي نشاندارشده در پليمريزاسيون DNA شركت می‌کنند. PCR توسط يك DNA پليمراز گرمادوست مانند Taq انجام می‌شود. واكنش تکثیر در 30 سيكل حرارتي در سه مرحله واسرشت سازی، اتصال آغازگر و طویل‌سازی انجام می‌گیرد.
دورگه‌گیری
DNAدورشته‌اي محلول تحت تأثير حرارت دناتوره مي‌شود .اگر حرارت در حدTm مولكول DNA باشد، دناتوراسيون برگشت‌ناپذیر است؛ یعنی رشته‌های DNA در محیط سرما جدا از يكديگر باقی می‌مانند.
Tm یک مولــــــــــــــــــکول DNA دورشــــــته‌اي ايستــــــايي DNA در حــــــــرارت اســـــــت .(Function of the ThermalStability)
در يك DNA هومولوگ، اين پديده انعكاس نسبت بازها یعنی محتوای G+C موجود در DNA است. Cو G با سه اتصال هیدروژنی به هم متصل مي‌شوند، در حالي‌كه Tو A با دو اتصال بهم مربوط مي‌شوند. Tm مولكول DNA تحت تأثير قدرت یونی محیط (با افزایش یون‌ها Tm بالا می‌رود) (حضور يون‌ها (+Mg)، پلي‌ساكاريدها، پروتئين و حلال‌هاي‌آلي (Formamide)) قرار مي‌گيرد.
رشته‌هاي DNA دورشته‌اي دناتوره‌شده در حرارت کمتر از Tm خودبخود بهم چسبيده و نهايتاً با DNA مكمل خود يك هيبــريد پايــــدار تشكيـــــل مي‌دهنــــد، بنابراین واکنش از كينتيك ثانويه (Second- Order Kinetics) تبعيت می‌کند. هيبريديزاسيون نيز شبيه Tm تحت تأثير فاكتورهايي مانند قدرت يوني و حلال‌هاي آلي قرار مي‌گيرد. اصطلاح Stringency در اين مورد مفهوم مهمي است اما همه این فاكتورها )حرارت، غلظت نمك، وجود حلال‌هاي‌آلي) را دربر نمي‌گيرد.در شرایط Stringency پايين )نمك زياد و حرارت كم)، DNAهاي با شباهت كمتر با همديگر هيبريد مي‌شوند. در صورتي كه در Stringency بالا) غلظت كم نمك و حرارت بالا در حضور فرماميد)، Hybridization فقط بین دو DNA با هومولوژي بالا اتفاق مي‌افتد. در اين شرايط حرارت 30ـ20 Hybridization درجه پایین‌تر از (melting temprature) tm است. براي انجام Hybridization بايد DNA هدف را روي يك پشتيان جامد منتقل نمود تا DNA نشاندار (به‌صورت محلول) با DNA هدف هيبريد تشكيل دهند .در ساترن بلات DNA يا RNA روي ژل آگارز الكتروفورز مي‌شوند و سپس روي غشاي نيتروسلولز يا نايلوني منتقل مي‌گردند.از مواد پشتيبان‌كننده ديگر مانند سلولز فعال، سفاكريل، پلي‌استيرن يا بيدهاي مگنيتك نيز مي‌توان استفاده نمود.
پارامترهاي Hybridization
پایداری هیبرید:
تشكيل هيبريدهاي اسيدنوكلئيك يك پروسه برگشت‌پذیر است. Tm عبارت است از حرارتي كه نصف مولكول‌هاي DNA دوبلکس به تک رشته تبدیل مي‌شوند و تحت تأثير غلظت نمك كاتيون‌هاي يك‌ظرفيتي) مول بر لیتر تعداد نوكلئوتيدهاي زنجيره، ترکیب بازها (كه با G+C بيان مي‌شود ) و غلظت عوامل ناپايداركننده هليكس‌مانند Formamide قرار مي‌گيرد.
كينتيك هيبريديزاسيون پروب‌هاي تكرشتهاي (Riboprobe):
ميزان تشكيل هيبريد براي پروب‌هاي تكرشتهاي از كينتيك اوليه (First – Order Kinetics) تبعيت می‌کند، زيرا تقريباً هميشه غلظت پروب بیشتر از Target DNA است، بالاترين ميزان هيبريديزاسيون در محلول به‌صورت تجربي مشخص مي‌شود. درجه Tm در دوبلکس DNA-DNA15 درجه كمتر از دوبلکس RNA-DNA است.
