اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی
آزمایش مستقیم و کشت
(دستورالعمل تأیید‌شده)
ترجمه سند CLSIM54-A اکتبر 2012
ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری
بخش اول
1- گستره (scope)
مایکولوژیست‌ها برای تهیه‌ی یک دستورالعمل یکسان که به‌عنوان رفرانس مختصر و موجز برای انجام کشت‌های قارچی و تهیه‌ی نمونه و انجام آزمایش‌های مستقیم میکروسکپی بکار برده شود، توافق کرده‌اند. سند M54-A اصول و روش‌های ایمنی زیستی در آزمایشگاه قارچ‌شناسی، کنترل کیفی محیط‌های کشت قارچ، نگهداری استرین‌های ذخیره، جمع‌آوری و انتقال نمونه، فرآیند آماده‌سازی نمونه، آزمایش‌های مستقیم میکروسکپی، روش‌های کشت قارچ‌ها و ارزیابی کشت‌ها را فراهم می‌کند. این دستورالعمل برای انجام کشت قارچ و یا آزمایش‌های مستقیم میکروسکپی و برای کارشناسان آزمایشگاهی تهیه شده است. کشت و آزمایش‌های مستقیم برای گروه دیگری از ارگانیسم‌ها (مثلاً گونه‌های نوکاردیا و اکتینومیست‌های هوازی) که ممکن است در محیط‌های کشت قارچ‌شناسی با آن‌ها مواجه شویم در این سند مورد بحث قرار نمی‌گیرند. علاوه بر این، شناسایی (identification) قارچ‌ها نیز خارج از حوزه و محدوده‌ی این سند می‌باشند.
2- اقدامات احتیاطی استاندارد
تمام بیماران و نمونه‌های آزمایشگاهی باید عفونت‌زا درنظر گرفته شوند، زیرا اغلب اوقات نمی‌توانیم مطمئن باشیم که کدام ایزوله‌ها یا نمونه‌ها ممکن است عفونی باشند و بنابراین بر طبق احتیاطات استاندارد باید مورد عمل قرار گیرند.
احتیاطات استاندارد یک سری از روش‌های کنترل عفونت هستند که برای جلوگیری از انتقال بیماری‌هایی که می‌توانند به‌وسیله‌ی تماس با خون، مایعات بدن، پوست آسیب‌دیده (شامل جوش‌ها و راش‌ها) و غشاءهای مخاطی کسب شوند، مورد استفاده قرار می‌گیرند. احتیاطات استاندارد شامل بهداشت دست (قبل و بعد از تماس با بیمار)، استفاده پرسنل از تجهیزات حفاظتی (مانند دستکش، ماسک صورت، گان، پیش‌بند پلاستیکی، حفاظت چشم) برحسب مواجهه‌ی پیش‌بینی‌شده، بهداشت تنفسی، روش‌های تزریق ایمن و مراقبت ایمنی وسایل و تجهیزات بیمار می‌شود.
احتیاطات یونیورسال عبارت از کاربرد احتیاطات استاندارد برای خون، مایعات بدن، ترشحات، مواد دفعی غیر از عرق، پوست غیرسالم و غشاءهای مخاطی است.
احتیاطات استاندارد، ترکیبی از احتیاطات یونیورسال و احتیاطات مربوط به کار با نمونه‌های بالینی است. احتیاطات استاندارد انتقال تمام عوامل عفونی را تحت پوشش قرار می‌دهد و بنابراین نسبت به احتیاطات یونیورسال که تنها برای انتقال پاتوژن‌های منتقله از راه خون در نظر گرفته شده‌اند، فراگیرتر هستند. برای دستیابی به احتیاطات اختصاصی جهت پیشگیری از انتقال آزمایشگاهی تمام عوامل عفونی شناخته‌شده از طریق دستگاه‌ها و وسایل و مواد آزمایشگاهی و برای دستیابی به توصیه‌های مربوط به مدیریت مواجهه و برخورد با بیماری‌های عفونی شناخته‌شده به سند M29-CLSI مراجعه شود.
3- اصطلاح‌شناسی
3.1- یک نکته در اصطلاح‌شناسی
CLSI به‌عنوان پیشگام جهانی در معیارسازی (Standardization)، به‌طور قطع و یقین برای بدست آوردن هماهنگ‌سازی (Harmonization) جهانی در همه‌جا (مکان‌ها) مقید و متعهد است. هماهنگ‌سازی فرآیندی است از شناختن، فهمیدن و توضیح دادن اختلافات در حالی که گام‌هایی برای بدست آوردن همسانی و یکنواختی جهانی برداشته می‌شود.
