چالش‌های آزمایشگاهی در سنجش مارکرهای سرطانی

(قسمت دوم)

سارا کهن مظفری کارشناس ارشد ژنتیک پزشکی

دکتر حبیب‌الله گل‌افشان

محمد اسماعیل خدمتی کارشناس ارشد بیوشیمی

مارکر CA-19-9

آنتی‌ژن CA-19-9 یا آنتی‌ژن لوییس a سیاله‌شده برای پیگیری اولیه سرطان پانکراس به‌عنوان یک مارکر توموری مورد استفاده قرار می‌گیرد. راهنمای ASCO استفاده از CA-19-9 را برای غربالگری سرطان به‌خصوص سرطان پانکراس توصیه نمی‌کند، به این دلیل که جواب‌های منفی کاذب در بسیاری از بیماران و یا افزایش غیرمعمول آن در جمعیت عادی به‌طور مثبت کاذب مشاهده شده است. در افراد با توده‌های پانکراسی این مارکر برای افتراق بین سرطان و دیگر موارد پاتولوژیک این غده سودمند است. حساسیت و اختصاصیت این تومور‌مارکر به ترتیب 80 و 90 درصد برای سرطان پانکراس است و ارزشمندی این جواب به سایز تومور نیز وابسته است. اختصاصیت این مارکر توموری محدود است، زیرا اغلب در دیگر سرطان‌ها علاوه بر سرطان پانکراس و برخی از موارد خوش‌خیم پانکراسی- مجاری صفراوی نیز افزایش نشان می‌دهد، به همین علت این تومورمارکر برای انجام تست غربالگری سرطان پانکراس توصیه نمی‌شود. در بیمارانی که سرطان پانکراس قابل جراحی است اندازه‌گیری سطح این مارکر می‌تواند بازتابی از بقایای سلول سرطانی یا متاستاز آن باشد.

پیگیری پی‌درپی سطح مارکر CA-19-9 هر یک تا ۳ ماه برای مانیتور کردن بیماران بهبودیافته از شیمی‌درمانی یا بعد از عمل جراحی مفید است. افزایش سطح مارکر CA-19-9 می‌تواند در انواع مختلفی از بیماری‌ها مانند سرطان دستگاه گوارش، سرطان کلورکتال، سرطان مری و کارسینومای هپاتوسلولار دیده شود. علاوه بر سرطان‌ها، افزایش سطح این مارکر می‌تواند در التهاب پانکراس، سیروز و بیماری‌های مجاری صفراوی، انسداد مجاری صفراوی و سنگ کیسه صفرا مشاهده گردد.

بیان CA-19-9 در بیماران فاقد آنتی‌ژن گروه خونی لوییس که نزدیک به ۱۰ درصد جمعیت افراد سفید پوست را شامل می‌شود، حتی در حضور تومورهای بزرگ مشاهده نشده است و این به علت فقدان یا کاهش آنزیم فوکوزیل ترانسفراز است که برای تولید این مارکر توموری ضروری است.

از سنجش همزمان CEA و CA-19-9 برای غربالگری کلانژیوکارسینوما استفاده می‌شود و در افتراق نئوپلاسم‌های موسینی پانکراس فرم تهاجمی از غیرتهاجمی کمک‌کننده است. ترکیب این تست‌ها دارای حساسیت 80 و اختصاصیت 82 درصدی است.

مثبت کاذب تست CA-19-9

تداخل آنتی‌بادی‌های هتروفیل سبب مثبت کاذب CA19-9 می‌شود و معمولاً در صورتی که نمونه با مواد مسدودکننده این آنتی‌بادی مجاور گردد، تداخل ایجادشده حذف خواهد شد.

در برخی از افراد مصرف بیش از اندازه چای سیاه (Black tea) با افزایش فوق‌العاده‌ی CA-19-9 با درد معده و بدون سرطان همراه بوده است. خودداری از مصرف چای سطح این مارکر را به میزان نرمال کاهش داده است. سنگ کیسه صفرا و مجاری صفراوی با افزایش سطح فسفاتاز قلیایی و CA19-9 تظاهر می‌کند که با درمان به مقدار نرمال بازمی‌گردد.