غلظت كاتيون (M) تأثير كمتري روي میزان ثابت (rate) Constant هيبريديزاسيون DNA-DNA دارد .ميزان هيبريديزاسيون تحت تأثیر قدرت يوني پايين قرار مي‌گيرد. هيبريديزاسيون در 1MNaCl هفت برابر بيشتر از0.18MNaCl انجام مي‌گيرد. كاهش غلظت نمك در حد 0.09M NaCl تا 5 برابر ميزان هيبريديزاسيون را كاهش می‌دهد. تأثير نمك روي تشکیل دوبلکس RNA-DNA تا اندازه‌اي با آنچه ذكر شد اختلاف دارد. در MNaCl 0.1 تشكيل DNA-RNA همسنگ (DNA-DNA Equivalent) است، ولي در 1M NaCl ميزان تشکیل دوبلکس RNA-DNAدو برابر 0.18M است.
كينتيك هيبريديزاسيون در پروب‌هاي دورشته‌اي (DNA) :
در پروب‌هاي دورشته‌اي هيبريديزاسيون از كينتيك ثانويه (Second – Order Kinetics) تبعيت می‌کند. اين پروب‌ها مي‌توانند با اسيدهاي نوكلئيك ثابت‌شده روي فيلتر هيبريد شوند و يا در محلول دوباره Renatureگردند. در نتيجه هيبريديزاسيون 5 برابر آهسته‌تر از پروب‌هاي تكرشتهاي انجام مي‌گيرد.
پليمرهاي دكستران آنيوني (دكستران سولفات 500) يا پلي‌اتيلن گليكول 6000 اتصال دو رشته پروب را در محلول به همديگر تشديد مي‌كنند .دكستران سولفات، محلول را از DNA خارج مي‌كند، بنابراين غلظت مؤثر DNA افزايش مي‌يابد. اثر دكستران سولفات براي پلي‌نوكلئوئيدهاي بيشتر از 250bp مشهودتر است و روي اليگونوكلئوئيدها تأثيري ندارد.
وقتي از پروب‌هاي تكرشتهاي استفاده مي‌شود، هيبريديزاسيون تا سه برابر افزايش می‌يابد و وقتي از Nick translated probe استفاده شود تا 100 برابـــر مي‌شـــــود. مولكول‌هایی كه از طريق Nick translation نشاندار شده‌اند، دكستران سولفات تشكيل شبكه پروب (probe network) يا hyper polymerها را تسريع نمي‌كنند و تأكيد مي‌شود كه تشكيل چنين شبكه‌هايي به اندازه پروب بستگی دارد. خاطرنشان مي‌سازد كه اگر دكستران سولفات در محيط نباشد background هاي غيراختصاصي زياد مي‌شوند.
روش كار:
Labeling (نشاندار كردن DNA و RNA):
براي نشاندار كردن قطعه DNA (پروب) از كيت Random Primed DNALabeling شركت Roch Molecular Biochemicals كه با سيستم Digoxigenin (غيرراديواكتيو) كار می‌کند استفاده می‌شود. ديگوكسيژنين يك هاپتن استروئيدي است كه DNA، RNA و اليگونوكلئوئيدها را جهت Hybridization نشاندار می‌کند و ظهور (Detection) آن به‌صورت كالريمتري انجام مي‌شود. براي نشاندار كردن DNA، ديگوكسيژنين از طريق اتصال استري وارد dUTP مي‌شود، اتصال فوق در برابر قليا (alkali) ناپايدار بوده و اين امتيازي است كه DIG- 11- dUTP به‌‌آساني توسط قليا از رشته مكمل روي Filter (كاغذ نيتروسلولز يا غشا، نايلون) شسته شده و مي‌توان دوباره از فيلتر براي هيبريديزاسيون با پروب ديگر استفاده نمود.
ـ DNA را مدت 10 دقيقه در آبجوش قرار دهيد تا به Single strand DNA تبديل شود و بلافاصله آن را روي يخ حاوي نمك منتقل كنيد و مواد زير را به آن اضافه نماييد:
ـ 2 ميكروليتر از مخلوط هگزانوكلئوتيدها
– 2 ميكروليتر مخلوط dNTP
– آب مقطر تا حجم 19 ميكروليتر
– 1 ميكروليتر آنزيم klenow
با دست به ته لوله ضربه بزنيد تا مواد داخل لوله مخلوط شوند و مختصري سانتريفوژكنيد (quickspin).
– مدت 24 ساعت (O/N) در 37 درجه سلسیوس قرار دهيد.
– واكنش را با EDTA متوقف كرده و براي پرسيپيتاسيون، LiCL با غلظت نهائي M0.5 به آن اضافه كنيد
– رسوب حاصل را در 50 ميكروليتر بافر TE حل كنيد.
ـ براي كنترل Labeling، يك واكنش نيز با DNA كنترل موجود در كيت انجام دهيد.
بررسي كمي و كيفي پروب نشاندارشده:
از پروب نشاندارشده رقت سريال (1/10، 10/100، 1/1000) تهيه كنيد (به هر يك از ويال‌ها 9 ميكروليتر آب اضافه كرده، سپس يك ميكروليتر از پروب به لوله اول اضافه كرده و خوب مخلوط كنيد و همينطور يك ميكروليتر از لوله اول به لوله دوم منتقل كنيد و …)
– با انجام Dot blot روي نايلون يا نيتروسلولز آنها را ظاهر (detect) كنيد.
– پس از انجام (dot) لكه‌گذاري، قبل از اينكه لكه‌ها كاملاً خشك شوند توسطUV Crosslinker (مقدار 12000 ژول انرژي) آنها را روي غشا ثابت كنيد (وقتي DNA در معرض UV قرار گيرد، تيمين موجود در آن با گروه‌هاي آمين روي سطح نايلون cross-link مي‌شوند.)
– نايلون را مدت 10 دقيقه در بافر I قرار دهيد.
– غشا را مدت 1 ساعت در بافر II قرار دهيد تا فيلتر block شود (جاهایي كه DNA وجود ندارد توسط BSA پوشيده (block) مي‌شود تا آنتي‌بادي نتواند روي غشا بچسبد).
– غشا را مدت 20 دقيقه در DigAnti با رقت 1/5000 قرار دهيد.
– غشا را چند دفعه با بافر I شستشو داده تا آنتي‌بادي‌هاي متصل‌‌نشده از روي فيلتر حذف شوند.
– غشا را با بافر III شستشو دهيد.
– لكه‌هاي روي غشا را با (Nitro BlueTetrazolium (NBT و (Bromo Chloro Indolyl Phosphate (BCIP ظاهر كنيد.
ـ با مقايسه رنگ لكه‌ها بارنگ لكه DNA كنترل نشاندارشده موجود در كيت، مقدار پروب نشاندارشده را محاسبه كنيد.
تهيه Riboprobe
ريبوپروب‌ها از رونويسي اختصاصي يكي از پروموتورهايT7، T3 يا SP6 كه در نزديك DNA كلون‌‌شده در يك Vector مناسب قرار دارند، تهيه مي‌شوند. معمولاً از پلاسميد Bluescript كه پروموتورهاي T3 و T7 در دو طرف MCS آن قرار دارند، استفاده مي‌شود (قطعه پروب بايد در پلاسميد Bluescript.sk كلون شده باشد). براي تهيه Riboprobe، پلاسميد نوتركيب را توسط يك Restriction Enzyme مناسب برش داده تا به‌صورت خطي دربيايد و برحسب اينكه قطعه كلون‌‌شده در Downstream كداميك از پروموتورها قرار گرفته باشد، پروموتور را توسط polymeraseRNA اختصاصي آن فعال كنيد تا از قطعه DNA كلون‌‌شده در پلاسميد از طريق RUNoff Synthesis در لوله آزمايش، RNA سنتز شود.
براي تهيه ريبـــــــــوپروب از كيت (RNA Labeling and Detection Kit) شــركـت Roche Molecular Biochemicals استـــــفاده مي‌شــــــــود. ايــــــن كيت از طريق Run Off Synthesisاز DNA معيني كه در پلاسميد مخصوصي كلون شده است (الگو) RNA را سنتز می‌کــــند. به ازاي هر 25-20 نوكلئوتيد، يك مولكول Digoxigenin–11–UTP وارد رشته مي‌شود. چون براي سنتز محدوديتي وجود ندارد، مقدار زيادي RNA ساخته می‌شود. در شرايط استاندارد از هر يك ميكروگرم DNA در حدود 10 ميكروگرم RNA رونويسي می‌شود. Riboprobeهايي كه با اين روش سنتز مي‌شوند داراي خواص زير هستند:
ـ داراي طول معيني بوده و اختصاصي و تكرشتهاي مي‌باشند.
– شبيه DNAprobe ها به يكديگر متصل نمي‌شوند.
