سجّاد بختیاری
کارشناس علوم آزمایشگاهی
کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی
دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی
چکیده:
هموگلوبین A1c (HbA1c) از آنجا که مستقیماً با خطرات عوارض دیابت مرتبط است، به‌طور معمول برای نظارت طولانی مدت قند خون در افراد مبتلا به دیابت شیرین استفاده می‌شود. صحت اندازه‌گیری HbA1c ممکن است تحت تأثیر وجود واریانت‌های هموگلوبین (Hb) یا سطوح بالا هموگلوبین جنینی (HbF) قرار گیرد. اثر هر واریانت یا HbF افزایش یافته باید در مورد هر روش خاص بررسی شود.
رایج‌ترین واریانت‌های Hb در سراسر جهان HbS، HbE، HbC و HbD است. همه این واریانت‌ها متعاقب جایگزینی یک اسید آمینه در زنجیره β هموگلوبین هستند. HbF هموگلوبین اصلی در طول زندگی داخل رحمی است. در پایان سال اول زندگی، HbF به مقادیر نزدیک به سطح بزرگسالان (تقریباً 1%) کاهش می‌یابد. با این حال، افزایش مقدار HbF ممکن است در شرایط خاص پاتولوژیک یا در تداوم ارثی هموگلوبین جنینی (HPFH) رخ دهد. طی سال‌های گذشته در برخی مقالات، اثرات این چهار واریانت رایج Hb و افزایش HbF شرح داده شده است.
با برخی روش‌ها تداخل بالینی قابل‌توجهی برای هر یک از این واریانت ها وجود دارد. در ادامه خلاصه‌ای ارائه شده که نشان می‌دهد کدام روش‌ها تحت تأثیر حضور واریانت‌های هتروزیگوت S، E، C و D و HbF افزایش یافته قرار می‌گیرند. روش‌ها بر اساس نوع (ایمونواسی، کروماتوگرافی تبادل یونی مایع با کارایی بالا، بورونات افینیتی و غیره) با مشخص کردن اینکه آیا نتیجه به‌طور کاذب با وجود یک واریانت Hb افزایش یا کاهش می‌یابد، تقسیم می‌شوند. آزمایشگاه‌ها با توجه به این تداخلات، باید از محدودیت‌های روش خود آگاه باشند.
مقدمه:
هموگلوبین گلیکه (GHB) که به عنوان هموگلوبین A1c شناخته می‌شود، یک مارکر بیوشیمیایی است که به‌طور معمول در مدیریت افراد مبتلا به دیابت شیرین برای نظارت طولانی مدت قند خون و ارزیابی خطرات ابتلا به عوارض آن استفاده می‌شود. مطالعه کنترل دیابت و عوارض آن (DCCT) و مطالعه آینده‌نگر دیابت بریتانیا (UKPDS) به‌طور قطعی نشان داد که خطرات عوارض دیابت به‌طور مستقیم با کنترل قند خون که توسط HbA1c اندازه‌گیری می‌شود، مرتبط است. بسیاری از سازمان‌های دیابت در سرتاسر جهان، تارگت‌های اختصاصی برای HbA1c از نظر DCCT/UKPDS HbA1c را پیشنهاد می‌کنند. برنامه ملی استانداردسازی گلیکوهموگلوبین (NGSP) به منظور استانداردسازی نتایج GHB/HbA1c ایجاد شد تا نتایج آزمایشگاه بالینی با نتایج گزارش شده توسط DCCT قابل مقایسه باشد. با این حال، وجود واریانت‌های هموگلوبین می‌تواند بر صحت چندین روش اندازه‌گیری HbA1c تأثیر منفی بگذارد. NGSP شامل ارزیابی تداخلات به عنوان بخشی از برنامه صدور گواهینامه نمی‌شود.