سنجش CA-19 به طریق ساندویچ ایمونواسی مشاهده می‌گردد. در این روش آنتی‌ژن موردنظر بین دو آنتی‌بادی به دام افتاده و سیگنال واکنش توسط آنتی‌بادی دوم که نشان‌دار است، داده می‌شود

بتا دو میکروگلوبولین

Β2M عضو خانواده MHC CLASS I است و بر روی تمام سلول‌های هسته‌دار بروز می‌کند و در انسان توسط ژن Β2M کد می‌شود. اندازه‌گیری سطح این مارکر یکی از فاکتورهای تشخیصی مهم در مالتیپل مایلوما است. سطح سرمی بیشتر از 2/7 میلی‌گرم در لیتر در 75 درصد از بیماران در زمان تشخیص مشاهده می‌شود. بیماران با سطوح افزایش یافته‌تر شانس بقای کمتری را نشان می‌دهند.

سطح این مارکر در لنفوما معمولاً در ارتباط با مرحله‌ی بیماری و جرم تومور است؛ برای مثال در لوسمی مزمن لنفوسیتیک، افزایش Β2M در ارتباط با پیش‌آگهی نامطلوب است.

افزایش سطح Β2M در نارسایی پیشرونده کلیه مشاهده می‌شود که سفارش به تطابق سطح آن با سرعت فیلتراسیون کلیوی است (GFR-adjusted Β2M). محدوده غلظت پلاسمایی این مارکر در بیماران دیالیزی افزایش یافته و بین 30 تا 50 میلی‌گرم در لیتر است، در حالی که محدوده‌ی نرمال آن بین 0/8 تا 3 میلی‌گرم در لیتر است. عفونت‌های ناشی از ویروس HIV، هپاتیت و توبرکلوز فعال نیز با افزایش میزان Β2M همراه است.

مرحله‌گذاری تومورها بر مبنای TNM بر اساس متاستاز تومور به غدد لنفاوی و استخوان است

هورمون HCG

این هورمون از دو زیرواحد آلفا و بتا تشکیل شده است و زیرواحد بتای آن برای HCG اختصاصی است و دارای نقش عملکردی اختصاصی نیز هست. هورمون HCGβ توسط بافت تروفوبلاستی جنینی به میزان زیاد ترشح می‌شود و توسط دیگر ارگان‌ها مانند بیضه‌ها، کبد و کولون نیز در مقادیر کمتر ساخته می‌گردد.

جفت و بافت‌های تروفوبلاست عهده‌دار ترشح HCG هستند

آزمایش این هورمون از حساسیت و اختصاصیت بالایی برای تشخیص حاملگی و بیماری‌های تروفوبلاستی حاملگی برخوردار است و به‌ندرت سطوح خیلی پایین این هورمون در غیاب موارد فوق مشاهده شده است. این مارکر به سه فرم مختلف از قبیل مولکول کامل (intact)، فرم بتا، فرم بسیار قندی‌شده و فرم‌های دیگر شامل پپتید انتهای کربوکسیلی دیده می‌شود؛ بنابراین استفاده از روش‌هایی که توانایی اندازه‌گیری همه این اشکال را داشته باشد برای مقادیر پایین این مارکر و اطمینان از حضور آنها حتی در مقادیر اندک مفید است. سطوح بالاتر از 500000 mIU/ml دارای اثر هوک هستند و برای مثال ممکن است جواب‌ها در محــــــــدوده پایین‌تر 100-1 mIU/ml خوانده شود، زیرا حساسیت تست‌های HCG بر مبنای اشل‌بندی طیف HCG برای مثال mIU/ml 27300-233000 در ۸ تا ۱۱ هفتگی حاملگی است، بنابراین وقتی سطح این مارکر فوق‌العاده افزایش یابد هر دو نوع آنتی‌بادی استفاده‌شده در سنجش ساندویچی تست (آنتی‌بادی‌های چسبیده به فاز جامد و نشان‌دار) اشباع شده و از ساندویچ شدن HCG که با آن سیگنال مثبت شدن تست آشکار می‌گردد، جلوگیری می‌کند، بنابراین ارزیابی این مارکر باید با رقیق کردن سرم طوری که با رقت 1/1000 نیز بتوان سنجید، انجام شود.

