اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی
(دستورالعمل تأئیدشده)
ترجمه سند CLSI M54-A اکتبر 2012
ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری
www.ghahri.ir
بخش ششم
9/1/1/4- گونه‌های کلورلا و پروتوتکا (Chlorella and Prototheca species)
گونه‌های کلورلا و پروتوتکا جلبک‌هایی هستند که سلول‌های قارچی و شبه‌مخمری تولید می‌کنند و می‌توان آنها را در نمونه‌های کلینیکی یافت. این سلول‌ها جوانه نمی‌زنند. اندازه‌ی سلولی و خواص افتراق دهندگی آنها در جدول شماره 1 نشان داده شده است. هر دو جنس را می‌توان با سفید کالکوفلور (CFW) رنگ‌آمیزی کرد اما در رنگ‌آمیزی‌های هیستوشیمیایی بهتر و واضح‌تر دیده می‌شوند.
سلول‌های کلورلا
سلول‌های کلورلا
جدول شماره 1: جلبک‌هایی که سلول‌های شبه‌مخمری تولید می‌کنند
| نام ارگانیسم | اندازه (میکرومتر) | مرفولوژی متحدالشکل یا متنوع | تولید سودوهایفی یا هایفی حقیقی | اشکال اختصاصی/ ملاحظات |
| گونه‌های کلورلا | 5-14 | متغیر | غایب | سلول‌های شبه‌مخمری
تولیدمثل غیرجنسی از طریق ایجاد 4 تا 10 اسپور که بعد از بالغ شدن رها می‌شوند. معمولاً در حضور نور رنگ سبز تولید می‌کند. |
| پروتوتکا ویکرهامی | 2-11 | متغیر | غایب |
سلول‌های شبه‌مخمری تولیدمثل غیرجنسی از طریق ایجاد 4 تا 10 اسپور که بعد از بالغ شدن رها می‌شوند.
|
| پروتوتکا زوپفی | 8-25 | متغیر | غایب | در مقاطع هیستولوژیکال که رنگ‌های هیستوشیمی بکار برده شده است، معمولاً بهتر دیده می‌شوند. |
اسپورهای پروتوتکا ویکرهامی
اسپورهای پروتوتکا زوپفی
اسپورهای پروتوتکا زوپفی – رنگ‌آمیزی GMS
A: تصویر پروتوتکا در مقطع بافتی
B ,C ,D: تصاویر کلنی‌های کوچک سفید مشابه به ترتیب از چپ به راست: استافیلوکوک، مخمر، پروتوتکا
E: تصویر پروتوتکا زوپفی در لام مرطوب بزرگنمایی 400 برابر
F: کلنی‌های پروتوتکا زوپفی در محیط کشت prototheca isolation media
9/1/1/5- میکروسپوریدی‌ها (Microsporidia)
میکروسپوریدی‌ها پاتوژن‌های تک سلولی و داخل سلولی هستند که تا همین اواخر به‌عنوان پارازیت در نظر گرفته می‌شدند. آنالیز فیلوژنتیک مشخص کرد که این ارگانیسم‌ها با سلسله‌ی قارچ‌ها ارتباط نزدیک داشته و به آن تعلق دارند. میکروسپوریدی‌ها یک گروه هتروژن از ارگانیسم‌هایی هستند که شامل تعدادی جنس و تعداد زیادی گونه می‌باشند. این ارگانیسم‌ها در حیوانات مختلف بیماری‌های مختلفی را ایجاد می‌کنند. در انسان‌ها بیماری‌های مربوط به این ارگانیسم‌ها در طول فاز اولیه‌ی اپیدمی HIV شناخته شدند که عفونت‌هایی (غالباً) در مجاری گوارشی و سیستم اعصاب مرکزی ایجاد می‌کرد. عفونت‌های قرنیه نیز ممکن است هم در افراد دارای سیستم دفاعی سالم و هم آسیب‌دیده ایجاد شوند. نوع نمونه‌ای که برای آشکار کردن میکروسپوریدی‌ها تهیه می‌شود به فرآیند بیماری بستگی دارد. این نمونه‌ها شامل نمونه‌ی مدفوع برای آنتریت، تراشه‌های قرنیه یا بیوپسی برای بیماری‌های چشم و بیوپسی بافت برای لزیون‌های عمقی هستند. رنگ‌آمیزی‌های مناسب برای میکروسپوریدیاها اغلب رنگ‌آمیزی‌های بر پایه‌ی کروموتروپ (مانند تریکروم) و یا روشن‌کننده‌های اپتیکال فلئورسنتی (نظیر سفید کالکوفلور) هستند. رنگ‌آمیزی‌های میکروسپوریدیاها با توجه به طبیعت کوچک ارگانیسم (1 تا 2 میکرون) نیاز به بزرگنمایی قوی میکروسکپی، مواد کنترلی و پرسنل بسیار مجرب و ماهر دارد.