CLSI تأیید می‌کند که کنوانسیون‌های پزشکی در جامعه‌ی جهانی در ایالات متحده، اروپا و مناطق دیگر به‌صورت مختلف و متفاوت تکامل یافته است و این اختلافات در اسناد CLSI، سازمان بین‌المللی برای معیارسازی (ISO) و در کمیته‌ی اروپایی برای معیارسازی (CEN) منعکس شده است و از نظر قانونی نیازمند استفاده از ترم‌ها، استفاده‌ی منطقه‌ای و توافق‌های مختلف است که همگی در فرآیند هماهنگ‌سازی اهمیت دارند.
فرآیند توافق‌های CLSI برای ایجاد و تجدیدنظر در مورد استانداردها و دستورالعمل‌ها بر روی هماهنگ‌سازی ترم‌ها به‌منظور تسهیل کاربرد جهانی آن‌ها متمرکز است. در اروپا ترم clinical اغلب به مطالعات کلینیکی داروها تحت شرایط سختگیرانه اشاره دارد، بنابراین واژه‌ی Medical Laboratory به‌عوض واژه‌ی Clinical Laboratory به‌کار می‌رود.
تعاریف اصطلاحات
Biosafety Level (BSL): وضعیت و سطح ایمنی آزمایشگاه که به‌وسیله‌ی ارزیابی خطر بیماری‌زایی عامل، شیوه و روش انتقال، مقدار عاملی که بکار برده می‌شود و ماهیت و طبیعت کاری که انجام می‌شود تعیین می‌شود. در ایالات متحده و اروپا آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی و بیومدیکال از این نظر در 4 سطح قرار می‌گیرند (BSL-1 ,BSL-2 ,BSL-3 ,BSL-4)
Blastoconidium (pl. Blastoconidia): یک کنیدی که به‌وسیله‌ی جوانه زدن از یک سلول مخمری، یا سلول سودوهایفال و یا سلول‌هایفال تشکیل می‌شود.
Capsule: یک ماده‌ی موکوپلی‌ساکاریدی که سلول را احاطه می‌کند.
Chancre: زخمی که در محل اولیه‌ی ورود پاتوژن ایجاد می‌گردد.
Chromoblastomycosis: عفونت جلدی یا زیرجلدی که به‌وسیله‌ی قارچ‌های پیگمانته (مانند فیالوفورا و فونسکا) ایجاد می‌شود و به‌وسیله‌ی حضور سلول‌های اسکلروتیک دیماتیاسئوس (فئوئید) مشخص می‌شود.
Coenocytic: هایفی‌هایی که فاقد دیواره‌ای (عرضی) هستند. این دیواره‌ها، سلول‌ها را از یکدیگر جدا می‌کنند.
Coin lesion: یک ضایعه‌ی ریوی آهکی‌شده با حد و مرز مشخص و واضح (well-circumscribed) مشابه سایه‌ی یک سکه در پرتونگاری اشعه ایکس
Conidium (pl. Conidia): یک ساختمان تولیدمثلی غیرجنسی که در اطراف یا انتهای هایفی یا کونیدیوفور تشکیل می‌شود.
Dematiaceous (Phaeoid): قارچ‌هایی که به‌علت حضور ملانین دارای کنیدی، اسپور یا هایفی به رنگ قهوه‌ای تا سیاه دیده می‌شوند.
Dermatophyte: قارچ‌هایی که مواد غذایی خود را از کراتین بدست می‌آورند و پوست، مو و ناخن‌ها را دچار عفونت می‌کنند. شامل گونه‌هایی از جنس‌های میکروسپوروم، تریکوفیتون و اپیدرموفیتون می‌باشند.
Dichotomous: انشعاب با زاویه‌ی حاد بطوریکه 2 شاخه‌ی مساوی ایجاد می‌کند.
Dimorphic: دارای دو فرم مرفولوژیکی مختلف
Endemic: محدودشده به یک ناحیه‌ی جغرافیائی خاص
Endospore: اسپوری که در داخل یک اسفرول تولید شده است.
Exudate: تجمع یک مایع که دارای غلظت بالایی از پروتئین در یک حفره از بدن است و به‌وسیله‌ی افزایش نفوذپذیری مویرگی ایجاد می‌شود و معمولاً ثانوی به التهاب است.
Fastidious: ارگانیسمی که برای رشد به موقعیت و وضعیت ویژه‌ای نیاز دارد.