اثر هوک زمانی رخ می‌دهد که تراکم آنتی‌ژن بالا باشد. در این حالت آنتی‌ژن‌ها با آنتی‌بادی‌های متصل فاز جامد واکنش می‌دهند و بسیاری از آنها نیز ایجاد کمپلکس آزاد با آنتی‌بادی نشان‌دار در روش ساندویچی کرده که با شستشو از محیط خارج گردیده و در نتیجه کاهش کاذب آنالیت مشاهده می‌گردد

تعیین ارزش بالینی سطح پایین hCG می‌تواند چالش‌برانگیز باشد، مهم است که تعیین کنیم آیا hCG در حال حاضر نشان‌دهنده بارداری واقعی (داخل رحمی است یا خارج رحمی)، بیماری فعال تروفوبلاستی بارداری (مول کامل یا جزئی، مول تهاجمی، کوریوکارسینوما، یا تومور تروفوبلاستی جفتی)، بیماری تروفوبلاستی خاموش، جواب مثبت کاذب آزمایشگاه (به نام فانتوم hCG) یا یک آرتیفکت فیزیولوژیک (هیپوفیز hCG ) است.آنتی‌بادی‌های چسبیده به فاز جامد و نشان‌دار مورد استفاده برای آزمایش hCG ممکن است از منبع آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال بز، گوسفند یا خرگوش یا آنتی‌بادی منوکلونال موشی، بز یا گوسفند باشند. انسان‌ها با در معرض قرار گرفتن در برابر حیوانات و یا برخی از اجزای آن‌ها تولید آنتی‌بادی‌های انسانی ضدآنتی‌بادی حیوانی می‌کنند (HAAA). انسان با قرار گرفتن در معرض مونونوکلئوز عفونی مستعد تولید آنتی‌بادی هتروفیل (HAAA) است و کسانی که مبتلا به سندرم کمبود IgA نیز هستند اغلب آنتی‌بادی‌های هتروفیل را دارند.مثبت کاذب آزمون hCG به علت وجود آنتی‌بادی‌های هتروفیل در نمونه سرم در مطالعات مختلف تأیید شده است. چنین نتیجه‌های مثبت کاذب در بسیاری از مردان و زنان با تشخیص اشتباه سرطان، سبب سردرگمی و سوءتفاهم شده‌اند.

دو روش اصلی برای شناسایی hCG مثبت کاذب وجود دارد:

راه راحت و در دسترس این است که نبود hCG در ادرار بیمار تأیید شود. افزایش سطح واقعی hCG باید در سرم و ادرار همزمان باشد.
دومین روش مفید شناسایی یک نتیجه مثبت کاذب hCG سرمی این است که سرم را به دو آزمایشگاه با روش‌های مختلف سنجش این هورمون ارسال کنیم. اگر نتایج آزمون به‌شدت متفاوت است یا در یک روش یا هر دو روش منفی باشد، جواب مثبت کاذب را می‌توان مدنظر قرار داد.

سرطان بیضه و مارکرهای سرطانی

تداخلات ناشی از آنتی‌بادی‌های هتروفیلی در انجام تست‌های آزمایشگاهی بررسی مارکرهای توموری:

آنتی‌بادی‌های هتروفیل، آنتی‌بادی‌های انسانی هستند که با آنتی‌بادی‌های مورد استفاده در کیت واکنش داده و جواب مثبت یا منفی کاذب را به دنبال دارند.اگرچه در بین نشانگرهای توموری، سنجش hCG سرمی بیشترین تأثیر را از این آنتی‌بادی‌ها می‌گیرد، نتایج آزمون مثبت کاذب در سایر موارد نشانگرهای توموری از جمله

PSA CA-125، CA-19-9، CEA، آلفا فتوپروتئین و حتی B2M نیز گزارش شده است.

درواقع، تداخل آنتی‌بادی هتروفیلی مشکل اصلی در سنجش مارکرهای مختلف سرطانی است، حتی آنتی‌بادی IgM-λ مربوط به Escherichia coli نیز می‌تواند نتایج مثبت کاذب در اندازه‌گیری این مارکرهای توموری از جمله تروپونین I را به همراه داشته باشد.

آنتی‌بادی‌های هتروفیل و فاکتور روماتوئید بیشترین تداخل را در روش‌های ساندویچی ایمونواسی دارند که همراه با افزایش یا کاهش کاذب آنالیت است

دلایل رایج افزایش سطح مارکرهای مختلف توموری در صورت غیاب نئوپلاسم در جدول زیر بیان شده است.

مارکر توموری	دلایل رایج افزایش سطح
آنتی‌ژن اختصاصی پروستات (PSA)	التهاب پروستات، هیپرپلازی خوش‌خیم پروستات، سرطان سینه، کیست‌های پستان، آنتی‌بادی هتروفیل
آلفافیتوپروتئیـــــــــن (α fetprotein)	بیماری‌های مجاری کبدی، پنومونی، حاملگی، بیماری‌های اتوایمیون، آنتی‌بادی هتروفیل
CA-125	بیماری‌های مجاری صفراوی، بیماری‌های ریوی، نارسایی کلیه، کم‌کاری تیروئید، بیماری مجاری گوارشی، اندومتریوز، حاملگی، بیماری‌های خودایمنی، بیماری‌های پوستی، بیماری‌های قلبی عروقی، آنتی‌بادی هتروفیل
CEA	بیماری‌های مجاری صفراوی کبدی، نارسایی کلیه ، کم‌کاری تیروئید، بیماری مجاری گوارشی، التهاب پانکراس، اندومتریوز، بیماری‌های خودایمنی، آنتی‌بادی هتروفیل
CA-19-9	بیماری‌های مجاری صفراوی، نارسایی کلیه، بیماری‌های ریوی، التهاب پانکراس، بیماری مجاری گوارشی، اندومتریوز، آنتی‌بادی هتروفیل
CA-15-3	کمبود ویتامین B12، ادم، نارسایی کلیه
بتا دو میکروگلوبین	نارسایی کلیه، بیماری‌های خودایمن، ضایعات مغزی
HCG یا فرم بتا HCG	نارسایی کلیه، حاملگی، بیماری‌های خودایمن، آنتی‌بادی‌های هتروفیل
CA-72-4	بیماری‌های مجاری صفراوی، نارسایی کلیه، افیوژن، التهاب پانکراس، بدخیمی‌های گوارشی
CYFRA21-1	بیماری‌های مجاری صفراوی، نارسایی کلیه، افیوژن، بیماری‌های ریوی
کروموگرانین A	بیماری‌های قلبی عروقی، عفونت ویروسی، التهاب پروستات یا هیپرپلازی خوش‌خیم آن، بیماری‌های مجاری گوارشی، آنتی‌بادی‌های هتروفیل

HER2/neu (c-erbB-2):

این انکوژن یک پروتئین بین غشایی از خانواده گیرنده تیروزین کینازی است که با EGFR (گیرنده فاکتور رشد اپیدرم) دارای همولوژی ساختاری و عملکردی است. این مارکر در سرم افراد مبتلا به سرطان‌های مختلف سلول اپیتلیال مانند سرطان پستان افزایش می‌یابد.

در بیماران مبتلا به سرطان پستان، سطح سرمی آن به‌عنوان یک مارکر مهم پیش‌آگهی‌دهنده و پیش‌بینی‌کننده استفاده می‌شود. در مراحل اولیه تشخیص، سطح سرمی HER2/neu تنها در ۵ تا ۱۰ درصد مبتلایان سرطان سینه یافت شده است. به‌نظر می‌رسد افزایش سطح این مارکر قبل از درمان‌های کمک‌کننده با افزایش اندازه تومور، درجه تومور و درگیری گره‌های لنفاوی در ارتباط است. آزمایش اندازه‌گیری سرمی HER2/neu برای پیگیری درمان بیماران مبتلا به سرطان پستان متاستاز داده‌شده که سطح سرمی اولیه بالاتر از ۱۵ نانوگرم به ازای هر میلی‌لیتر دارند، استفاده می‌شود. گزارش شده است که کاهش سطح سرمی HER2/neu به کمتر از 15 نانوگرم در سی‌سی یا سطحی که پیوسته در محدوده کمتر یا مساوی 15 نانوگرم در سی‌سی در طی روند درمان را نشان دهد، ارتباط بیشتری با طول عمر بیمار دارد.

اندازه‌گیری سطح سرمی HER2/neu به روش ایمونواسی کمی‌لومینسانس، مارکری حساس در سرطان پستان متاستاز داده‌شده در مقایسه با مارکر CEA و CA-15-3 است.

تکنیک الایزا برای اندازه‌گیری سطح در گردش c-erbB-2 که نیز به‌عنوان p105 یا HER2 از آن یاد می‌شود کاربرد دارد که مؤسسه غذا و داروی (FDA) سه تست را بر اساس آنتی‌بادی‌های مونوکلونال برای اندازه‌گیری HER2 تأیید کرده است.

روش اندازه‌گیری پلیت میکروتیتر (Oncogene science/siemens)
دستگاه‌های اتوماتیک (Bayer immune 1 HER2/neu)
روش ایمونواسی (ADVIA centaur HER2/neu)

سیستم ADVIA با سیستم Bayer immune 1 برای استفاده، فرمت اجرا، خصوصیات اجرایی تست و نتایج شبیه به هم است و تفاوت اصلی ADVIA در سیستم سیگنال‌دهی است که به‌جای واکنش رنگ‌زای کاتالیزوری آلکالین فسفاتاز از کمی‌لومینسانس استفاده می‌کند. مهم‌تر از همه این است که HER2/neu هیچ‌گونه تداخلی با آنتی‌بادی‌های هتروفیل و به‌خصوص با درمان MAb trastuzumab ندارد، زیرا اپی‌توپ‌های آنتی‌ژنی متفاوتی را مورد هدف قرار می‌دهند.

افزایش بیان HER2 در کارسینومای سلول پوششی دهان، سرطان معده، سرطان روده، کارسینومای ترانزیشنال مثانه، سرطان پروستات و سرطان تخمدان در مراحل پیشرفته مشاهده شده و به‌عنوان یک هدف درمانی به‌کار می‌رود. استفاده از اندازه‌گیری سطح سرمی میدان خارج سلولی HER با سطح بافتی HER2 در سرطان متاستاز داده‌شده معده ارتباط دارد و به‌عنوان یک جایگزین بالقوه سطح بافتی HER2 توصیه می‌شود.

مارکر HER2/neu گیرنده رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی سینه است که با مسدود ساختن آن توسط آنتی‌بادی هرسپتین (TRASTUZUMAB) می‌توان از ارسال سیگنال‌های لازم برای رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی جلوگیری کرد

CA-15-3 یک مارکر سرطان سینه است ولی در نبود سرطان پستان ممکن است افزایش چشمگیر آن به‌ویژه در کمبود ویتامین B12 دیده شود. افزایش دو برابری سطح این مارکر نسبت به محدوده نرمال آن در برخی از خانم‌های سالم در طی چرخه‌ی قاعدگی مشاهده می‌گردد. التهاب پانکراس، بیماری کرون، کولیت اولسردار و بیماری‌های خوش‌خیم گوارشی نیز همراه با افزایش سطح CA-15-3 است.

CA-72-4 یک مارکر سرطانی روده بزرگ است. به‌طور کلی نزدیک به 5 درصد از جمعیت بانوان دارای سطوح افزایش‌یافته این مارکر هستند. 3 الی 7 درصد بیماران مبتلا به التهاب پانکراس سطح بالاتر از نرمال این مارکر را نشان می‌دهند. جالب‌تر اینکه 50 درصد بیمارانی که از تب مدیترانه‌ای رنج می‌برند دارای سطوح افزایش‌یافته این مارکر هستند.

CYFRA21-1 یک آنتی‌ژن کارسینومای سلول پوششی است که در همراهی با CEA بهترین مارکرهای تشخیصی سرطان سلول‌های غیرکوچک ریه (NSCLC) هستند، در حالی که انولاز اختصاصی نورونی (NEURON SPECIFIC ENOLASE)، مارکری برای سرطان سلول کوچک ریه است. هرچند افراد مبتلا به بیماری‌های ریوی بدون سرطان می‌توانند افزایش سطح این مارکر را نشان دهند. بیماران دیالیزی، بیماران مبتلا به نقایص کلیوی و بیماران مبتلا به مشکلات کبدی نیز افزایش سطح این آنتی‌ژن را نشان می‌دهند. بیماری‌های پوستی مختلفی ماند سوریاسیس، اگزما، اپیدرمیتیس، اریترودرما و درماتیت اتوپی می‌توانند افزایش کاذب سطح CYFRA21-1 را نشان دهند.

کروموگرانین (CgA) A مارکری برای بیماری‌های نورواندوکرین مانند تومورهای گاستروانتروپانکراس، تومورهای غدد درون‌ریز و کارسینویید برونش است. این مارکر در تشخیص فئوکروموسیتوما در کنار اندازه‌گیری سطح متانفرین پلاسمایی- ادراری مفید است، به‌هرحال اندازه‌گیری این مارکر نیز مانند بسیاری از مارکرهای توموری می‌تواند تحت تأثیر آنتی‌بادی‌های هتروفیلی قرار بگیرد.