رنگ‌آمیزی تریکروم اصلاح‌شده (وبر گرین) اسپورهای میکروسپوریدیا
A: اسپورهای رنگ‌شده در نمونه مدفوع B: همان نمونه با بزرگنمایی قوی‌تر
رنگ‌آمیزی تریکروم اصلاح‌شده (Ryan-Blue) اسپورهای میکروسپوریدیا
A: اسپورهای رنگ‌شده در نمونه مدفوع B: میکروسپوریدیوم در بافت روده
رنگ‌آمیزی تریکروم اسیدفست از اواوسیست ایزوسپورا بلی (اسیدفست اصلاح‌شده مثبت) و اسپورهای میکروسپوریدیا (رنگ تریکروم اصلاح‌شده)
9/1/2 شناسایی و افتراق کپک‌ها در آزمایش مستقیم
اولین مرحله در شناخت مشخصات کپک‌ها در نمونه‌های کلینیکی این است که تعیین شود که آیا فقط هایفی وجود دارد یا مخلوطی از هایفی و مخمر یا سودوهایفی دیده می‌شود؟ سودوهایفی به‌وسیله‌ی دراز شدن جوانه‌ها تشکیل می‌شود. در مقابل، هایفی حقیقی از سلول‌های مخمری تولید شده و از یک لوله‌ی زایا منشأ می‌گیرد؛ یعنی اصل و منشأ آن یک لوله‌ی زایا است. سودوهایفی در نقاط اتصال سلولی فشرده می‌شود و اغلب شبیه به زنجیره‌های سوسیس دیده می‌شوند. این برعکس هایفی حقیقی است که در آن معمولاً هیچگونه فشردگی دیده نمی‌شود. در سودوهایفی، در نقاطی که فشردگی دیده می‌شود، بلاستوکونیدی‌زایی و انشعاب سودوهایفال اتفاق می‌افتد، در حالی که در هایفی حقیقی انشعاب از طریق سلول‌های ویژه‌ای صورت می‌گیرد.
در جدول شماره 2 معیارهای افتراق سودوهایفی و هایفی حقیقی نشان داده شده است. اگر مخمر و هایفی یا سودوهایفی دیده شود آنگاه احتمالاً یکی از قارچ‌هایی که در بخش9/1/1شرح داده شد، حضور دارند.
جدول شماره 2: معیارهای افتراق بین هایفی حقیقی و هایفی کاذب (سودوهایفی)
| هایفی حقیقی | سودوهایفی |
| رشد از ناحیه رأسی هایفا به‌وسیله‌ی دراز شدن خطی و ایجاد دیواره‌های عرضی بعدی حاصل می‌شود. | رشد درنتیجه‌ی یک پروسه‌ی باد کردن و ایجاد فشردگی متعاقب آن در هر بلاستوکونیدی جدید که از سلول مادری ایجاد می‌شود، رخ می‌دهد. |
| سلول انتهایی هایفی معمولاً درازتر از سلول قبلی بلافاصله قبل از دیواره‌ی عرضی است. | سلول انتهایی یک سودوهایفی نوعاً کوتاه‌تر یا هم‌اندازه‌ی سلول قبلی آن است. |
| سلول انتهایی معمولاً سیلندری شکل است. | سلول انتهایی معمولاً گرد شده است. |
| دیواره‌های سلولی نوعاً موازی هستند و هیچگونه فرورفتگی در محل دیواره عرضی (سپتوم) دیده نمی‌شود. | دیواره‌ها نوعاً حاوی فشردگی‌هایی در محل سپتوم‌ها هستند. |
| سپتوم‌ها منظم و صاف هستند و منکسرکننده‌ی نور هستند. | تمیز دادن و تشخیص دادن سپتوم‌ها مشکل است و معمولاً منحنی شکل و خمیده هستند. |
| انشعابات جانبی در نقاط منشأ خودشان فشردگی ندارند و اولین سپتوم از هایفی اصلی کمی فاصله دارد. | انشعابات جانبی در نقاط اتصال به منشأ خود دارای فشردگی هستند و یک سپتوم در محل انشعاب وجود دارد. |
در مرحله‌ی بعد نوع هایفی که حضور دارد باید در نظر گرفته شود. هایفی‌ها یا سنوسیتیک هستند (به‌عنوان مثال‌هایفی‌هایی که دیواره‌ی عرضی کمی دارند: کپک‌های موکوراسئوس) و یا سپتوم دارند. بعد از آن پیگمانتاسیون هایفی‌ها و سپس جزئیات مرفولوژیک دیگر باید در نظر گرفته شوند، همچنین حضور فرم‌های اختصاصی که ممکن است مطابق با نوع قارچ عامل عفونت وجود داشته باشند. هایفی‌های سنوسیتیک هایفی‌های کپک‌های موکوراسئوس و Pythium insidiosum (یک ارگانیسم شبه‌قارچی– از دسته‌ی اواومیست‌ها) هستند. این‌ها اغلب به شکل نوار (ribbon-like) در آزمایش مستقیم و مقاطع هیستولوژیکی مشاهده می‌شوند. این منظره بدین علت ظاهر می‌شود که دیواره‌های هایفی اغلب موازی هم نیستند و به دلیل فقدان دیواره‌های عرضی منظم روی یکدیگر تا می‌شوند. فقدان سپتوم‌ها و تمایل به انشعاب در زوایای مستقیم نیز هایفی این ارگانیسم‌های رشته‌ای را مشخص می‌کند.
هایفی کاذب مربوط به کاندیدا آلبیکنس
کلنی پیتیوم اینسیدیوزوم بعد از 5 روز کشت در دمای 37 درجه بر روی محیط سابورو و منظره میکروسکپی آن که دارای هایفی‌های با سپتوم‌های اندک است
اگرچه هایفی‌ها کاملاً aseptate نیستند، قطعات کوتاه هایفی که در آزمایش مستقیم دیده می‌شوند ممکن است فاقد سپتوم باشند. این اشکال معمولاً برای تعیین مشخصات هایفی در نمونه‌ی بیمار کفایت می‌کنند. بندرت در نواحی آناتومیک حفره‌دار مانند سینوس‌های هوایی اطراف بینی، ساختمان‌های اسپورزایی مثل اسپورانژیوم یا حتی خیلی بندرت زیگوسپورها ممکن است دیده شوند. هایفی‌های سپتوم‌دار معمولاً به‌آسانی از هایفی‌های سنوسیتیک تمیز داده می‌شوند، اما گاهی اوقات هایفی‌های متورم‌شده‌ی مربوط به یک کپک سپتوم‌دار و شفاف موجب اشتباه می‌شوند.
هایفی‌های سنوسیتیک مربوط به جنس رایزوپوس
هایفی‌ها یا شفاف و یا فئوئید (دیماتیاسئوس) هستند. هایفی‌های شفاف می‌توانند سپتوم‌دار و یا سنوسیتیک باشند، درحالی‌که همه‌ی هایفی‌های فئوئید مربوط به کپک‌های دارای سپتوم هستند. اگرچه هایفی‌های سپتوم‌دار شفاف و با انشعاب دوشاخه (زاویه‌ی حاد) اغلب به‌عنوان آسپرجیلوس (consistent with Aspergillus) در نظر گرفته می‌شوند، اکثر کپک‌های شفاف هایفی‌هایی تولید می‌کنند که از یکدیگر غیرقابل تشخیص هستند. به‌طور مشابهی حضور هایفی‌های پیگمانته (کمرنگ تا پررنگ) صرفاً حضور دیماتیاسئوس‌ها را تأئید می‌کند. بدون کشت یا بدون حضور یک ساختمان اختصاصی مثل کونیدی، طبیعت دقیق قارچ عامل عفونت را نمی‌توان شناخت. هایفی‌های مونیلیفرم که واجد تورم سلولی هستند گاهی دیده می‌شوند و ممکن است با هایفی‌های سنوسیتیک اشتباه شوند، اگرچه حتی با سلول‌های متورم یک کپک شفاف سپتوم‌دار قطر هایفی ممکن است به‌وسیله‌ی پهنای سپتوم تعیین شود، بعلاوه تعداد سپتوم‌ها معمولاً در هایفی‌های دارای دیواره‌ی عرضی (septate) بیشتر از هایفی‌های سنوسیتیک است.
هایفی ملانیزه مربوط به قارچ دیماتیاسئوس
ساختمان‌های اختصاصی که نوعاً در کشت دیده می‌شوند گاهی اوقات در بافت‌های عفونی‌شده تشکیل می‌شوند. این ساختمان‌ها ممکن است کلید شناسایی قطعی عامل عفونی باشند و یا اینکه امکان شناسایی آن را فراهم کنند. همانند کپک‌های موکوراسئوس، این ساختمان‌های اختصاصی عموماً هنگامی که قارچ در یک حفره یا در یک فضای هوادار مستقیماً با هوا مواجه می‌شود، تشکیل می‌گردند. مثال‌ها شامل حضور آسپرجیلوم (سر کونیدیال یا میوه‌آور) گونه‌های آسپرجیلوس، کونیدیاهای گلابی شکل کمپلکس گونه‌های سودوآلشریا بویدی‌ائی یا کونیدیاهای موریفرم آلترناریا در مخاط سینوس‌های بینی بیماری با توپ قارچی است.
برخی از کونیدی‌ها که به‌طور نرمال در میسلیوم تولید می‌شوند ممکن است در بافت‌های عفونی نیز ایجاد گردند. مثالی برای این مورد تولید نادر آلوروکونیدی (aleuroconidia) در بافت‌های بیماری است که با آسپرجیلوس ترئوس عفونی شده است. در مقابل پیتیوم اینسیدیوزوم (P. insidiosum)، هایفی‌های سنوسیتیک و اغلب بدون اسپورولاسیون در کشت و نیز in vivo حتی در حضور حفره‌ها تولید می‌کند. سایر کپک‌های فیالیدیک مانند فوزاریوم، آکرومونیوم، Phialemonium و پسیلومایسس ممکن است فیالیدها و کونیدی‌هایی در بافت‌های عفونی‌شده (شامل عروق خونی) تولید کنند. اگرچه افتراق کپک‌ها به‌وسیله‌ی مرفولوژی به‌تنهایی ممکن است نسبت به افتراق مخمرها و قارچهای شبه‌مخمری کمتر تمیزدهنده باشد، اما همچنان اطلاعات مفیدی ارائه می‌دهند که می‌تواند تا زمانی که عامل شناسایی شود، راهنمای درمان آنتی‌میکروبیال باشد؛ به‌عنوان مثال تأئید اینکه عناصر هایفال سنوسیتیک هستند (یعنی به یکی از اعضای کپک‌های موکوراسئوس یا پیتیوم تعلق دارند) می‌تواند برای کلینیسین اطلاعات مفیدی به‌منظور راهنمای درمان ضدمیکروبی تجربی فراهم کند.
پیشرفت‌های جدید در درک مکانیسم‌های بیماری‌زایی قارچهای فرصت طلب (3)
راهکارهای کاهش ابتلا به عفونت‌های ناشی از قارچ آسپرژیلوس
آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی (1)
آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی (2)
برای دانلود فایل pdf بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام