اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی آزمایش مستقیم و کشت

(دستورالعمل تأئیدشده)

ترجمه سند CLSI M54-A اکتبر 2012

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

www.ghahri.ir

بخش چهارم

8- آماده‌سازی نمونه

روش آماده‌سازی نمونه برحسب نوع و مقدار نمونه متفاوت است. دستورالعمل مربوط به نمونه‌های اختصاصي در ضمیمه‌ی A آورده شده است.

8/1- تغليظ

حداقل به ميزان 2 میلی‌لیتر از نمونه را برداشته و به مدت 10 دقيقه با سرعت 1500 الي g 2000 سانتريفيوژ نمایید. مايع رویی را در صورت نياز براي انجام تست‌های ديگر آسپيره كرده و نگهداري كنيد. رسوب را در مقدار كمي از مايع باقيمانده مجدداً به حالت تعليق درآوريد. براي انواع نمونه‌هایی كه نياز به تكنيك تغليظ دارند به ضميمه A رجوع فرمایید.

8/2- تلقيح مستقيم

اكثر نمونه‌ها را می‌توان به‌طور مستقيم به داخل محيط كشت تلقيح نمود. عموماً يك تلقيح سنگين (به‌عنوان‌مثال 0/25 الي 0/5 میلی‌لیتر در هر پليت) براي كشت و جداسازي قارچ‌ها موردنیاز است.

8/3- خرد كردن و هموژنيزه كردن

بريدن يا خرد كردن نمونه‌ی بافت، قطعه‌ی ناخن و يا تکه‌های لخته موجب می‌شود كه امكان مواجهه‌ی میکروارگانیسم‌های موجود در نمونه به سطح محيط كشت افزايش يابد. براي انجام اين كار نمونه را در يك پتري‌ديش استريل قرار داده و چند قطره آب خالص استريل يا سالين استريل به آن اضافه كرده و سپس به‌وسیله‌ی اسكالپل آن را خرد كنيد و بعد چند قطعه‌ی خردشده را در محيط كشت تلقيح نمایید. علاوه بر قطعات خرد و ريزشده با كمك دستگاه خرد كن استريل (tissue grinder)، قطعات بزرگ‌تر بافتي را نيز می‌توان به‌صورت برش‌خورده در محيط كشت قرار داد. براي اين كار حتماً در زير هود بيولوژيك (BSC) كار كنيد و بافت را با ملايمت و آرام‌آرام (gently) خرد كنيد. نمونه‌های بافت خردشده و هموژنيزه‌شده هر دو را در محیط‌های كشت مناسب تلقيح نمایید. هنگامی ‌که حضور يك ارگانيسم كپكي موكوراسئوس مورد شك و ترديد است، براي اجتناب از شكستن دیواره‌های سلولي اين نوع از قارچ‌ها، خرد شدن بافت بايد در حد تکه‌تکه كردن (sliced) باشد و نبايد کاملاً خرد (ground) شود.

اگر حضور هيستوپلاسما به‌عنوان پاتوژن موردتردید است، بافـــــــت بايد در دستگاه خـردكن (tissue grinder) کاملاً خرد شود. هيستوپلاسما به‌صورت مخمر تک‌سلولی، جوانه‌دار و داخل سلولي در بافت مشاهده می‌شود. قطعات کوچک‌تر بافت كه با تكنيك grinding ايجاد می‌شوند سطح مواجهه‌ی بيشتري فراهم می‌آورند و سلول‌های مخمري بيشتري به محيط كشت وارد می‌شوند.

8/4- نگهداري و ذخيره كردن نمونه

آزمایشگاه‌ها بايد يك سياست مشخص و مدون براي نگهداري و ذخيره كردن نمونه‌ها بر اساس نيازهاي كلينيكي خود تهيه و تدوين نمايند. بهترين حالت براي نگهداري نمونه‌هاي مو، پوست و ناخن نگهداري در دماي اتاق است. ساير نمونه‌هاي فرآوري‌شده را بايد در دماي 2 الي 8 درجه سانتی‌گراد نگهداري نمود.

9- آزمايش مستقيم نمونه‌هاي باليني

9/1- آشکارسازی و افتراق قارچ‌ها در آزمايش مستقيم ميكروسكپي

آشکارسازی (بخش 2/9 را مطالعه فرمایید) و مشخص كردن عناصر قارچي در نمونه‌هاي بيمار می‌تواند اطلاعات استوار و قانع‌کننده‌ای را فراهم نمايد. قبل از هر چیز، حضور صرف عناصر قارچي در آزمايش مستقيم به‌صورت قوي حضور قارچ را با بيماري قارچي مرتبط می‌کند (به‌عنوان‌مثال افزايش مقدار عناصر قارچي در آزمايش مستقيم نسبت به كشت ضرورت دارد، زيرا در كشت حتي يك اسپور به‌تنهایي ممكن است تكثير يافته و يك كلني ايجاد كند).

در بسياري از موارد همبستگي بین نتايج آزمايش مستقيم ميكروسكپي و برداشت قارچ در كشت يك مسئله اساسي براي كمك به تعيين اهميت كلينيكي اين نتايج است. در مقابل به دست آوردن نتايج در كشت، نتايج آزمايش مستقيم در يك زمان بسيار كوتاه ميسر است و در برخي موارد می‌تواند بيانگر شواهد قطعي و اولیه‌ی عفونت قارچي باشد. در برخي ديگر از موارد براي نشان دادن حضور عفونت قارچي، آزمايش مستقيم نسبت به كشت می‌تواند ارجح باشد (مثال: نمونه‌هاي معيني از عفونت‌های ناشي از درماتوفيت‌ها). عموماً كشت قارچي و آزمايش مستقيم ميكروسكپي بايد با يكديگر انجام شوند (به ضمیمه‌ی A رجوع شود). در موارد ديگري نيز كشت می‌تواند براي آشكار كردن قارچ‌ها نسبت به آزمايش مستقيم بسيار حساس‌تر باشد و علاوه بر این كشت داراي اين مزيت نيز هست كه امكان انجام آزمايش تعيين حساسيت نسبت به داروهاي ضدقارچي را فراهم می‌آورد. اگر مقدار نمونه به‌اندازه‌ای نباشد كه آزمايش مستقيم و كشت هردو انجام شود، انجام كشت بدون انجام آزمايش مستقيم، كمتر مطلوب است.

انواع عناصر قارچي كه ممكن است در نمونه‌هاي باليني حضور داشته باشند را به مخمرها، فرم‌های شبه‌مخمري، سودوهايفي، هايفي حقيقي و ساير اشكال كمتر شايع می‌توان تميز داد. توجه دقيق به مرفولوژي ميكروسكپي به‌طور قابل‌توجهی احتمالات اتيولوژيكال را محدود می‌کند و در برخي از موارد (يا نمونه‌ها) موجب شناسایی قطعي نوع ارگانيسم قارچي می‌گردد. نوع پاسخ التهابي كه در برابر جنس و گونه‌ی قارچي ايجاد می‌شود نيز براي مشخص كردن عفونت‌های قارچي مفيد و کمک‌کننده است.

9/1/1- ویژگی‌های تشخيصي مخمرها و شبه‌مخمرها

قارچ‌هاي مخمري و شبه‌مخمري متنوع‌ترین اشكال ميكروسكپي را در نمونه‌هاي باليني تشكيل می‌دهند. اين گروه از قارچ‌ها را به‌صورت اوليه می‌توان با كمك تجزیه‌وتحلیل در اندازه‌ی سلول‌های مخمري، همساني يا غيرهمساني در اندازة آن‌ها و حضور يا عدم حضور سودوهايفي و يا وجود يا عدم وجود هايفي حقيقي در آن‌ها طبقه‌بندی كرد. علاوه بر این‌ها ممكن است ساختمان‌های اختصاصي نيز داشته باشند كه در این صورت تشخيص فرضي و احتمال حضور برخي از قارچ‌ها را فراهم می‌کنند (به‌عنوان‌مثال حضور كپسول در آزمايش مستقيم ميكروسكپي در آزمايش مايع مغزي نخاعي كه اجازه می‌دهد شناسایی احتمالي و اولیه‌ی گونه‌های كريپتوكوكوس مطرح شود). اگرچه براي شناسایی دقيق قارچ‌هاي مخمري و شبه‌مخمري با توجه به تنوع و شيوع آن‌ها، تداخلات و يا اختلافات تشخيصي رخ داده كه بايد به‌درستی از يكديگر شناخته شوند.

طبقه‌بندی قارچ‌هاي مخمري بر اساس اندازه به اين شرح است:

قارچ‌هاي مخمري و شبه‌مخمري با اندازه‌ی كوچك يعني 2 تا 5 ميكرون
قارچ‌هاي مخمري و شبه‌مخمري با اندازه متوسط يعني 6 الي 15 ميكرون
قارچ‌هاي مخمري و شبه‌مخمري با اندازه‌ی بزرگ يعني بيش از 15 ميكرون

قارچ‌هاي مخمري و شبه مخمري با اندازه‌ی كوچك يعني 2 تا 5 ميكروني سخت‌ترین قارچ‌ها براي افتراق از يكديگر است. اگرچه توجه دقيق به جزئيات و مرفولوژي قارچ، محل عفونت و در صورتی ‌که امكان داشته باشد نوع پاسخ التهابي، اساساً احتمال شناسایی قارچ را بهبود می‌بخشند يا حداقل طبقه‌بندی آن‌ها را به‌عنوان عامل بيماري به‌طور مناسب‌تری ممكن می‌سازند (به جدول 1 و 2 و 3 مراجعه شود).

جدول 1- توصیف صفات اختصاصی قارچ‌های مخمری و شبه‌مخمری در نمونه‌های بالینی

(مخمرهای با اندازه کوچک)

*نام ارگانیسم*	*اندازه (میکرومتر)*	*متحدالشکل یا دارای اندازه‌های متغیر*	*حضور سودوهایفی یا هایفی حقیقی*	*خصوصیات برجسته / ملاحظات خاص*
کاندیدا گلابراتا Candida glabrata	2.5-4	متحدالشکل و یک‌ریخت	غایب	کوچک‌ترین گونه از جنس کاندیدا است، در نمونه‌های بالینی هایفی و سودوهایفی تولید نمی‌کند.
هیستوپلاسما کپسولاتوم H. capsulatum	2-5	معمولاً یک‌ریخت	معمولاً غایب	در مقاطع بافتی، یک فضای شفاف یا کپسول کاذب اطراف مخمر دیده می‌شود. مخمرهای کوچک، سلول‌های جوانه‌ای بیضوی تا کروی که اغلب در بیماری منتشره به‌صورت خوشه‌ای داخل هیستوسیت‌ها دیده می‌شوند. این سلول‌ها در هیستوپلاسمومای قدیمی و غیرفعال در نواحی نکروز وجود دارند. اگر به تعداد کم باشند آشکار کردن آن‌ها مشکل است. در اکثر موارد در مقاطع بافتی که با رنگ‌های هیستوشیمی رنگ‌آمیزی می‌شوند بهتر دیده می‌شوند.
گونه‌های مالاسزیا .Malassezia spp	3-8 (فرم‌های مخمری در تینا ورسیکالر) <2-4 (اندازه مخمرها در فونژمی یا در حالت کومنسال)	یک‌ریخت، به‌جز در تینا ورسیکالر که تغییرپذیری کمی دیده می‌شود	در تینا ورسیکالر دیده می‌شود	عناصر هایفال کوتاه و خمیده به همراه سلول‌های مخمری (شکل ظاهری مانند اسپاگتی و گوشت) در تراشه‌های پوستی که از بیماران تینا ورسیکالری به‌دست می‌آید. هنگامی ‌که در نمونه‌های پوست و خون بیماران فونژمیک یافت می‌شوند، مخمرها جوانه زدن تک‌قطبی را نشان می‌دهند، جوانه‌ها دارای پایه‌ی پهن‌ در نقطه‌ی اتصال هستند.
پنموسیستیس جیرووسی Pneumocystis jirovecii	4-6	متحدالشکل و یک‌ریخت	غایب	اجسام کیست مانند که شبیه هلال‌های روبروی هم دیده می‌شوند برای این قارچ پاتوگنومونیک هستند و در رنگ‌آمیزی‌های بافتی بهتر مشاهده می‌شوند. کیست‌ها اغلب به‌صورت خوشه‌ای یا گروهی هستند. این ارگانیسم جوانه نمی‌زند. در اکثر موارد در مقاطع بافتی که رنگ‌آمیزی هیستوشیمی می‌شوند و یا در رنگ‌آمیزی DFA* بهتر دیده می‌شوند.
اسپوروتریکس شنکئی Sporothrix schenckii species complex	2-6	متغیر، کروی و دراز	غایب	سلول‌های دراز (اجسام سیگار شکل) قویاً مطرح‌کننده اسپوروتریکس شنکئی هستند. این عفونت معمولاً یک پاسخ پیوگرانولوماتوز را برانگیخته می‌کند. ممکن است فرم‌های مخمری در نمونه‌های بالینی به‌سختی تشخیص داده شوند. آن‌ها در مقاطع بافتی با استفاده از رنگ‌آمیزی‌های هیستوشیمیایی بهتر مشاهده می‌شوند.

*DFA: Direct Fluorescent Antibody :توضیح

تصاویر منتخبی از برخی از عناصر قارچی مخمری مرتبط با جدول شماره 1 در زیر آورده شده است:

کاندیدا گلابراتا (رنگ‌آمیزی گرم)

کاندیدا تروپیکالیس (رنگ‌آمیزی گرم)

کاندیدا آلبیکنس (رنگ‌آمیزی گرم)

سلول‌های مخمری هیستوپلاسما در هیستوپلاسموز منتشره

سلول‌های مخمری هیستوپلاسما در لزیون مغزی هیستوپلاسموز

سلول‌های مخمری مالاسزیا

پنموسیستیس جیرووسی

سلول‌های مخمری اسپوروتریکس شنکئی

سلول‌های مخمری جوانه‌دار به اشکال نامنظم تا بیضی کشیده (سیگار شکل)

جدول 2- توصیف صفات اختصاصی قارچ‌های مخمری و شبه‌مخمری در نمونه‌های بالینی

(مخمرهای با اندازه متوسط)

*نام ارگانیسم*	*اندازه (میکرومتر)*	*متحدالشکل یا دارای اندازه‌های متغیر*	*حضور سودوهایفی یا هایفی حقیقی*	*خصوصیات برجسته / ملاحظات خاص*
عوامل کروموبلاستومایکوزیس Agents of Chromoblastomycosis	5-12	متغیر	غایب	مشاهده‌ی ساختمان‌های کروی که با یکدیگر اتصال دارند و دارای دیواره‌های عرضی داخلی هستند برای تشخیص اهمیت دارند (اجسام اسکلروتیک). معمولاً پیگمانتاسیون آشکاری مشاهده می‌شود.
بلاستومایسس درماتیتیدیس B. dermatitidis	8-15	متحدالشکل و یک ریخت	هیچکدام	سلول‌ها معمولاً بزرگ، کروی شکل و با انکسار مضاعف هستند. جوانه‌ها معمولاً یک عدد و با اتصال پهن به سلول مادر چسبیده‌اند. بندرت فرم‌های کوچک 2 تا 5 میکرونی و فرم‌های بزرگ تا 40 میکرونی ممکن است مشاهده شوند.
گونه‌های کاندیدا غیر از کاندیدا گلابراتا Candida spp. Other than C. glabrata	2.5-7.5 اکثراً به‌اندازه 5-6	به‌طور متوسط متغیر	اغلب وجود دارد	سلول‌ها معمولاً تک جوانه‌ای هستند. موقعی‌که سودوهایفی حضور دارد انتهای سلول‌ها فشرده شده و به‌صورت متصل با یکدیگر باقی می‌مانند و شبیه به زنجیر سوسیس دیده می‌شوند. هایفی حقیقی اگر دیده شود دارای دیواره‌های موازی بوده و septate است.
کریپتوکوکوس نئوفرمنس C. neoformans	2-15	متغیر	خیلی بندرت	سلول‌ها در اندازه متنوع هستند و معمولاً کروی هستند. جوانه‌ها معمولاً منفرد هستند و اتصال نقطه‌ای دارند. کپسول ممکن است مشاهده شود و یا دیده نشود.
گونه‌های اگزوفیالا Exophiala spp.	4-6	متغیر	وجود دارد	سلول‌های شبه‌مخمری که از طریق annelloconidiation غیرجنسی تکثیر می‌شوند به همراه عناصر شبیه سودوهایفی حضور دارند. پیگمانتاسیون تیره ممکن است از حالت کم‌چگال و نامحسوس تا کاملاً آشکار دیده شود.
هیستوپلاسما دوبوئیزی Histoplasma duboisii	معمولاً 8-15 گاهی تا 150	متغیر	غایب	قارچ یک پایه‌ی باریک به نمایش می‌گذارد و گاهی شبیه به ساعت شنی یا شبیه به عدد 8 است. به دلیل اندازه‌ی سلول و دیواره‌ی ضخیم آن، گاهی اوقات این ارگانیسم اشتباهاً بجای بلاستومایسس در نظر گرفته می‌شود.

تصاویر منتخب از برخی از عناصر قارچی مخمری مرتبط با جدول شماره 2 در زیر آورده شده است:

بلاستومایسس درماتیتیدیس (رنگ‌آمیزی نقره)

بلاستومایسس درماتیتیدیس (نقطه‌ی اتصال پهن سلول جوانه به سلول مادری)

اجسام اسکلروتیک در عفونت کروموبلاستومایکوز در یک گیرنده پیوند کلیه (بزرگنمایی 400 برابر)

اجسام اسکلروتیک

سلول‌های مخمری کپسول‌دار کریپتوکوکوس نئوفرمنس

هیستوپلاسما کپسولاتوم واریته‌ی دوبوئیزی

سلول‌های مخمری اگزوفیالا

جدول 3- توصیف صفات اختصاصی قارچ‌های مخمری و شبه‌مخمری در نمونه‌های بالینی

(مخمرهای با اندازه بزرگ)

*نام ارگانیسم*	*اندازه (میکرومتر)*	*متحدالشکل یا دارای اندازه‌های متغیر*	*حضور سودوهایفی یا هایفی حقیقی*	*خصوصیات برجسته / ملاحظات خاص*
گونه‌های کوکسیدیوئیدس Coccidioides spp.	10-200	متغیر	معمولاً وجود ندارد	اسفرول‌ها اندازه‌های متنوعی دارند و برخی از آن‌ها محتوی اندوسپور هستند. اسفرول‌های عقیم یا نابالغ نیز ممکن است دیده شوند. هنگام پاره شدن اندوسپورهای آزادشده و اسفرول‌های نابالغ ممکن است شبیه به مخمرهای جوانه‌دار دیده شوند. این اسفرول‌های نابالغ که در کنار اندوسپورها قرار می‌گیرند ممکن است مشابه بلاستومایسس درماتیتیدیس به‌نظر برسند، درحالی‌که اندوسپورها ممکن است مشابه هیستوپلاسما به‌نظر آیند. غیاب حالت جوانه زدن یک وجه افتراقی مهم در تشخیص این قارچ است. در لزیون‌های حفره‌ای ممکن است هایفی دیده شود. این هایفی‌ها در مقاطع بافتی که با رنگ‌های هیستوشیمی رنگ‌آمیزی شده‌اند، بهتر دیده می‌شوند.
کوکرومایسس رکورواتوس Cokeromyces recurvatus	30-90	متغیر	غایب	سلول‌ها مشابه سلول‌هایی است که در پاراکوکسیدیوئیدومایکوزیس دیده می‌شوند، هرچند که اغلب اوقات با اسفرول‌های کوکسیدیوئیدس اشتباه گرفته می‌شوند.
پاراکوکسیدیوئیدس برازیلینسیس P. brasiliensis	5-60	متغیر	غایب	سلول‌ها معمولاً بزرگ هستند و به‌وسیله‌ی جوانه‌های کوچک‌تری احاطه شده‌اند (منظره شبیه به فرمان کشتی). سلول‌های دختر و کوچک‌تر (2 تا 5 میکرون) شبیه هیستوپلاسما کپسولاتوم ممکن است دیده شوند.