Granuloma: یک پاسخ التهابی مزمن بافتی که به‌وسیله‌ی حضور هیستوسیت‌های فعال و احتمالاً سلول‌های غول‌آسا مشخص می‌شود.
Grind: هموژنیزه کردن به‌وسیله عمل سایش (friction). به‌عنوان مثال به‌وسیله‌ی یک mortar استریل و pestle یا به‌وسیله‌ی چرخ‌گوشت (Tissue Grinder)
Hemogenize: نمونه‌ی بیمار را به اندازه‌های کوچک و یک‌شکل (یونیفرم) در یک محلول درآوردن
Hypha (pl. hyphae): یک رشته‌ی قارچی که دارای دیواره عرضی (septate) و یا فاقد آن (aseptate) است.
Kerion: یک التهاب شدید پوسچولار که فولیکول‌های مو را درگیر می‌کند.
Mince/Mincing: بریدن و جدا کردن به قطعات خیلی کوچک، معمولاً با استفاده از یک اسکالپل استریل انجام می‌شود.
Moniliform: دارای انقباض (constrictions) مشابه یک رشته از مهره‌ها یا bead-like swelling
Mucoraceous: کپک‌های راسته‌ی موکورال‌ها (مانند رایزوپوس و موکور)
Muriform: دارای سپتای افقی و عمودی
Phialide: یک ساختمان فلاسک شکل یا گلدان شکل که از آن‌ها کنیدی‌ها خارج می‌شوند.
Propagule: یک واحد اختصاصی (انفرادی) که می‌تواند به تشکیل کلنی منجر شود.
Pseudohyphae: یک سری از بلاستوکونیدی‌ها که در اتصال با یکدیگر باقی می‌مانند و تشکیل یک رشته‌ی شبیه هایفا را می‌دهند.
Sclerotic bodies: سلول‌های با دیواره‌ی ضخیم، دیماتیاسئوس (فئوئید)، توتی شکل (muriform) و گرد که در بافت مشاهده می‌شوند و برای کروموبلاستومایکوزیس ارزش تشخیصی دارند.
Septate: هایفی‌های دارای دیواره عرضی
Spherule: یک ساختمان گرد که محتوی اندوسپور است و مشخصه‌ی گونه‌های کوکسیدیوئیدس در بافت میزبان است.
Spore: یک واحد اختصاصی (propagule) تولیدمثل جنسی یا غیرجنسی که به‌وسیله‌ی شکاف (cleavage) سیتوپلاسم ایجاد شده است.
Vesicle: تورم انتهایی کونیدیوفور
Wood’s lamp: یک لامپ اولتراویوله که برای آشکار کردن فلئورسنس منتشرشده به‌وسیله‌ی پوست عفونی‌شده با برخی قارچ‌ها استفاده می‌شود.
Zygospore: یک اسپور قارچ‌های موکوراسئوس که به‌وسیله‌ی اتحاد دو سلول جنسی مشابه پدید می‌آید.
3.2: واژه‌ها و اصطلاحات توصیفی برای کلنی کپک‌ها و مترادف‌های آن‌ها
| واژه‌های توصیفی (کپک‌ها) | مترادف‌ها (Synonyms) | معانی فارسی |
| Floccose | Fluffy | نرم و پف‌کرده، کُرک‌سان، پُرزسان |
| Globose | Round | گرد، کروی |
| Hyaline | Clear, Colorless, or Transparent | شفاف، بیرنگ |
| Pyriform | Pear-shaped | گلابی‌شکل |
| Verrucose | Warty | زگیل‌دار، پر از زگیل |
4- ایمنی زیستی
روش‌ها و سیاست‌های مربوط به ایمنی زیستی در آزمایشگاه‌های پزشکی بر اساس دستورالعمل‌های ملی نظیر Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories در ایالات متحده آمریکا و Laboratory Biosafety Guidelines در کانادا انجام می‌گیرد. کشورهایی که فاقد ساماندهی و نظارت ملی هستند از دستورالعمل‌های کشورهای دیگر و یا دستورالعمل‌هایی که مربوط به سازمان بهداشت جهانی است (Laboratory Biosafety Manual) استفاده می‌کنند. تمامی این اسناد بر روی تجهیزات و امکانات اولیه‌ی محدودسازی بیولوژیکی توافق دارند. برخی نیز منابع خوبی از اطلاعات مرتبط با سطوح ایمنی زیستی و توصیه‌های عملی مربوط به کار با قارچ‌ها را فراهم کرده‌اند. از نظر تاریخی چنین اطلاعاتی جنبه‌ی توصیه‌ای دارند.