هموگلوبین (Hb) از چهار زنجیره گلوبین تشکیل شده است. هموگلوبین بالغین (HbA) فراوان‌ترین شکل در اغلب بزرگسالان است که از دو زنجیره α و دو زنجیره β تشکیل شده است. هموگلوبین جنینی (HbF) که هموگلوبین غالب در هنگام تولد است، از دو زنجیره α و دو زنجیره γ تشکیل شده است. این هموگلوبین، به مقدار جزئی در بزرگسالان طبیعی است. HbA2 هموگلوبین جزئی پس از تولد است که از دو زنجیره α و دو زنجیره δ تشکیل شده است. شایع‌ترین واریانت‌های Hb در سراسر جهان به ترتیب نزولی، HbS، HbE، HbC و HbD هستند. همه این هموگلوبین‌ها دارای یک جایگزینی اسید آمینه در زنجیره β خود هستند. در ایالات متحده، HbC دومین و HbE سومین واریانت شایع است. نشان داده شده است که وجود HbS یا HbC هتروزیگوت بر صحت برخی از سنجش‌های HbA1c اثرگذار است. HbE عمدتاً در افراد اهل آسیای جنوب شرقی یافت می‌شود. HbD پنجاب بیشتر در منطقه پنجاب هند یافت می‌شود. تخمین زده شده که در سال 2000، 171 میلیون فرد مبتلا به دیابت در جهان وجود داشته است که این تعداد در سال 2030 به 366 میلیون نفر افزایش خواهد یافت. همچنین تخمین زده می‌شود که حدود 7 درصد از جمعیت جهان، ناقلان هتروزیگوت اختلالات هموگلوبین هستند. در سال 2000، حدود 12 میلیون فرد مبتلا به دیابت در سراسر جهان به اختلالات هموگلوبین مبتلا بودند. پیش‌بینی می‌شود تا سال 2030 این تعداد به 26 میلیون افزایش یابد. این برآوردها اگرچه خام هستند، اهمیت بالقوه این موضوع جهانی را نشان می‌دهند. HbS هموزیگوت باعث یک بیماری جدی (کم‌خونی داسی شکل) به همراه انسداد عروقی و در نتیجه انفارکتوس بافتی می‌شود. غلظت هموگلوبین در مبتلایان به بیماری HbC (که بیماری HbCC نیز نامیده می‌شود) ممکن است طبیعی باشد یا کم‌خونی خفیف یا متوسط داشته باشند. افراد مبتلا به بیماری HbSC (که بیماری داسی هموگلوبین C نیز نامیده می‌شود) ممکن است به‌طور خفیف یا متوسط به کم‌خونی همولیتیک مزمن مبتلا شوند. افراد مبتلا به بیماری هموزیگوت HbE (که بیماری HbEE نیز نامیده می‌شود) معمولاً کاملاً بدون علامت هستند و مبتلایان به بیماری HbD پنجاب ممکن است همولیز خفیف و گاهی اوقات کم‌خونی همولیتیک خفیف داشته باشند. افراد هتروزیگوت برای هر یک از این واریانت‌های Hb معمولاً بدون علامت و دارای گلبول‌های قرمز طبیعی هستند؛ بنابراین، پزشک ممکن است از اینکه بیمار مبتلا به دیابت، یکی از این واریانت‌ها را به شکل هتروزیگوت داشته باشد، بی‌اطلاع باشد.
از آنجایی که اندازه‌گیری HbA1c به طول عمر طبیعی گلبول‌های قرمز بستگی دارد، توصیه می‌شود در افراد مبتلا به بیماری سلول داسی شکل، HbC یا HbD از آزمایش‌های دیگری برای برآورد قند خون استفاده شود. با توجه به اینکه بقای گلبول‌های قرمز در افراد دارای واریانت‌های هتروزیگوت طبیعی است، تا زمانی که واریانت Hb با خود روش سنجش یا اتصال گلوکز به Hb تداخلی نداشته باشد، می‌توان از آن برای اندازه‌گیری HbA1c استفاده کرد. وجود برخی از واریانت‌ها ممکن است بر بار خالص هموگلوبین و یا شناسایی N-ترمینال گلیکه شده توسط آنتی‌بادی‌ها تأثیر بگذارد و در برخی از روش‌ها مقادیر نادرست HbA1c ایجاد شود؛ بنابراین، تأثیر هر واریانت باید با هر روش خاص اندازه‌گیری HbA1c بررسی شود. اثرات احتمالی اداکت‌های هموگلوبین مانند Hb استیله یا کربامیله در این مقاله بررسی نمی‌شود.
انواع روش‌های اندازه‌گیری HbA1c
گلیکاسیون، اضافه شدن غیر آنزیمی گلوکز به گروه‌های آمین پروتئین‌ها است. HbA1c یک هموگلوبین گلیکه است که در آن گلوکز به‌طور اختصاصی به N-ترمینال والین زنجیره β هموگلوبین متصل می‌شود. HbA1c بخش عمده‌ای از هموگلوبین‌های گلیکه را تشکیل می‌دهد. برخلاف سایر فراکسیون‌های هموگلوبین گلیکه، HbA1c را می‌توان به راحتی بر اساس تفاوت در بار خالص جدا کرد. GHB تام اصطلاحی است که برای اشاره به همه گونه‌های گلیکه Hb استفاده می‌شود. GHB تام از HbA1c و Hb متصل به گلوکز در سایر جایگاه‌ها تشکیل شده است؛ از جمله گلیکاسیون N-ترمینال زنجیره α و گلیکاسیون گروه‌های آمین ε باقیمانده‌های لایزین. GHB تام با کروماتوگرافی تمایلی قابل اندازه‌گیری است.
چهار روش اصلی معمولاً برای اندازه‌گیری HbA1c استفاده می‌شود: ایمونواسی، کروماتوگرافی تبادل یونی مایع با کارایی بالا، HPLC بورونات افینیتی و سنجش آنزیمی. ایمونواسیها اغلب HbA1c را به‌طور اختصاصی اندازه‌گیری می‌کنند. آنتی‌بادی‌ها ساختار N ترمینال اسیدهای آمینه گلیکه (معمولاً 10-4 اسید آمینه اول) زنجیره β هموگلوبین را شناسایی می‌کنند. HPLC تبادل یونی گونه‌های Hb را بر اساس تفاوت بار بین HbA1c و سایر هموگلوبین‌ها جدا می‌کند. در روش‌های بورونات افینیتی، m-amino phenyl boronic acid به‌طور اختصاصی با گروه‌های Cis-Diol گلوکز متصل به Hb واکنش می‌دهد. این روش، GHB تام از جمله HbA1c و Hb گلیکه در سایر جایگاه‌ها را اندازه‌گیری می‌کند و کمترین تداخل را در حضور واریانت‌ها و مشتقات Hb نشان می‌دهد. روش آنزیمی موجود در حال حاضر، HbA1c را با استفاده از آنزیمی که N ترمینال والین را برش می‌دهد، اندازه‌گیری می‌کند.
هموگلوبین S ,C ,E و D
هموگلوبین داسی شکل یا HbS دارای جایگزینی والین به‌جای اسید گلوتامیک در موقعیت 6 زنجیره β است. HbC یک جهش متفاوت (لایزین به‌جای اسید گلوتامیک) در همان موقعیت جهش سلول داسی در زنجیره β دارد. HbE دارای جایگزینی لایزین به‌جای اسید گلوتامیک در موقعیت 26 زنجیره β و HbD پنجاب (همچنین HbD لس‌آنجلس نیز نامیده می‌شود)، دارای جایگزینی گلوتامین به‌جای اسید گلوتامیک در موقعیت 121 زنجیر β است. از آنجایی که واریانت‌های S و C به N ترمینال زنجیره β نزدیک هستند، برخی از ایمونواسیها تحت تأثیر حضور این واریانت‌ها قرار می‌گیرند. با این حال، وجود HbE یا HbD با جهش‌های بسیار دورتر در زنجیره β معمولاً بر روش‌های ایمونواسی تأثیر نمی‌گذارد. وجود هر یک از این چهار واریانت بر بار یونی مولکول Hb تأثیر می‌گذارد و بسته به اینکه واریانت Hb چقدر از HbA جدا شده است ممکن است در روش‌های تبادل یونی تداخل ایجاد کند. از آنجایی که کروماتوگرافی بورونات افینیتی، هموگلوبین تام گلیکه را از هموگلوبین غیرگلیکه جدا می‌کند، صرف نظر از گونه‌های هموگلوبین، به‌طور کلی هیچ تداخلی از سوی اکثر واریانت‌های Hb از جمله HbS، C، E و D وجود ندارد.
HbF افزایش یافته
هموگلوبین F هموگلوبین اصلی در طول زندگی داخل رحمی شامل دو زنجیره α و دو زنجیره γ است. در بدو تولد، مقدار HbF بین 60 تا 95 درصد است. طی سال اول زندگی، درصد HbF به مقادیر نزدیک به بزرگسالان کاهش می‌یابد. به‌طور کلی، حد بالای نرمال در بزرگسالان 1٪ در نظر گرفته می‌شود. افزایش مقدار HbF ممکن است در بیماران به دلیل شرایط پاتولوژیک (مانند لوسمی، کم‌خونی، تالاسمی) یا HPFH رخ دهد. در افراد مبتلا به تداوم ارثی هموگلوبین جنینی، سطح HbF ممکن است تا 30 درصد باشد و از آنجایی که آن‌ها عموماً بدون علامت هستند، بیماران و پزشکان آن‌ها ممکن است از وجود این عارضه بی‌اطلاع باشند. از آنجایی که HbF زنجیره β ندارد، در روش مرجع IFCC که فقط هگزاپپتیدهای انتهایی HbA را اندازه‌گیری می‌کند، تداخلی ایجاد نمی‌کند. اکثر روش‌های HPLC تبادل یونی، HbF طبیعی را به صورت یک قله مجزا جدا می‌کنند؛ برخی از این روش‌ها (همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است) همچنین می‌توانند HbF را در صورت افزایش سطح جداسازی کنند.
جدول 1. تداخل واریانت‌های هتروزیگوت S,C,D و E و HbF افزایش یافته با برخی متدهای اندازه‌گیری HbA1c
a علامت ↑ یا ↓ نشان‌دهنده افزایش یا کاهش کاذب نتایج است.
b بررسی نشده است.
c مقادیر HbF بالای 15 درصد باعث سوگیری کم بالینی می‌شود.
d اگر قله HbF به اشتباه به عنوان HbA1c (LA1C) Labile نام‌گذاری شده باشد، محاسبه مجدد دستی آفلاین باید انجام شود.
تداخل HbAS، AC، AE و AD و HbF افزایش یافته
نتایج مطالعات در مورد HbS، C، E و D و HbF افزایش یافته در جدول 1 خلاصه شده است. روش‌ها بر اساس نوع (ایمونواسی، HPLC تبادل یونی، بورونات افینیتی و آنزیمی) گروه‌بندی شده و به ترتیب حروف الفبا توسط سازنده فهرست شده‌اند. همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، برای هر یک از واریانت‌ها تداخل بالینی قابل‌توجهی در برخی روش‌ها وجود دارد. همچنین مهم است که خطرات احتمالی ارسال یک نتیجه نادرست به دلیل تداخل واریانت Hb در نظر گرفته شود. روش‌های ایمونواسی معمولاً نتیجه‌ای بدون هیچ نشانه‌ای از تداخل احتمالی ارائه می‌دهند، مگر اینکه نتیجه خارج از محدوده بالینی باشد. متأسفانه، تداخل واریانت‌های Hb همیشه به اندازه‌ای نیست که این نگرانی‌ها را ایجاد کند، اما ممکن است به اندازه‌ای باشد که باعث درمان اشتباه شود. این نوع تداخل مربوط به HbS و HbC در چند روش ایمونواسی نشان داده شده است. خوشبختانه، هیچ تداخلی از سوی واریانت‌های D یا E هموگلوبین با هیچ‌یک از روش‌های ایمونواسی مورد ارزیابی، مشاهده نشده است.
تداخل ناشی از واریانت‌های Hb با استفاده از روش‌های HPLC تبادل یونی معمولاً در کروماتوگرام ها قابل تشخیص است. نتایج بسته به روش مورد استفاده ممکن است افزایش یا کاهش یافته باشند. برای کاربران این روش‌ها مهم است که از این تداخلات آگاه باشند و بدانند برای تصمیم‌گیری در مورد قابل قبول بودن یا نبودن نتیجه، به دنبال چه چیزی در کروماتوگرام باشند. در اکثر (و نه همه) موارد در صورت رعایت دقیق دستورالعمل‌های سازنده، می‌توان از گزارش نتایج نادرست جلوگیری کرد. با این حال در مورد برخی از روش‌ها، دستورالعمل‌های سازنده به‌تنهایی اطلاعات کافی برای تصمیم‌گیری صحیح در مورد گزارش نتایج ارائه نمی‌دهد. مدت‌ها فرض بر این بود که روش‌های بورونات افینیتی تداخلی با HbF افزایش یافته نشان نمی‌دهند، زیرا بدون توجه به ساختار Hb، هموگلوبین گلیکه تام اندازه‌گیری می‌شود. مطالعه‌ای با استفاده از روش مرجع IFCC به عنوان روش قیاس نشان داد که نتایج بورونات افینیتی در نمونه‌های با HbF افزایش یافته پایین است و این نتایج مربوط به HbF است. این تداخل می‌تواند ناشی از گلیکاسیون کمتر HbF در مقایسه با HbA باشد. تقریباً 60 درصد گلیکاسیون HbA در باقیمانده والین آمین انتهایی زنجیره β رخ می‌دهد. HbF دارای دو زنجیره γ با باقیمانده انتهایی گلایسین است. از آنجایی که بورونات افینیتی بدون توجه به نوع هموگلوبین، نسبت هموگلوبین گلیکه به غیر گلیکه را اندازه‌گیری می‌کند، وجود HbF افزایش یافته منجر به کاهش کاذب نتیجه HbA1c می‌شود.
سایر واریانت‌های هموگلوبین
اثرات واریانت‌های کمتر رایج Hb نیز بر اندازه‌گیری HbA1c ارزیابی شده است. یک واریانت Hb ممکن است از راه‌های مختلف نوعی تداخل در برخی روش‌ها ایجاد کند. اگر جایگزینی اسید آمینه هموگلوبین باعث تغییر در بار خالص هموگلوبین شود (مانند HbS، C، D و E)، در این صورت ممکن است با روش‌هایی مانند HPLC تبادل یونی یا الکتروفورز تداخل ایجاد کند. در برخی موارد، واریانت Hb (هم گلیکه و هم غیرگلیکه) ممکن است همراه با HbA1c الوت شود یا مهاجرت کند. جایگزینی اسیدآمینه در محل گلیکاسیون می‌تواند سرعت گلیکاسیون را تغییر دهد و بر برخی روش‌ها تأثیر بگذارد. یک مثال هموگلوبین Raleigh است که در آن جانشینی Val→Ala در انتهای زنجیره β رخ داده و استیلاسیون قابل‌توجهی ایجاد می‌کند؛ بنابراین از گلیکاسیون در این موقعیت جلوگیری کرده و موجب کاهش کاذب نتایج در روش‌های ایمونواسی و احتمالاً بورونات افینیتی می‌شود. اگر واریانتی باعث کاهش طول عمر گلبول قرمز شود، بدون در نظر گرفتن روش مورد استفاده، HbA1c (یا GHB تام) به‌طور کاذب کاهش می‌یابد. هر واریانت Hb باید برای تعیین میزان تداخل با هر روش ارزیابی شود.
جمع‌بندی
به‌طور خلاصه، واریانت‌های Hb به دلایل مختلف می‌توانند در روش‌های HbA1c تداخل داشته باشند. این موضوع می‌تواند یک مسئله مهم برای آزمایشگاه باشد. همه روش‌های اندازه‌گیری HbA1c برای کنترل قند خون در بیماران هموزیگوت HbS یا HbC، مبتلا به بیماری HbSC یا با هر شرایط دیگری که بقای گلبول‌های قرمز را تغییر می‌دهد، نامناسب هستند. آزمایشگاه‌ها باید از محدودیت‌های روش خود در مورد تداخل واریانت‌های شایع Hb آگاه باشند. آن‌ها همچنین می‌توانند روش‌های جدیدی را انتخاب کنند که احتمال تداخل آن‌ها کمتر باشد. اگر از روش HPLC تبادل یونی استفاده می‌شود، بررسی دقیق کروماتوگرام‌ها ممکن است وجود پیک‌های نابجای تولید شده توسط واریانت‌ها را شناسایی کند؛ به این ترتیب می‌توان نتایج غیرقابل قبول را تشخیص داد. در بیشتر موارد می‌توان از روش‌های جایگزین برای اندازه‌گیری HbA1c استفاده کرد.
برگرفته از مقاله
Little RR, Roberts WL. A review of variant hemoglobins interfering with hemoglobin A1c measurement. Journal of diabetes science and technology. 2009 May;3(3):446-51.