ـ اتصال Dig به UTP نسبت به NaOH مقاوم می‌باشد.
روش كار:
ـ مقدار 2ـ1 ميكروگرم DNA را توسط Restriction Enzyme مناسب هضم (digest) كنيد.
ـ بعد از اتمام واكنش آن را P.C.Iextraction كرده سپس با الكل رسوب دهيد (هرگز از RNase استفاده نكنيد).
-2 ميكروليتر NTP به واكنش اضافه كنيد.
– 2 ميكروليتر 10X Transcription Buffer را به آن اضافه كنيد.
ـ 1 ميكروليتر (T3,T7) RNA polymerase را به آن اضافه كنيد.
– حجم واكنش را با آب مقطر به 20 ميكروليتر برسانيد.
– 1 ميكروليتر RNasin (مهاركننده RNase ) به واكنش اضافه كنيد تا از فعاليت RNase احتمالي در واكنش جلوگيري كند.
– لوله را مختصري سانتريفيوژ (quick spin) نموده و 2ـ1 ساعت در 37 درجه قرار دهيد.
– واكنش را با EDTA متوقف نموده و براي رسوب دادن RNA از LiCl با غلظت نهایي M0.5 استفاده كنيد.
– بعد از شستشو با الكل 70، رسوب را در 100 ميكروليترDEPC treated water حل كنيد.
– مقدار 1 ميكروليتر RNasin به آن اضافه كرده و 30 دقيقه در 37 درجه انكوبه كنيد.
– كميت پروب توليد‌شده شبيه DNA probe تعيين می‌شود فقط براي تهيه بافر II از DEPCtreated water استفاده شود
– از RNA نشاندارشده موجود در كيت براي مقايسه پروب‌ها استفاده كنيد.
Hybridization
در اينجـــا براي هيبـــــــــريديزاسيــــــــــون دو روش Dot blot hybridization و Southern blot hybridization توضیح داده می‌شود.
روش دات بلات
ـ از DNA (قطعات DNAكلون‌‌شده) رقت سريال تهيه كنيد و روي Nylon membrane لكه‌گذاري انجام دهيد (Dot bloting).
– مدت 5 دقيقه غشای نايلوني را در محلول Denaturing قرار دهيد تا DNA دناتوره شود.
(لازم به ذكر است كه نايلون نبايد در محلول شناور گردد، بلكه بايد ته ظرف يا سيني يك لايه كاغذ خشككن قرار داده شود، سپس محلول را روي كاغذ ريخته بطوري كه فقط كاغذ خيس شود و سپس نايلون را روي آن قرار دهيد.)
ـ 5 دقيقه غشا را مانند مرحله قبل در محلول Neutralizing قرار دهيد تا غشا خنثي شده و از شكنندگي آن جلوگيري شود.
– غشا را روي كاغذ خشككن قرار داده و هنگاميكه هنــــــــــــــوز مرطــوب اســــت DNA را با UV CrossLinker روي آن ثابت كنيد.
ـ غشا در اين مرحله آماده است، هم مي‌توان براي مدتي آن را نگهداري نمود و هم مي‌توان پروسه Hybridization را دنبال نمود.
روش ساترن بلات
DNA را با آنزيم‌هاي Restriction مناسب هضم كنيد و سپس آن را الكتروفورز نماييد. ظرفيت اتصال اسيدهاي نوكلئيك به غشای نايلوني 500 ميكروگرم در هر سانتيمترمربع است و براي فيلتر نيتروسلولز صد ميكروگرم در هر سانتيمترمربع می‌باشد.
– وقتي الكتروفورز انجام شد، ژل را با UV مشاهده كرده و براي جلوگيري از هدر رفتن مواد، قسمت‌هایي از ژل را كه مورد استفاده نيست، حذف كنید (ژل را Trim كنيد).
– گوشه‌ی (يكي از گوشه‌های) ژل را علامت‌گذاري كرده و سپس 90 دقيقه در حرارت اتاق آن را داخل محلول Denaturing دوران دهيد تا DNA دناتوره شود (NNaOH0.4)، البته DNAهاي سنگيــــن‌تر از kb 15 را بايد با محلول 0.25 مولار اسيد كلريدريك Depurinate نمود تا بتوانند از ژل روي غشا منتقل شوند (اين كار همراه باshaking انجام شود).
– واكنش را 20 دقيقه در حرارت اتاق در محلول Neutralizing قرار دهيد (همراه با shaking انجام گيرد).
– غشا (Nylonmembrane) را به اندازه ژل بريده و گوشه آن را مانند ژل علامت‌گذاري كرده و سپس در آب ديونيزه آن را خيس كنيد.
– بعد از آماده كردن تانك انتقال (Transfer Tank)، يك قطعه كاغذ صافي روي سيني تانك قرار دهيد.
– كاغذ صافي را حتماً با بافر تانك خيس كنيد كه حباب هوا در آن قرار نگيرد.
– يك لايه كاغذ واتمن MM3 روي آن قرار دهيد بطوري كه دو سر كاغذ در بافر تانك قرار گيرد.
– ژل را بصورت وارونه (نسبت به موقعي كه الكتروفورز می‌شود) روي كاغذ واتمن قرار داده، بطوري كه زير ژل حباب هوا قرار نگيرد.
– نايلون آماده شده را روي ژل قراردهيد، بطوري كه هوا زير آن نفوذ نكند.
ـ يك لايه كاغذ واتمن روي فيلتر قرار دهيد.
– اطراف آن را با پارافيلم خوب بپوشانيد.
ـ يك لايه كاغذ صافي و سپس چندين لايه كاغذ خشككن روي آن قرار دهيد بطوري كه مايع را جذب كند.
– يك صفحه شيشه‌اي روي آن قرار دهيد و يك وزنه 500 گرمي روي شيشه مستقر كنيد.
– اطراف تانك را با نايلون بپوشانيد كه تبادل هوا با خارج انجام نگيرد و از تبخير بافر تانك ممانعت نمايد.
– براي بافر تانك از محلول N0.4 NaOH استفاده كنيد، زيرا براي Nylon بهتر از كاغذ نيتروسلولز می‌باشد و موجب دناتوره شدن و ثابت شدن DNA روي نايلون می‌شود.
– مدت 24ـ4 ساعت در هواي اتاق قرار دهيد.
– نايلون را خارج كرده و با X2 SSC بشویيد تا ذرات ژل از روي آن حذف شوند.
– وقتي نايلون هنوز نمدار است، DNA را با دستگاه UV Crosslinker روي آن ثابت كنيد.
Prehybridization (دات بلات يا ساترن بلات)
ـ غشا را داخل كيسه پلاستيكي (Hybridizationbag) قرار داده و مقدار 20ml/100cm2 محلول Prehybridization را داخل كيسه ريخته و سپس آن را خوب درزگيري كنيد، بطوري‌كه مايع از آن نفوذ نكند (seal شود).
ـ مدت 2- 1/5 ساعت در 42 درجه سلسیوس قرار دهيد (براي ريبوپروب حرارت 50 درجه در نظر گرفته شود).
ـ پروب را مدت 5 دقيقه درآب جوش قرار داده تا دناتوره شود.
– بلافاصله روي يخ حاوي نمك قرار دهيد.
ـ يكي از گوشه‌‌هاي كيسه پلاستيكي حاوي nylon را بريده و آن را روي كاغذ خشككن قرار داده و با چرخاندن يك مداد يا ميله شيشه‌اي گرد روي آن، محلول Prehybridization را از آن خارج كنيد.
– مقدار 2.5ml/100cm2 پروب مخلوط‌شده با محلول Hybridization را وارد كيسه كنيد.
– هواي آن را خارج كرده، دوباره آن را seal كنيد.
– به مدت يك شب آن را در 42 درجه قرار دهيد (براي ريبوپروب 50 درجه).
Post hybridization:
– نايلون را از كيسه خارج كنيد.
– مدت 5 دقيقه با محلول SSC2X ,1% SDS همراه Shaking در حرارت اتاق، نايلون را بشوئيد.
– مدت 15 دقيقه با محلولSSC2X ,1% SDS آن را بشوئيد (RT)
– مدت 30 دقيقه با محلول SSC2X ,1% SDS در65 درجه شستشو دهيد.
– Detection آن شبيه پروب انجام می‌گیرد.
هيبريديزاسيون با Riboprobe:
– مراحل blot Dot يا blot Southern شبيه DNA پروب انجام می‌گیرد.
ـ دمايHybridization را 50 درجه درنظر بگيريد.
– بهتر است پروب (RNA) را هنگام استفاده به‌مدت 5 دقيقه در آب جوش قرار دهيد تا چنانچه RNA لوپ (Loop) تشكيل داده است، باز شود.
ـ مراحل شستشو و Detection نيز شبيه DNA انجام می‌گیرد.
ـ بايد دقت نمود كه حين پروسه كار، RNase وارد محيط نشود و از تماس دست با وسايل كار و نمونه خودداري شود.
– حتماً از دستكش استفاده كنيد.
– وسايل شيشه‌اي، تيوب‌ها و محلول‌ها را بايد از آلوده شدن با RNase محافظت نمود.
– مواد و وسايل كار با RNA بايد از وسايل و مواد ديگر جدا باشند. وسايل شيشه‌اي بعد از شستشو بايد در محلول 0/1 درصد DEPC شناور شوند و سپس اتوكلاو گردند و بعد از آن بمدت 3 ساعت در 250 درجه قرار گيرند.
تيوب‌ها، لوله‌هاي سانتريفيوژ و لوله‌هاي فالكون فاقد RNase هستند، ولي بايد اتوكلاو شوند.
DEPC ماده مهاركننده غيراختصاصي ريبونوكلئاز است که با آدنين موجود در RNA واكنش می‌دهد.
تهيه formamide Deionized
يكي از مشكلات درHybridization Riboprobe ، تجزيه شدن RNA توسط آلوده‌كننده‌هاي موجود در Formamideاست، براي جلوگيري از اين عمل بايد فرماميد ديونيزه شود.
روش كار:
– براي ديونيزه كردن فرماميد، رزين (lonexchanger) موردنیاز است. از كاتيون (Carboxymethyl) و آنيون (Diethylaminoethyl) DEAE استفاده می‌شود.
– كاتيون و آنيون (از هر كدام 5 گرم) جداگانه بايك ليتر آب Equilibrate مي‌شوند. بعد از مخلوط شدن، محلول ابري مانند تشكيل مي‌گردد. اين محلول را با دستگاه فيلتراسيون در خلأ، فيلتر (كاغذ صافي واتمن) كرده تا آب رزين خارج شده و رزين روي فيلتر باقي بماند و خشك شود، سپس با يك ليتر فرماميد 30 دقيقه روي همزن مي‌چرخد تا خوب مخلوط شود. محلول دوباره با دستگاه فيلتراسيون در خلأ با كاغذ صافي واتمن فيلتر می‌شود، بطوري كه يك محلول صاف تشكيل گردد. اين محلول Deionized در يخچال نگهداري می‌شود.
طرز تهيه بافرها:
الف) بافرهاي Detection (ظهور):
1- بافر I:
Tris (PH:7.5) 100mM
NaCl 500 mM
2- بافر II:
( BSA (blocking reagent1-3% كه در بافر I، حدود 65درجه حرارت داده می‌شود تا حل گردد.
3- بافر III:
Tris (pH:9.5) 100 mM
NaCl 100 mM
MgCl2 50 mM
ب) بافرهاي Hybridization:
1- بافرPre hybridization:
Deionized formamide 50%
SSC5X
Denhardts5X
SS DNA 125mg/ml
Phosphate buffer 50mM
2- بافرHybridization :
Deionizedformamide 50%
SSC5X
Denhardts 1X
Phosphatbuffer 20 mM
SSDNA 25 mg/ml
Dextran sulfate 10%
3- محلول Denhardts:
BSA 1%
Ficoll 1%
Polyvinyl pyrolidone 1%
4- بافر20X SSC :
NaCl 3M
NaCitrate 3M
pH: 7
لكه‌گذاري Southern
براي انجام عمل هيبرايداسيون لازم است كه علاوه بر قطعه كاوشگر، قطعات DNA هضم‌شده نيز تك رشته‌اي شوند، لذا ابتدا DNA روي ژل آگارز كه حاوي قطعات هضم‌شده است در محلول‌هاي قليایي مثل اوره يا فرمالدئيد يا هيدروكسيد سديم تك‌رشته مي‌نمايند. سپس صفحه‌اي از غشاء نيترو سلولزي را روي قسمت فوقاني ژل قرار داده و روي آن غشاء مقداري كاغذ جاذب‌الرطوبه مي‌گذارند. محلول بافر تانك الكتروفوزر بوسيله فشار اسمزي كاغذ فوقاني بالا كشيده می‌شود و حين عبور از ژل به غشاء نيتروسلولزي كه داراي بار مثبت است منتقل مي‌گردد. با تسهيل عمل هيبريداسيون بين كاوشگر و قطعات DNA هضم‌شده در معرض پروب نشاندار راديواكتيو در نقاطي كه همولوژي وجود دارد، هيبريد مي‌گردد. قطعاتي كه هيبريداسيون در آنها صورت نگرفته است از محيط شسته مي‌شوند و سپس از غشاي نيترو سلولزي در مجاورت فيلم عكاسي اتوراديوگرافي بعمل مي‌آيد، پس از ظهور و ثبوت فيلم قطعات ويژه‌اي از DNA كه با پروب هيبريد هستند به‌صورت يک باند مرئي ديده می‌شود.