اقدامات احتیاطی ایمنی زیستی استاندارد باید همیشه در آزمایشگاه قارچ‌شناسی مورد استفاده قرار گیرند. به‌طور کلی فرم‌های مخمری خطر عفونت را از طریق تلقیح جلدی بدنبال حوادث مربوط به سوراخ کردن پوست از طریق یک زخم باز و یا از طریق مواجهه‌ی غشاءهای مخاطی فراهم می‌کنند. کپک‌ها به‌عنوان یک خطر اضافی مطرح هستند، زیرا برخی از آن‌ها کنیدی‌هایی تولید می‌کنند که از طریق راه تنفسی می‌توانند عفونت‌زا باشند. این امکان در ترکیب با خطر آلودگی آزمایشگاهی مربوط به کنیدی‌های آئروسل‌شده موجب می‌شود که کپک‌ها اهمیت پزشکی بالقوه‌ای داشته باشند و بنابراین هیچگاه نباید به‌صورت معمولی (بدون استفاده از هود بیولوژیک مناسب) مورد دستکاری قرار گیرند.
تمام اقــدامات آزمایشــــــگاهی مربوط به کپــــک‌ها باید با استفاده از هود بیولوژیک مناسب (Biological Safety Cabinet) انجام گیرند. برای عملیات تشخیص آزمایشگاهی، هود کلاس 2 (Biosafety Level 2) مناسب است. علاوه بر این، جریان هوای آزمایشگاه باید طوری تنظیم شود که حرکت هوا از مناطق با آلودگی کمتر به سمت مناطق با پتانسیل زیادتر آلودگی حرکت داشته باشد.
آزمایشگاه‌های BSL-2 که از اقدامات احتیاطی BSL-3 استفاده می‌کنند برای جداسازی و شناسایی قارچ‌هایی نظیر گونه‌های کوکسیدیوئیدس، گونه‌های هیستوپلاسما، بلاستومایسس درماتیتیدیس، پاراکوکسیدیوئیدس برازیلینسیس، کلادوفیالوفورا بانتیانا، پنی‌سیلیوم مارنفئی و رینوکلادیلا مک‌گنزی که از نمونه‌های بیماران جدا می‌شوند مناسب است. هرچند که هرگونه اقدامات فراتر از تست‌های تشخیصی مانند تکثیر و انتشار حجم زیاد قارچ‌ها یا مطالعات بر روی حیوانات آزمایشگاهی باید در شرایط BSL-3 و به همراه اقدامات حفاظت از دستگاه تنفسی و کنترل و دسترسی سختگیرانه به اتاق کار مربوطه انجام گیرد.
4.1- ارزیابی خطر
مسئول آزمایشگاه و سوپروایزر در انتخاب و بکار گرفتن روش‌های ایمنی زیستی که بر اساس ارزیابی خطر در مؤسسه‌ی موردنظر پایه‌گذاری شده باشد، نقش مهمی دارند. این روش‌ها برای محافظت از پرسنل آزمایشگاه، مردم و بیماران کاربرد دارند. متناسب با گستره‌ی کار آزمایشگاهی و ماهیت نمونه‌هایی که مورد عمل قرار می‌گیرند، ارزیابی خطر انجام می‌گیرد. روش‌های اختصاصی برای آزمایشگاه‌های مختلف بسته به امکانات قابل دسترس، پرسنل کارآزموده و باتجربه و قوانین و مقررات محلی ممکن است با یکدیگر تفاوت داشته باشند.
جدول 1: ارزیابی ریسک برای آزمایش‌های میکروسکپی و کشت قارچ‌ها (به‌عنوان مثال)
| روش | پتانسیل آئروسل شدن | BSL | تجهیزات حفاظت پرسنلی | محل و شرایط انجام تست | روش‌های اختصاصی یا تجهیزات |
| باز کردن ظروف محتوی نمونه و کشت نمونه‌های بالینی | متوسط | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش
|
استفاده از هود بیولوژیک | به‌صورت چشمی برای هرگونه نشتی و ترک و شکستگی در ظرف نمونه قبل از باز کردن کیسه‌ی محافظ حاوی نمونه، چک شود. درب پلیت‌های کشت را سیل کنید. |
| تهیه اسلاید برای آزمایش میکروسکپی نمونه‌ها | متوسط | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش | استفاده از هود بیولوژیک | در صورت امکان استفاده از وسایل یکبار مصرف (مانند لوپ، چوبک، پیپت‌ها) |
| بررسی آزمایش مستقیم | کم | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش | قابل انجام بر روی میز | – |
| انتقال و انکوباسیون پلیت‌های کشت | کم | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش | از ظروف بسته و ایمن برای انتقال بین اتاق‌ها استفاده شود | – |
| بررسی و آزمایش کشت‌ها (در پلیت‌های بسته) | کم | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش | قابل انجام بر روی میز | برای اجتناب از سقوط یا شکستن پلیت‌ها دقت کافی مبذول نمایید. از ظروف محافظ یا سینی برای جلوگیری از افتادن و ریختن استفاده شود. |
| بررسی و آزمایش کشت‌ها (پلیت‌های بازشده) | متوسط/ زیاد | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش | مخمرهای شناخته‌شده را بر روی میز می‌توان آزمایش کرد، کپک‌های مشکوک فقط در زیر هود بیولوژیک قابل آزمایش هستند. | |
| از بین بردن کشت‌های قارچ | کم | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، دستکش | در صورت امکان، قبل از حذف کردن اتوکلاو شوند. | کشت‌ها را به‌عنوان مواد خطرناک زیستی دور بریزید. روش‌ها و مقررات قابل دسترس ملی و محلی را پیگیری کنید. |
| اتوکلاو کردن کشت‌ها و دور ریختن | کم | BSL-2 | روپوش آزمایشگاهی، سپر و حافظ صورت، دستکش‌های عایق و مقاوم به حرارت برای کار کردن با اتوکلاو | – | اتوکلاو را از نظر حرارت و زمان عملکردی مناسب با استفاده از اندیکاتورهای بیولوژیک مورد پایش قرار دهید. |
4.2– امکانات
آزمایشگاه‌هایی که با قارچ‌های پاتوژن فرصت‌طلب کار می‌کنند نیاز به تجهیزات و امکانات متفاوتی نسبت به مراکزی دارند که خدمات وسیع‌تری را در رابطه با پاتوژن‌های بسیار عفونی انجام می‌دهند. خطر زیستی مرتبط با کار کردن با نمونه‌های تشخیصی اغلب ناشناخته است و امکانات موردنیاز برای پروسس کردن چنین موادی برحسب اینکه آیا تست در بالین بیمار انجام می‌شود یا در یک آزمایشگاه مجهز فرق می‌کند. در نهایت، این مسئول آزمایشگاه است که برای ارزیابی ریسک و به‌کارگیری روش‌های ایمن وارد عمل می‌شود. به‌طور کلی اقدامات احتیاطی محدودسازی در سطح BSL-2 با استفاده از هود بیولوژیک کلاس II در مورد نمونه‌های قارچی کلینیکال که احتمال پخش و انتشار آئروسل‌های عفونی را دارند، باید افزایش یابد. هدف از به‌کارگیری هود بیولوژیک کلاس II سه مطلب زیر است:
1- حفاظت از نمونه‌ها از آلودگی‌های منتقله از راه هوا،
2- حفاظت از کارکنان از مواجهه با پاتوژن‌های منتقله از راه هوایی و
3- حفاظت از محیط کار از آزاد و رها شدن میکروب‌ها
برای انجام کارهای آزمایشگاهی فراتر از تست‌های روتین تشخیصی و کار کردن با کشت‌های قارچی که پتانسیل انتقال آئروسل را دارند، اقدامات پیشگیرانه‌ی BSL-3 توصیه می‌شود. این عوامل پتانسیلِ خطر برای عواقب و پیامدهای جدی و مهلک را دارند و شامل Coccidioidesimmitis /posadasii و هیستوپلاسما کپسولاتوم می‌باشند. هرچند که جنس‌ها و گونه‌های کپکی دیگری نظیر C. bantiana, R. mackenziei, B. dermatitidis, P. brasiliensis, P. marneffei Ochroconisgallopavum و فرم‌های بازیدیوسپور C. gattii و C. neoformans نیز به توجه زیاد و اقدامات پیشگیرانه و محدودسازی‌های دقیق نیاز دارند. در غیاب هود بیولوژیک کلاس II هرگونه کشت اولیه که حاوی ارگانیسم‌های زنده است برای انجام کارهای بعدی و شناسایی باید به یک آزمایشگاه رفرانس مناسب ارجاع داده شود.
پاسخ سیستم ایمنی در برابر قارچ‌ها (1)
آزمایشگاه تشخیص پزشکی و قارچ‌شناسی کلینیکی (1)
برای دانلود پی دی اف بر روی لینک زیر کلیک کنید
ورود / ثبت نام