روش دورگه‌گیری فلورسنت درجا[7]
این تکنیک قادر است محل یک نشانگر[8] را روی کروموزوم یا مولکول DNA گسترش‌یافته، مستقیماً قابل رؤیت کند. در تکنیک FISH، نشانگر، یک توالی DNA است و به‌وسیله دورگه شدن یک کاوشگر[9] فلورسنس با آن قابل رؤیت می‌باشد.
در تعدادی از تکنیک‌های بیولوژی مولکولی، از دورگه شدن اسید نوکلئیک و توانایی دو مولکول اسید نوکلئیک مکمل یا نسبتاً مکمل، برای تشکیل یک جفت باز هیبرید پایدار استفاده می‌کنند. دورگه‌سازی DNA/DNA امکان تعیین و تشخیص موقعیت و فراوانی توالی DNA را فراهم می‌سازد که این عمل از طریق دورگه‌سازی بین یک کاوشگر DNA) تک‌رشته یا RNA نشاندارشده) و DNA هدف موجود در سطح نمونه‌های میکروسکوپی (اسلاید)، کروموزوم، هسته یا رشته‌های DNA تحقق می‌یابد، همچنین از این روش می‌توان در نقشه‌یابی فیزیکی توالی‌های موجود در سطح کروموزوم‌ها (شامل طبقه‌بندی و طراحی کاوشگرها و بررسی همسانه‌های کایمریک)، شناسایی و تشخیص کروموزوم‌ها یا قطعات کروموزوم و فراهم کردن شاخص‌هایی برای تشخیص بازآرایی‌های ژنومی استفاده کرد.
دورگه‌گیری درجا[10] نمونه‌ای از این تکنیک‌های دورگه‌سازی است که در آن یک کروموزوم بی‌عیب و دست‌نخورده به‌وسیله کاوشگر مورد مطالعه قرار می‌گیرد. توالی محل ایجاد دورگه، مشابه توالی کاوشگر مورد استفاده می‌باشد. برای انجام این تکنیک ابتدا باید DNA دورشته‌ای کروموزوم، واسرشت شود. تنها در این حالت است که DNA کروموزومی می‌تواند با کاوشگر دورگه شود. روش استاندارد برای واسرشت کردن DNA کروموزومی بدون تغییر شکل کروموزوم، خشک کردن محصولات به‌دست آمده روی شیشه اسلاید میکروسکوپی و مواجه کردن آن با فرمامید است.
در روش‌های اولیه دورگه‌گیری درجا، کاوشگر به‌صورت رادیواکتیو نشاندار می‌شد، اما این فرایند رضایت‌بخش نبود، زیرا با این روش نمی‌توان هم حساسیت و هم تجزیه که دو عامل مهم در این تکنیک هستند را کسب کرد. برای رسیدن به حساسیت بالا، باید ماده رادیواکتیو پرتوهایی با انرژی بالا داشته باشد (مثل P32)؛ اما اگر ماده رادیواکتیو انرژی بالایی از خود ساطع کند، پیغام‌های[11] خود را پخش کرده و تجزیه خوبی نمی‌دهد. تجزیه بالا زمانی حاصل می‌شود که پرتوهای ساطع شده از ماده رادیواکتیو انرژی پایینی داشته باشند (مثل H3). در این حالت نیز حساسیت پایین است و آزمایش نیاز به مواجهه زیادی دارد و منجر به مشکلاتی در مشاهده و تشخیص علائم اصلی می‌گردد.
در اواخر دهه 1980، با توسعه نشانگرهای فلورسنس و غیررادیواکتیو، این مشکلات رفع شد. نشانگرهای مذکور ترکیبی از حساسیت بالا و قدرت تفکیک بالا را داشته و برای دورگه‌گیری درجا ایده‌آل هستند. ماده فلوئوفور با رنگ‌های مختلف وجود دارد، بنابراین دورگه‌گیری همزمان با چندین نشانگر امکان‌پذیر خواهد شد. برای به حداکثر رساندن حساسیت، کاوشگر باید تا حد امکان با مقدار زیادی از ماده فلورسنس نشاندار شود؛ به عبارت دیگر چگالی ماده فلوئوفور در کاوشگر باید بیشترین مقدار ممکن باشد.
در این تکنیک امکان دارد از کاوشگرهای بزرگ استفاده شود. اشکال این کاوشگرهای بزرگ در این است که می‌توانند به نقاط تکراری و غیراختصاصی ژنوم متصل شوند. برای کاهش اتصال کاوشگر به نقاط غیراختصاصی، ابتدا کاوشگر را با مقداری از نمونه DNA مورد بررسی مخلوط می‌کنند. این نمونه DNA می‌تواند DNA ژنومی‌باشد، اما بهتر است از قطعه‌ای که غنی از توالی تکراری است، استفاده گردد. پس از این مرحله مخلوط‌سازی، نمونهDNA به توالی‌های تکراری کاوشگر، متصل شده و دورگه‌گیری اختصاصی کاهش یافته یا از بین می‌رود.
کاربرد FISH
FISH با قدرت تفکیک پایین
این تکنیک با استفاده از کروموزوم‌های متراکم انجام می‌شود. این کروموزوم‌ها از هسته سلول‌های در حال تقسیم تهیه شده‌اند که بسیار متراکم هستند و محل سانترومر و الگوی باند آنها بعد از رنگ‌آمیزی تقسیم تهیه شده‌اند که بسیار متراکم بوده و محل سانترومر و الگوی باند آنها بعد از رنگ‌آمیزی کروموزوم مشخص است. اشکال این تکنیک، قدرت تفکیک پایین آن است که به علت تراکم شدید کروموزوم حاصل می‌شود. اگر از چند کاوشگر استفاده می‌شود، باید فاصله بین هرکدام از آنها حداقل یک مگاباز باشد تا به‌عنوان یک پیغام مجزا مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد. این حد تفکیک معمولاً مناسب نیست؛ به همین علت تکنیک FISH با قدرت تفکیک بالا ابداع شد.
FISH با قدرت تفکیک بالا
قدرت تفکیک تکنیک FISH به نحوه آماده‌سازی کروموزوم‌های مورد بررسی بستگی دارد. برای افزایش قدرت تفکیک از کروموزوم‌های گسترده استفاده می‌شود. برای این کار دو راه وجود دارد:
1- کروموزوم‌هایی که به‌صورت مکانیکی کشیده شده‌اند: این نوع کروموزوم‌ها را می‌توان با اصلاح روش آماده‌سازی کروموزوم‌های جداشده از هسته متافاز به‌دست آورد. عمل سانتریفیوژ می‌تواند منجر به کشیدگی کروموزوم به اندازه 20 برابر طول طبیعی آن شود. به این طریق، قدرت تفکیک به‌طور قابل‌توجهی افزایش می‌یابد و نشانگرهایی که حدود 300-200 کیلوباز از هم فاصله دارند، تشخیص داده می‌شوند.
2- کروموزوم‌های غیرمتافازی: در روش FISH، کروموزوم‌های غیرمتافازی نیز می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند، چون تنها در طی مرحله متافاز است که کروموزوم‌ها بیشترین تراکم را دارند. کروموزوم‌ها در مراحل دیگر چرخه سلولی به‌طور طبیعی متراکم نیستند. امروزه بیشتر، استفاده از هسته پروفاز موردنظر است. در این مرحله کروموزوم‌ها به اندازه‌ای متراکم هستند که هرکدام به‌تنهایی قابل تشخیص می‌باشند. در عمل، این روش مزیتی نسبت به روش گستردگی مکانیکی کروموزوم‌ها ندارد. استفاده از کروموزوم‌های اینترفازی بیشتر متداول است. در این مرحله از چرخه سلولی، کروموزوم‌ها منقبض نیستند. با این روش قدرت تفکیک تا 25 کیلوباز افزایش می‌یابد، اما شکل کروموزومی از دست می‌رود.
[1]Probe
[2]Restriction enzyme site
[3]Synthetic oligonucleotids
[4]Clones
[5]Chromosomal In Situ Suppression(CISS)
[6]Synthetic oligonucleotides
[7]Fluorescent In Situ Hybridization(FISH)
[8]Marker
[9] Probe
[10]In Situ Hybridization
[11]Signals
مقدمه‌ای بر تکنیک PCR در زمان واقعی و انواع آن
اساس کار و انواع روش‌های وسترن بلات (Western Blotting)
برای دانلود پی دی اف برروی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام